本發(fā)明涉及一種細(xì)菌固定化方法。
背景技術(shù)：
：隨著連續(xù)發(fā)酵的研究及工業(yè)應(yīng)用進(jìn)程的快速發(fā)展，以固定化技術(shù)的出現(xiàn)作為分界線可劃分為游離細(xì)胞的連續(xù)發(fā)酵時(shí)期和固定化細(xì)胞的連續(xù)發(fā)酵時(shí)期。游離細(xì)胞的連續(xù)發(fā)酵體系由于游離細(xì)胞不斷隨發(fā)酵液排出系統(tǒng)，造成發(fā)酵罐中菌體濃度較低，使得發(fā)酵所需時(shí)間較長(zhǎng)，生產(chǎn)速度減慢。而使用固定化細(xì)胞進(jìn)行的連續(xù)發(fā)酵有效解決了游離細(xì)胞連續(xù)發(fā)酵過(guò)程中菌體濃度低、發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)、菌體易被沖走的缺點(diǎn)，從而提高了連續(xù)流系統(tǒng)中的菌體濃度。微生物固定化技術(shù)(ImmobilizedMicroorganismTechnology)是從20世紀(jì)60年代發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新技術(shù)。它是通過(guò)物理或化學(xué)手段，將游離細(xì)胞或酶定位在某一特定空間范圍內(nèi)，保留其固定的催化活性，且能夠被重復(fù)和連續(xù)使用的現(xiàn)代生物工程技術(shù)。微生物固定化技術(shù)可以大幅度地提高生物反應(yīng)器內(nèi)微生物量，增強(qiáng)其對(duì)不利環(huán)境或發(fā)酵抑制物的耐受程度。發(fā)酵細(xì)菌通過(guò)細(xì)胞固定化能夠使系統(tǒng)中的發(fā)酵菌體不易流失，保持活性高進(jìn)而提高耐受程度、生產(chǎn)速率、產(chǎn)品濃度等，既而提高生產(chǎn)效率和降低產(chǎn)品純化難度。微生物細(xì)胞的固定化方法包括吸附法、交聯(lián)法、包埋法和共價(jià)結(jié)合法。吸附法是利用吸附載體與微生物細(xì)胞之間的物理相互作用力將其吸附在載體表面。影響兩者之間吸附的主要因素是微生物細(xì)胞壁的組成，帶電性質(zhì)以及載體的組分，所以吸附法存在微生物細(xì)胞與載體結(jié)合不牢，容易脫落的缺點(diǎn)。共價(jià)結(jié)合法是細(xì)胞表面上功能團(tuán)和固相支持物表面的反應(yīng)基團(tuán)之間形成化學(xué)共價(jià)鍵鏈接，從而成為固定化細(xì)胞的方法，也存在著操作復(fù)雜，條件不易控制，活性損失較大等問(wèn)題。包埋法的原理是將微生物細(xì)胞截留在水不溶性的凝膠聚合物的網(wǎng)絡(luò)空間中，通過(guò)聚合作用、離子網(wǎng)絡(luò)、沉淀作用使細(xì)胞截留，盡管操作簡(jiǎn)便，但其機(jī)械強(qiáng)度低、使用壽命短、價(jià)格較為昂貴。交聯(lián)法又稱為無(wú)載體固定化方法，微生物細(xì)胞間依靠物理或化學(xué)的作用相互結(jié)合，盡管細(xì)胞固定化效果好，但該法操作較復(fù)雜，受限于交聯(lián)劑價(jià)格昂?，F(xiàn)有的交聯(lián)固定化方法的菌體包埋量較低，細(xì)菌固定化顆粒的穩(wěn)定性差，連續(xù)反應(yīng)系統(tǒng)難以長(zhǎng)期運(yùn)行。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明是要解決現(xiàn)有方法中菌體包埋量較低，細(xì)菌固定化顆粒的穩(wěn)定性差，連續(xù)反應(yīng)系統(tǒng)難以長(zhǎng)期運(yùn)行的問(wèn)題，提供一種實(shí)驗(yàn)室用細(xì)菌固定化方法。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)室用細(xì)菌固定化方法，包括以下步驟：一、進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，使細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，得到菌液，以獲得足夠的菌體用于細(xì)菌固定化；二、將菌液在4℃，9000～12500rpm條件下離心，獲得用于固定化的菌體；三、將步驟二獲得的菌體用生理鹽水分散，然后加入聚乙烯醇溶液混合均勻，獲得PVA-菌體混合溶液；所述PVA-菌體混合溶液中菌體的量為15～20g/L，其中菌體的量為干重，所述PVA-菌體混合溶液中聚乙烯醇的濃度為8～12g/100mL；四、使用細(xì)菌固定化反應(yīng)裝置進(jìn)行反應(yīng)，向細(xì)菌固定化反應(yīng)裝置的玻璃瓶中加入PVA-菌體混合溶液，向細(xì)菌固定化反應(yīng)裝置的燒杯中加入硼酸-磷酸鹽交聯(lián)緩沖液，調(diào)節(jié)細(xì)菌固定化反應(yīng)裝置，使蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速為0.1～0.5rpm，磁力攪拌器的轉(zhuǎn)速控制在500～800rpm，進(jìn)行滴定，滴定結(jié)束后，繼續(xù)在攪拌的情況下反應(yīng)4～12小時(shí)成型，得到細(xì)菌固定化顆粒；五、將步驟四得到的細(xì)菌固定化顆粒放入4℃冰水中，靜置3天，使顆粒成型穩(wěn)定，即完成；其中步驟四所述細(xì)菌固定化反應(yīng)裝置包括磁力攪拌器、燒杯、蠕動(dòng)泵、蠕動(dòng)泵軟管、玻璃瓶、支架、夾子和移液器槍頭，所述燒杯放置在磁力攪拌器上，所述移液器槍頭通過(guò)夾子固定在支架上，所述移液器槍頭的滴液口一端向下，并位于燒杯的正上方，所述移液器槍頭的另一端通過(guò)蠕動(dòng)泵軟管與蠕動(dòng)泵的出液口連接，蠕動(dòng)泵的進(jìn)液口通過(guò)蠕動(dòng)泵軟管與玻璃瓶連接，所述玻璃瓶口處設(shè)有空氣過(guò)濾膜。進(jìn)一步的，步驟一所述細(xì)菌為丙酮丁醇梭菌Clostrdiumacetobutylicum、巴西弧菌Vibriobrasiliensis、干酪乳桿菌Lactobacilluscasei、大腸桿菌Escherichiacoli、釀酒酵母Saccharomycescerevisiae等，但并不局限于這些細(xì)菌。進(jìn)一步的，步驟三中所述聚乙烯醇為片狀，低堿醇解型，聚合度為1700～2000，分子量為75000～88000g/mol，醇解度為99mol％。進(jìn)一步的，步驟四中硼酸-磷酸鹽交聯(lián)緩沖液的配方為：硼酸70g/L，磷酸二氫鈉0.4mol/L，磷酸氫二鈉0.1mol/L。本發(fā)明的原理：硼酸水解成B(OH)4-與聚乙烯醇(PVA)表面的羥基反應(yīng)生成硼酸酯穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，當(dāng)PVA與一定濃度的菌液混合后，細(xì)菌可以被固定在硼酸酯結(jié)構(gòu)中，進(jìn)而形成細(xì)菌固定化顆粒。本發(fā)明使用細(xì)菌固定化反應(yīng)裝置進(jìn)行細(xì)菌的固定化，具體是通過(guò)蠕動(dòng)泵把PVA-菌體的混合液抽出來(lái)，通過(guò)移液槍的槍頭一滴一滴的滴到硼酸-磷酸鹽交聯(lián)緩沖液中進(jìn)行交聯(lián)，同時(shí)硼酸-磷酸鹽交聯(lián)緩沖液不斷進(jìn)行磁力攪拌，使滴入的PVA-菌體混合液在水力剪切作用下形成小球。本發(fā)明的有益效果：通過(guò)本發(fā)明中的細(xì)菌固定化反應(yīng)裝置，可以克服注射器滴定的人為性，操作簡(jiǎn)便，可以調(diào)整包埋顆粒的大小。該固定化方法適用于多種發(fā)酵細(xì)菌，是一種適合于實(shí)驗(yàn)室操作的細(xì)菌固定化方法。1、本方法制備的固定化顆粒穩(wěn)定性好，此細(xì)菌固定化顆粒用于連續(xù)發(fā)酵系統(tǒng)時(shí)，系統(tǒng)可以穩(wěn)定至少2個(gè)月。2、本發(fā)明僅使用一次交聯(lián)，減少交聯(lián)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)占用的空間，制備的固定化菌體顆粒無(wú)需洗滌，從冰水中取出后即可直接使用，方法簡(jiǎn)單，容易操作。3、現(xiàn)有的使用硼酸和PVA交聯(lián)進(jìn)行菌體固定化方法，其包埋量?jī)H為4g/L左右，無(wú)法包埋過(guò)多的菌體。本發(fā)明方法顯著提高了固定化顆粒中菌體的包埋量，可達(dá)到15～20g/L，而且能夠很好的成型，不破裂、不粘連。4、本發(fā)明使用硼酸-磷酸鹽交聯(lián)緩沖液與PVA進(jìn)行交聯(lián)，硼酸磷酸鹽緩沖溶液的pH值大約為5.5，使用磷酸調(diào)節(jié)pH值，不會(huì)對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生毒性作用。5、本發(fā)明可以通過(guò)更換移液器的型號(hào)，調(diào)整制備的顆粒的粒徑大小。制備的細(xì)菌固定化顆粒的成型效果好，粒徑均一，不粘連，成球性較好。6、使用本方法固定化后的菌體顆粒，經(jīng)活化后菌體成活率高，菌體功能也顯著提升，固定化細(xì)胞的碳源利用率與蛋白質(zhì)類物質(zhì)的產(chǎn)量提高。其中固定化后，巴西弧菌H115的殺藻能力明顯提高，丁醇生產(chǎn)菌株的碳源利用率明顯提高。7、本方法中所用聚乙烯醇的型號(hào)不同，效果也有所不同。其中1799L型PVA與2099L型PVA成型較好，顆粒穩(wěn)定無(wú)交聯(lián)過(guò)度的情況，且成球性較好。當(dāng)PVA的聚合度大于2000后，交聯(lián)后的顆粒成球性變差，彈性差且顆粒扁平，影響后續(xù)菌體的包埋與固定化顆粒的傳質(zhì)性能。附圖說(shuō)明圖1為本發(fā)明中細(xì)菌固定化反應(yīng)裝置的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為聚乙烯醇型號(hào)對(duì)固定化顆粒制備效果的影響；圖3為固定化細(xì)胞與懸浮細(xì)胞殺藻效果的比較。具體實(shí)施方式本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式，還包括各具體實(shí)施方式間的任意組合。具體實(shí)施方式一：結(jié)合圖1說(shuō)明本實(shí)施方式，本實(shí)施方式實(shí)驗(yàn)室用細(xì)菌固定化方法，包括以下步驟：一、進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，使細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，得到菌液；二、將菌液在4℃，9000～12500rpm條件下離心，獲得用于固定化的菌體；三、將步驟二獲得的菌體用生理鹽水分散，然后加入聚乙烯醇溶液混合均勻，獲得PVA-菌體混合溶液；所述PVA-菌體混合溶液中菌體的量為15～20g/L，其中菌體的量為干重，所述PVA-菌體混合溶液中聚乙烯醇的濃度為8～12g/100mL；四、使用細(xì)菌固定化反應(yīng)裝置進(jìn)行反應(yīng)，向細(xì)菌固定化反應(yīng)裝置的玻璃瓶7中加入PVA-菌體混合溶液，向細(xì)菌固定化反應(yīng)裝置的燒杯2中加入硼酸-磷酸鹽交聯(lián)緩沖液，調(diào)節(jié)細(xì)菌固定化反應(yīng)裝置，使蠕動(dòng)泵3轉(zhuǎn)速為0.1～0.5rpm，磁力攪拌器1的轉(zhuǎn)速控制在500～800rpm，進(jìn)行滴定，滴定結(jié)束后，繼續(xù)在攪拌的情況下反應(yīng)4～12小時(shí)成型，得到細(xì)菌固定化顆粒；五、將步驟四得到的細(xì)菌固定化顆粒放入4℃冰水中，靜置3～4天，即完成；其中步驟四所述細(xì)菌固定化反應(yīng)裝置包括磁力攪拌器1、燒杯2、蠕動(dòng)泵3、蠕動(dòng)泵軟管9、玻璃瓶7、支架4、夾子5和移液器槍頭6，所述燒杯2放置在磁力攪拌器1上，所述移液器槍頭6通過(guò)夾子5固定在支架4上，所述移液器槍頭6的滴液口一端豎直向下，并位于燒杯2的正上方，所述移液器槍頭6的另一端通過(guò)蠕動(dòng)泵軟管9與蠕動(dòng)泵3的出液口連接，蠕動(dòng)泵3的進(jìn)液口通過(guò)蠕動(dòng)泵軟管9與玻璃瓶7連接，所述玻璃瓶7瓶口處設(shè)有空氣過(guò)濾膜8。本實(shí)施方式步驟四中PVA-細(xì)菌混合液的滴定速度為0.067～0.33mL/min，使用16#泵管。具體實(shí)施方式二：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一不同的是：步驟一所述細(xì)菌為丙酮丁醇梭菌Clostrdiumacetobutylicum、巴西弧菌Vibriobrasiliensis、干酪乳桿菌Lactobacilluscasei、大腸桿菌Escherichiacoli或釀酒酵母Saccharomycescerevisiae。其它與具體實(shí)施方式一相同。具體實(shí)施方式三：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一或二不同的是：步驟二中將菌液在4℃，10000～11000rpm條件下離心。其它與具體實(shí)施方式一或二相同。具體實(shí)施方式四：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一至三之一不同的是：步驟三中所述聚乙烯醇為片狀，低堿醇解型，聚合度為1700～2000，分子量為75000～88000g/mol，醇解度為99mol％。其它與具體實(shí)施方式一至三之一相同。具體實(shí)施方式五：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一至四之一不同的是：步驟四中硼酸-磷酸鹽交聯(lián)緩沖液的配方為：硼酸70g/L，磷酸二氫鈉0.4mol/L，磷酸氫二鈉0.1mol/L。其它與具體實(shí)施方式一至四之一相同。具體實(shí)施方式六：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一至五之一不同的是：步驟四中蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速為0.2～0.4rpm。其它與具體實(shí)施方式一至五之一相同。具體實(shí)施方式七：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一至六之一不同的是：步驟四中磁力攪拌器的轉(zhuǎn)速控制在600～700rpm。其它與具體實(shí)施方式一至六之一相同。具體實(shí)施方式八：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一至七之一不同的是：步驟四中在攪拌的情況下反應(yīng)6～10小時(shí)成型。其它與具體實(shí)施方式一至七之一相同。下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例做詳細(xì)說(shuō)明，以下實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方案和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。實(shí)施例一：結(jié)合圖1說(shuō)明本實(shí)施例本實(shí)施例溶藻巴西弧菌VibriobrasiliensisH115的細(xì)菌固定化顆粒的制備方法如下：一、PVA溶液準(zhǔn)備：加入型號(hào)為1799L的片狀聚乙烯醇9.5g定容至80mL水中，121℃高溫反應(yīng)20min，使聚乙烯醇完全溶解。溶液在無(wú)菌環(huán)境下趁熱攪拌至冷卻，使PVA混合均勻，呈透明均勻略黏稠狀，得到聚乙烯醇溶液。二、硼酸-磷酸鹽交聯(lián)緩沖液配制：硼酸70g/L，磷酸二氫鈉0.4mol/L，磷酸氫二鈉0.1mol/L。若有晶體析出，則加熱使其完全溶解，冷卻至室溫使用。三、對(duì)巴西弧菌H115進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37℃，培養(yǎng)24h，搖床轉(zhuǎn)速200rpm，得到巴西弧菌H115菌液，以獲得足夠的菌體用于細(xì)菌固定化。四、包埋菌體準(zhǔn)備：將巴西弧菌H115菌液在4℃，9000rpm條件下離心，獲得用于固定化的菌體。五、細(xì)菌固定化顆粒制備：將步驟四獲得的菌體用20mL生理鹽水分散，然后加入聚乙烯醇溶液混合均勻，獲得PVA-菌體混合溶液；所述PVA-菌體混合溶液中菌體的量為20g/L，其中菌體的量為干重，所述PVA-菌體混合溶液中聚乙烯醇的濃度為9g/100mL；六、使用細(xì)菌固定化反應(yīng)裝置進(jìn)行反應(yīng)，向細(xì)菌固定化反應(yīng)裝置的玻璃瓶7中加入PVA-菌體混合溶液，向細(xì)菌固定化反應(yīng)裝置的燒杯2中加入硼酸-磷酸鹽交聯(lián)緩沖液，調(diào)節(jié)細(xì)菌固定化反應(yīng)裝置，使蠕動(dòng)泵3轉(zhuǎn)速為0.2rpm，磁力攪拌器1的轉(zhuǎn)速控制在600rpm，進(jìn)行滴定，滴定結(jié)束后，繼續(xù)在攪拌的情況下反應(yīng)10小時(shí)成型，得到細(xì)菌固定化顆粒；七、將步驟四得到的細(xì)菌固定化顆粒放入4℃冰水中，靜置3天，使顆粒成型穩(wěn)定，即完成；其中步驟四所述細(xì)菌固定化反應(yīng)裝置包括磁力攪拌器1、燒杯2、蠕動(dòng)泵3、蠕動(dòng)泵軟管9、玻璃瓶7、支架4、夾子5和移液器槍頭6，所述燒杯2放置在磁力攪拌器1上，所述移液器槍頭6通過(guò)夾子5固定在支架4上，所述移液器槍頭6的滴液口一端向下，并位于燒杯2的正上方，所述移液器槍頭6的另一端通過(guò)蠕動(dòng)泵軟管9與蠕動(dòng)泵3的出液口連接，蠕動(dòng)泵3的進(jìn)液口通過(guò)蠕動(dòng)泵軟管9與玻璃瓶7連接，所述玻璃瓶7瓶口處設(shè)有空氣過(guò)濾膜8。所述玻璃瓶7為血清瓶。八、細(xì)菌固定化顆?；罨簩?℃冰水中放置3天的細(xì)菌固定化顆粒轉(zhuǎn)入200mLW1培養(yǎng)基(具體成分見表1)中進(jìn)行活化，定期檢測(cè)發(fā)酵液pH、碳源利用率、產(chǎn)物及殺藻率。九、連續(xù)/半連續(xù)培養(yǎng)：將活化后的細(xì)菌固定化顆粒轉(zhuǎn)接至連續(xù)/半連續(xù)發(fā)酵反應(yīng)器中，進(jìn)行殺藻物質(zhì)的生產(chǎn)。本實(shí)施例所述巴西弧菌H115(VibriobrasiliensisLMG20546)已經(jīng)在專利文件中公開，保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCCNO：M2015093。經(jīng)過(guò)本方法制備的固定化細(xì)胞的碳源利用率與蛋白質(zhì)類物質(zhì)生產(chǎn)情況均高于非固定化細(xì)胞(表2)，其中蛋白質(zhì)類物質(zhì)的產(chǎn)量是非固定化細(xì)胞蛋白質(zhì)類物質(zhì)產(chǎn)量的6倍。同時(shí)，固定化細(xì)胞所生產(chǎn)的發(fā)酵液的殺藻能力明顯高于非固定化細(xì)胞所生產(chǎn)的發(fā)酵液。固定化細(xì)胞與懸浮細(xì)胞殺藻效果的比較結(jié)果如圖3所示，圖3中表示固定化細(xì)胞，■表示懸浮細(xì)胞。固定化細(xì)胞生產(chǎn)的發(fā)酵液預(yù)達(dá)到100％的殺藻效果，添加量?jī)H為0.3％(v/v)；而非固定化細(xì)胞生產(chǎn)的發(fā)酵液預(yù)達(dá)到100％的殺藻效果，其添加量需要6％(v/v)，即固定化細(xì)胞生產(chǎn)的發(fā)酵液的殺藻能力是非固定化細(xì)胞生產(chǎn)的發(fā)酵液的20倍。實(shí)施例二：本實(shí)施例丁醇生產(chǎn)菌株的細(xì)菌固定化顆粒的制備方法如下：對(duì)丁醇生產(chǎn)菌株ClostridiumacetobutylicumATCC824進(jìn)行細(xì)菌固定化，方法步驟及參數(shù)與實(shí)施例一相同。并將固定化顆粒用于連續(xù)丁醇生產(chǎn)系統(tǒng)，結(jié)果如表3所示。當(dāng)連續(xù)丁醇生產(chǎn)系統(tǒng)的水力停留時(shí)間(HRT)為12h時(shí)，固定化細(xì)胞的丁醇生產(chǎn)速率為0.51±0.04g/L/h，是非固定化細(xì)胞的1.6倍；固定化細(xì)胞的丁醇產(chǎn)量為6.11±0.47g/L，比非固定化細(xì)胞丁醇產(chǎn)量高出2.21g/L；同時(shí)固定化細(xì)胞的碳源利用率比非固定化細(xì)胞高出25.9％。實(shí)施例三：聚乙烯醇型號(hào)對(duì)固定化顆粒制備效果的影響：采用實(shí)施例一的方法，比較1799LPVA、2099LPVA以及2499LPVA三種不同型號(hào)的聚乙烯醇對(duì)固定化顆粒制備效果的影響，其中L代表低堿醇解性PVA，醇解度為99mol％，其聚合度分別為1700、2000、2400，分子量分別為75000、88000、106000g/mol。固定化顆粒制備過(guò)程中控制PVA滴加速度一定、磁力攪拌器轉(zhuǎn)速一定、且滴定高度相同，結(jié)果如圖2所示，1799L型PVA與2099L型PVA成型較好，顆粒穩(wěn)定無(wú)交聯(lián)過(guò)度的情況，且成球性較好。當(dāng)PVA的聚合度大于2000后(2499LPVA交聯(lián)結(jié)果為例)，交聯(lián)后的顆粒成球性變差，彈性差且顆粒扁平，影響后續(xù)菌體的包埋與固定化顆粒的傳質(zhì)性能。表1W1培養(yǎng)基組成成份濃度(g/L)蛋白胨7酵母提取物4葡萄糖0.5硫酸鎂0.2氯化鈣0.2硫酸亞鐵0.004氯化鉀0.1高磷酸鐵0.1磷酸氫二鉀0.1磷酸二氫鉀0.1硫酸鈉18.75氯化鈉18.25表2固定化細(xì)胞與非固定化細(xì)胞碳源利用與生產(chǎn)能力的比較pH碳源利用率(％)蛋白質(zhì)產(chǎn)量(mg/L)固定化細(xì)胞8.15100178.43懸浮細(xì)胞7.1890.829.27表3懸浮細(xì)胞與固定化細(xì)胞對(duì)于丁醇濃度的影響表3中a：非固定化細(xì)胞，b：固定化細(xì)胞。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3