技術(shù)領(lǐng)域：
本文提供與原核苯丙氨酸解氨酶(PAL)變異體相關(guān)的組合物，包含優(yōu)化這類(lèi)組合物以提高原核PAL催化活性和/或穩(wěn)定性而降低原核PAL的免疫原性和/或蛋白水解敏感性。本文還提供原核PAL變異體的這類(lèi)最佳的組合物在治療方面(例如，治療高苯丙氨酸血癥(HPA)，其包含苯丙酮尿癥(PKU)；以及其他疾病，其包含癌癥)的用途。發(fā)明背景苯丙氨酸解氨酶(PAL)是一種非哺乳類(lèi)酶，其廣泛分布于植物(Koukol,等人,J.Biol.Chem.236:2692-2698(1961)；Hanson,等人,TheEnzymes7:75-166(1972)；Poppe,等人,Curr.Org.Chem.7:1297-1315(2003))、一些真菌(Rao,等人,Can.J.Biochem.4512:1863-1872(1967)；Abell,等人,MethodsEnzymol.142:242-253(1987))和細(xì)菌(Bezanson,等人,Can.J.Microbiol.16:147-151(1970)；Xiang,等人,J.Biol.Chem.277:32505-32509(2002)；Hill,等人,Chem.Commun.1358-1359(2003))中以及可以在大腸桿菌中重組產(chǎn)生。來(lái)自?xún)煞N藍(lán)細(xì)菌菌株多變魚(yú)腥藻(Av)和點(diǎn)形念珠藻(Np)的PAL已被克隆并表達(dá)于細(xì)菌(例如大腸桿菌(E.coli))中，以及顯示，在活體外和活體內(nèi)具有PAL酶活性(見(jiàn)，例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)7,531,341；7,534,595；7,537,923；以及7,560,263)。聚乙二醇化的重組多變魚(yú)腥藻PAL(rAvPAL-PEG)也已產(chǎn)生，其中通過(guò)共價(jià)結(jié)合聚乙二醇(PEG)對(duì)rAvPAL蛋白質(zhì)衍生化，以延長(zhǎng)其半衰期以及優(yōu)化其藥代動(dòng)力學(xué)特性和/或降低其免疫原性(同上)。已顯示，rAvPAL-PEG可使苯丙氨酸產(chǎn)生代謝變化，以及正在將rAvPAL-PEG開(kāi)發(fā)作為酶替代療法(EST)用于與苯丙氨酸水平升高有關(guān)的患者紊亂或者疾病，例如HPA(包含PKU)以及用于癌癥療法(同上)。雖然PAL潛在地具有不同的治療應(yīng)用，但是降低的特異性活性以及蛋白水解不穩(wěn)定性可使得PAL的用途受限。跟其他治療性蛋白質(zhì)類(lèi)似，PAL用作酶療法伴隨著多個(gè)缺點(diǎn)，例如免疫原性和蛋白水解敏感性(見(jiàn)Vellard,Curr.Opin.Biotechnol.14:1-7(2003))。此外，在底物親和力和酶活性之間需要一種微妙的平衡，以實(shí)現(xiàn)和維持在以高苯丙氨酸血癥為特征的疾病中，將血漿苯丙氨酸水平控制在正常但有些窄的范圍內(nèi)。到目前為止，由于缺乏有關(guān)這種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和生化知識(shí)，尚未做出以改善這些參數(shù)為目的的協(xié)調(diào)一致的努力。因此，仍然需要具有最佳動(dòng)力學(xué)特征(包含強(qiáng)效的催化活性、較長(zhǎng)的生物半衰期、較大的生化穩(wěn)定性和/或減弱的免疫原性)的PAL分子，以用于治療用途，包括HPA(其包含PKU)以及其他疾病(包含癌癥)的治療。發(fā)明概述原核或者細(xì)菌PAL可以用來(lái)有效地治療HPA(包含PKU)以及其他疾病(包含癌癥)。本文提供具有改善屬性(例如更強(qiáng)效的催化活性、較大的生化穩(wěn)定性以及用于治療應(yīng)用時(shí)，具有減弱的免疫原性和/或較長(zhǎng)的生物半衰期)的原核PAL及其生物活性片段、突變體、變異體或類(lèi)似物的組合物。本文還提供藥物組合物和制劑，該藥物組合物和制劑包括原核PAL及其生物活性片段、突變體、變異體或類(lèi)似物以及藥學(xué)上可接受的載體(其可以包含防腐劑和/或穩(wěn)定劑)。本文還提供生產(chǎn)和純化原核PAL及其生物活性片段、突變體、變異體或類(lèi)似物的方法；以及將這類(lèi)組合物用于治療目的(包括治療HPA(包含PKU)以及其他疾病(包含癌癥))的方法。如本文所用，“細(xì)菌PAL”和“原核PAL”可互換使用，用來(lái)指(1)來(lái)自原核生物的野生型PAL，包含但不僅限于來(lái)自海洋鏈霉菌(也稱(chēng)為EncP,SEQIDNO:5，圖4)、點(diǎn)形念珠藻(SEQIDNO:2，圖4)、多變魚(yú)腥藻(SEQIDNO:4，圖4)、巢狀倒囊藻(Lofflehardt,Z.Naturforsch.31(11-12):693-9(1976))、發(fā)光光桿狀菌TT01(Williams,等人,Microbiology151:2543-2550(2005)和輪絲鏈霉菌(Bezanson,等人,Can.J.Microbiol.16(3):147-51(1970)的PAL；(2)保留類(lèi)似(即至少50％)的苯丙氨酸催化活性以及能夠，例如，顯示增加的催化活性、較大的生化穩(wěn)定性、延長(zhǎng)的半衰期和/或降低的免疫原性的這類(lèi)野生型PAL酶的片段、突變體、變異體或者類(lèi)似物；以及(3)連接至能提供其他有利的作用(例如，作為例子但不僅限于，延長(zhǎng)的半衰期和/或降低的免疫原性)的其他化學(xué)部分的這類(lèi)野生型PAL酶或其片段、突變體、變異體或類(lèi)似物的化學(xué)修飾形式。例如，任何提到生產(chǎn)原核PAL及其片段、突變體、變異體、類(lèi)似物或者化學(xué)修飾形式以及這類(lèi)酶的組合物，以及將所述原核PAL及其片段、突變體、變異體、類(lèi)似物或者化學(xué)修飾形式以及這類(lèi)酶的組合物用于治療目的的方法的文字意在指生產(chǎn)、利用或者配制所有這類(lèi)野生型原核PAL或者其片段、突變體、變異體、類(lèi)似物或者化學(xué)修飾的方法。在第一個(gè)方面，本文提供藥物組合物，該藥物組合物包括原核PAL及其生物活性片段、突變體、變異體或類(lèi)似物以及藥學(xué)上可接受的載體。一個(gè)實(shí)施方式是來(lái)自點(diǎn)形念珠藻(SEQIDNO:2)的原核PAL或者其生物活性片段、突變體、變異體或者類(lèi)似物。其他的實(shí)施方式是來(lái)自多變魚(yú)腥藻(SEQIDNO:4)的原核PAL或者其生物活性片段、突變體、變異體或者類(lèi)似物。本文還提供與野生型PAL相比，具有較大的苯丙氨酸轉(zhuǎn)化活性和/或降低的免疫原性的原核PAL變異體。在具體的實(shí)施方式中，該原核PAL變異體在對(duì)應(yīng)于來(lái)自圓紅冬孢酵母菌PAL的PAL(RtPAL)中的Ser210、Ala-Ser-Gly三聯(lián)體(211-213)、Asp214、Leu215、Asn270、Val269、Leu266、Leu134、His137、Lys468、Glu496、Gln500的位置保留野生型活性位點(diǎn)殘基或者這些活性位點(diǎn)殘基的保守性替換，其中211-213上的Ala-Ser-Gly三聯(lián)體被認(rèn)為是針對(duì)苯丙氨酸的結(jié)合位點(diǎn)。原核PAL變異體包括這樣的蛋白質(zhì)，其中一種或者多種氨基酸(例如半胱氨酸)殘基已被另一種氨基酸(例如絲氨酸)殘基取代，以減少蛋白質(zhì)聚集，所述蛋白質(zhì)聚集可與活體內(nèi)降低的酶活性、增加的免疫原性和/或其他不利的影響(例如降低的生物利用度)相關(guān)。本文提供一種藥物組合物，其中該原核PAL變異體的一種或者多種氨基酸殘基已被另一種氨基酸取代，其中與野生型PAL相比，所述取代提高了苯丙氨酸轉(zhuǎn)化活性和/或降低了免疫原性。在一些實(shí)施方式中，該原核PAL變異體的一種或者多種氨基酸殘基已被另一種氨基酸取代。在一些實(shí)施方式中，該原核PAL變異體的一種或者多種半胱氨酸殘基已被絲氨酸殘基取代。在某些實(shí)施方式中，該原核PAL變異體是多變魚(yú)腥藻PAL(AvPAL)。在其他的實(shí)施方式中，該AvPAL變異體的一種或者多種半胱氨酸殘基已被選自如下的絲氨酸殘基取代：位置64、318、503和565上的半胱氨酸殘基。在具體的實(shí)施方式中，該AvPAL變異體的位置565上的半胱氨酸殘基已被絲氨酸殘基取代。在某一實(shí)施方式中，該AvPAL變異體的位置503和565上的半胱氨酸殘基已被絲氨酸殘基取代。原核PAL變異體還可以包括融合蛋白質(zhì)，其中PAL酶已被融合至另一種異源性多肽，例如保留補(bǔ)救抗原表位(salvageepitope)的免疫球蛋白或者其片段的原生或者修飾的恒定區(qū)，如本領(lǐng)域已知，以延長(zhǎng)半衰期。本文還提供已被連接至提供其他有利影響的化學(xué)部分的這類(lèi)原核PAL多肽的化學(xué)修飾形式。例如，本領(lǐng)域已知，水溶性聚合物(例如聚乙二醇)到多肽的非特異性或者位點(diǎn)特異性(例如N末端)連接可改善半衰期，以及化學(xué)部分的連接還可降低免疫原性和/或改善蛋白酶抗性。在一些實(shí)施方式中，該原核PAL變異體包括水溶性聚合物。在某些實(shí)施方式中，該原核PAL變異體包括聚乙二醇。在其他的實(shí)施方式中，該原核PAL變異體是AvPAL以及AvPAL和聚乙二醇的比率為約1:3(1:3AvPAL：PEG)。在具體的實(shí)施方式中，該原核PAL變異體是AvPAL變異體，AvPAL變異體和聚乙二醇的比率為約1:3(1:3AvPAL：PEG)，以及該AvPAL變異體的位置503和565上的半胱氨酸殘基已被絲氨酸殘基取代。在一些實(shí)施方式中，該原核PAL變異體的一種或者多種氨基酸殘基已被賴(lài)氨酸殘基取代。原核PAL變異體中其他賴(lài)氨酸殘基的聚乙二醇化可以產(chǎn)生具有降低的免疫原性、增加的催化活性和/或改善的生化穩(wěn)定性的酶。不受限于特定的理論，假定原核PAL的活性位點(diǎn)上/附近的酪氨酸殘基(例如AvPAL中的位置78)可以是用于聚乙二醇化的位點(diǎn)，其降低了酶活性。在一個(gè)實(shí)施方式中，該原核PAL變異體的活性位點(diǎn)上/附近的不為酶活性所需的一種或者多種氨基酸由賴(lài)氨酸殘基取代。不受限于特定的理論，假定對(duì)活性位點(diǎn)上/附近的取代的賴(lài)氨酸殘基進(jìn)行聚乙二醇化具有空間位阻效應(yīng)，阻礙對(duì)酪氨酸殘基(例如AvPAL中的位置78)的聚乙二醇化。這類(lèi)原核PAL變異體根據(jù)本文提供的方法進(jìn)行分離和純化，因而其以使得能夠在治療上采用原核PAL酶的量而存在。在一些實(shí)施方式中，使用為精加工型或者野生型原核PAL編碼的cDNA。然而，在其他的實(shí)施方式中，可以使用為其生物活性片段、突變體、變異體或者類(lèi)似物編碼的cDNA。此外，本文提供通過(guò)基于結(jié)構(gòu)的分子工程方法獲得的優(yōu)化的原核PAL和/或PAL的化學(xué)修飾(例如聚乙二醇化)形式的組合物。具體的實(shí)施方式涉及適于治療用途的具有改善的特異性活性、提高的穩(wěn)定性、降低的免疫原性和/或蛋白水解敏感性的最佳的原核PAL組合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，PAL是具有改善的特異性活性、提高的穩(wěn)定性、降低的免疫原性和/或蛋白水解敏感性的聚乙二醇化形式的點(diǎn)形念珠藻PAL。在另一實(shí)施方式中，PAL是具有改善的特異性活性、提高的穩(wěn)定性、降低的免疫原性和/或蛋白水解敏感性的聚乙二醇化形式的多變魚(yú)腥藻PAL。在各種實(shí)施方式中，就PAL：PEG或者PEG：PAL的比率對(duì)PAL變異體的聚乙二醇化進(jìn)行描述。如本文所用，以及除非另行指明，“PAL：PEG”的比率指在聚乙二醇化反應(yīng)中PAL變異體上的賴(lài)氨酸殘基與PEG分子的比率。同樣地，如本文所用，以及除非另行指明，“PEG：PAL”的比率指在聚乙二醇化反應(yīng)中PEG分子與PAL變異體上的賴(lài)氨酸殘基的比率。在一個(gè)實(shí)施方式中，提供具有降低的免疫原性的聚乙二醇化的原核PAL變異體。另一實(shí)施方式是具有降低的免疫原性的聚乙二醇化形式的點(diǎn)形念珠藻PAL(NpPAL)變異體。仍然另一實(shí)施方式是具有降低的免疫原性的聚乙二醇化形式的AvPAL變異體。具體的實(shí)施方式涉及NpPAL或者AvPAL變異體，其中聚乙二醇化通過(guò)將NpPAL或者AvPAL變異體與水溶性聚合物(例如PEG)反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)。在一些實(shí)施方式中，聚乙二醇化通過(guò)將NpPAL或者AvPAL變異體與PEG以至少1:1、至少1:1.5、至少1:2、至少1:3或者至少1:4的PAL：PEG的比率反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)實(shí)施方式中，該原核PAL變異體是AvPAL變異體，以及該聚乙二醇化通過(guò)利用1:3的PAL：PEG比率來(lái)實(shí)現(xiàn)。在一些實(shí)施方式中，聚乙二醇化的原核PAL變異體是AvPAL變異體以及AvPAL的位置503和565上的半胱氨酸殘基已被絲氨酸殘基取代(SEQIDNO:11)。在一些實(shí)施方式中，對(duì)野生型原核PAL的生物活性位點(diǎn)進(jìn)行修飾，以?xún)?yōu)化PAL動(dòng)力學(xué)特性。在一個(gè)實(shí)施方式中，原核PAL變異體具有足夠的活性，以降低并且維持血漿苯丙氨酸水平在約120μM到約240μM的最佳范圍內(nèi)。在其他的實(shí)施方式中，生物活性的原核PAL變異體具有至少約0.1s-1或者大于約0.5s-1的kcat。在一些實(shí)施方式中，生物活性的原核PAL變異體具有至少約0.2s-1或者大于約1.0s-1的kcat。在其他的實(shí)施方式中，生物活性的原核PAL變異體具有約10μM至約1000μM之間的Km。在其他的實(shí)施方式中，生物活性的原核PAL變異體具有約100μM至約1000μM之間的Km。在一個(gè)實(shí)施方式中，生物活性的原核PAL變異體顯示出的酶催活性比野生型PAL的酶催活性大約2倍至約1000倍。在其他的實(shí)施方式中，生物活性的原核PAL變異體顯示出的酶催活性比野生型PAL的酶催活性高約10％至100％。這類(lèi)生物活性的原核PAL變異體可以利用本領(lǐng)域熟知的方法(例如通過(guò)定點(diǎn)誘變)形成。本文還提供使苯丙氨酸產(chǎn)生代謝變化(即，使苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為另一種物質(zhì))的原核PAL變異體或者其生物活性片段、突變體、變異體或者類(lèi)似物在制備用于治療哺乳動(dòng)物(例如人類(lèi))體內(nèi)PAH活性不足的藥劑以及在制備用于治療PAH活性不足的包含原核PAL變異體的藥物組合物方面的用途。在一些實(shí)施方式中，可以對(duì)野生型原核PAL的生物活性位點(diǎn)進(jìn)行修飾，以?xún)?yōu)化PAL動(dòng)力學(xué)特性。在一個(gè)實(shí)施方式中，原核PAL變異體具有足夠的活性，以利用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法將對(duì)象體內(nèi)的血漿苯丙氨酸水平降至從低于檢測(cè)水平到約20μM至60μM之間的范圍，例如小于約20μM或者小于約10μM。在其他的實(shí)施方式中，生物活性的原核PAL變異體具有至少約0.1s-1(例如大于約0.5s-1)以及大于約1.0s-1的kcat。在某些實(shí)施方式中，生物活性的原核PAL變異體具有至少約0.4s-1(例如大于約2.0s-1)或者大于約4.0s-1的kcat。在其他的實(shí)施方式中，生物活性的原核PAL變異體具有約10μM至約2000μM之間的Km。在某些實(shí)施方式中，生物活性的原核PAL變異體具有約10μM至約1000μM之間的Km。在其他的實(shí)施方式中，生物活性的原核PAL變異體具有約10μM至約500μM之間的Km。在仍然其他的實(shí)施方式中，生物活性的原核PAL變異體顯示出的酶催活性范圍從為野生型PAL的酶催活性的約至少50％到大于野生型PAL的酶催活性的約10倍。這類(lèi)生物活性原核PAL變異體可以利用本領(lǐng)域熟知的方法(例如通過(guò)定點(diǎn)誘變)形成。本文還提供使苯丙氨酸產(chǎn)生代謝變化(即，使苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為另一種物質(zhì))的原核PAL變異體或者其生物活性片段、突變體、變異體或者類(lèi)似物在制備用于預(yù)防或者治療對(duì)象(例如人類(lèi)對(duì)象)體內(nèi)癌癥的藥劑以及在制備用于預(yù)防或者治療對(duì)象(例如人類(lèi)對(duì)象)體內(nèi)癌癥的包含原核PAL變異體或者其生物活性片段、突變體、變異體或者類(lèi)似物的藥物組合物方面的用途。在一些實(shí)施方式中，該藥劑用于預(yù)防人類(lèi)對(duì)象體內(nèi)的癌癥。在一些實(shí)施方式中，該藥物組合物包括單獨(dú)或者結(jié)合有藥學(xué)上適合的載體的、衍生自細(xì)菌的高度純化的原核PAL變異體或者其生物活性片段、突變體或者類(lèi)似物。在一些實(shí)施方式中，制劑包含純度大于90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或者99.9％的原核PAL變異體。在其他的實(shí)施方式中，該原核PAL變異體的相對(duì)比活為野生型原核PAL的比活的至少約50％或者大于約110％。在第二個(gè)方面，本文提供將原核PAL組合物用于治療目的的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，本文提供通過(guò)向需要這類(lèi)治療的對(duì)象施用治療有效量的包括原核PAL變異體的藥物組合物來(lái)治療全部或者部分地由PAH活性不足導(dǎo)致的疾病的方法。PAH活性不足可以顯示為與正常水平的PAH活性相比，是50％或更低、25％或更低或者10％或更低或者1％或更低的活性水平，以及可以表現(xiàn)為例如，在高苯丙氨酸血癥、輕度苯丙酮尿癥或者典型重度苯丙酮尿癥中升高的苯丙氨酸水平。在一些實(shí)施方式中，該疾病為PKU。在具體的實(shí)施方式中，該對(duì)象是已被診斷具有突變苯丙氨酸羥化酶(mutantphenylalaninehydroxylase；突變PAH)者。該突變PAH可包括PAH催化區(qū)中的突變。示例性的這類(lèi)突變包括但不僅限于F39L、L48S、I65T、R68S、A104D、S110C、D129G、E178G、V190A、P211T、R241C、R261Q、A300S、L308F、A313T、K320N、A373T、V388ME390G、A395P、P407S和Y414C突變。還涉及一種治療血漿苯丙氨酸高于正常濃度(例如大于180μM或者360μM)的對(duì)象的方法，該方法包括按能導(dǎo)致該對(duì)象的血漿苯丙氨酸濃度下降的有效量向該對(duì)象施用原核PAL變異體組合物。在某些實(shí)施方式中，該對(duì)象在給藥該原核PAL變異體之前具有大于180μM的血漿苯丙氨酸濃度。在一些實(shí)施方式中，該對(duì)象具有120μM和200μM之間的血漿苯丙氨酸濃度。在其他的實(shí)施方式中，該對(duì)象具有200μM和600μM之間的血漿苯丙氨酸濃度。在仍然其他的實(shí)施方式中，該對(duì)象具有600μM和1200μM之間的血漿苯丙氨酸濃度。還有另一類(lèi)待治療的對(duì)象是那些不受限的血漿苯丙氨酸濃度大于1200μM的對(duì)象。在具體的實(shí)施方式中，該對(duì)象是未成年對(duì)象(infant)，例如血漿苯丙氨酸濃度大于1200μM的未成年對(duì)象。本文提供治療患有苯丙酮尿癥的未成年對(duì)象的方法，該方法包括按能導(dǎo)致該未成年對(duì)象的血漿苯丙氨酸濃度下降的有效量向該對(duì)象施用原核PAL變異體組合物。在某些實(shí)施方式中，該未成年對(duì)象在0到3歲之間。在一個(gè)實(shí)施方式中，該未成年對(duì)象具有約360μM至約4800μM之間的血漿苯丙氨酸濃度。在某些實(shí)施方式中，在給藥原核PAL變異體之前，該未成年對(duì)象具有約1200μM的苯丙氨酸濃度，以及原核PAL變異體的給藥將血漿苯丙氨酸濃度降低，例如至約1000μM。在其他的實(shí)施方式中，在給藥原核PAL變異體之前，該未成年對(duì)象具有約800μM的苯丙氨酸濃度以及PAL的給藥將血漿苯丙氨酸濃度降至，例如約600μM。在仍然進(jìn)一步的實(shí)施方式中，在給藥PAL變異體之前，該未成年對(duì)象具有約400μM的苯丙氨酸濃度以及PAL變異體的給藥將血漿苯丙氨酸濃度降低，例如至約300μM。在一些實(shí)施方式中，本文涉及的治療方法將該未成年對(duì)象的血漿苯丙氨酸濃度降至約120μM至約360μM之間的范圍或者約120μM至約240μM之間的范圍。本文還涉及用于治療患有HPA的懷孕雌性對(duì)象(pregnantfemale)的方法，該方法包括向該對(duì)象單獨(dú)或者結(jié)合限蛋白質(zhì)飲食施用原核PAL變異體，其中與不進(jìn)行聯(lián)合給藥時(shí)的濃度相比，單獨(dú)或者結(jié)合限蛋白質(zhì)飲食施用原核PAL變異體對(duì)降低該對(duì)象的血漿中苯丙氨酸濃度有效。在某些實(shí)施方式中，該對(duì)象具有大于180μM但小于600μM的不受限的血漿苯丙氨酸濃度。在其他的實(shí)施方式中，該對(duì)象具有大于500μM但小于1200μM的不受限的血漿苯丙氨酸濃度。在仍然其他的實(shí)施方式中，該對(duì)象具有大于1200μM的不受限的血漿苯丙氨酸濃度。具有大于，例如1200μM血漿苯丙氨酸濃度的有孕對(duì)象是尤其適于這種類(lèi)型療法的候選者，打算懷孕的育齡女性對(duì)象也是如此。在其中該對(duì)象具有大于1200μM的血漿苯丙氨酸濃度的實(shí)施方式中，該方法可以可選擇地進(jìn)一步包括對(duì)該對(duì)象采取限蛋白質(zhì)飲食。本文還提供治療對(duì)象體內(nèi)典型重度PKU的方法，該方法包括向該對(duì)象施用原核PAL變異體或者其生物活性片段、突變體、變異體或者類(lèi)似物，其中與不施用原核PAL時(shí)的濃度相比，施用原核PAL變異體對(duì)降低該對(duì)象血漿中的苯丙氨酸濃度有效。在一些實(shí)施方式中，選擇根據(jù)本文提供的方法進(jìn)行治療的對(duì)象在沒(méi)有進(jìn)行治療時(shí)會(huì)有升高的，例如大于1800μM的血漿Phe濃度。其他的實(shí)施方式涉及在沒(méi)有治療方案的情況下具有大于1000μM的血漿苯丙氨酸濃度的對(duì)象。在一些實(shí)施方式中，本文提供的聯(lián)合給藥方法將該對(duì)象的血漿苯丙氨酸濃度降至小于600μM。在一個(gè)實(shí)施方式中，其被降至小于500μM。在另一實(shí)施方式中，聯(lián)合給藥將該對(duì)象的血漿苯丙氨酸濃度降至從約120μM至約360μM的范圍內(nèi)。在另一實(shí)施方式中，該對(duì)象的血漿苯丙氨酸濃度被降至從約120μM至約240μM的范圍內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方式中，本文提供用于治療患有以PAH活性不足為特征的疾病的對(duì)象(例如高苯丙氨酸血癥、輕度苯丙酮尿癥或者典型重度苯丙酮尿癥；苯丙氨酸高于正常濃度的對(duì)象、具有大于1200μM的血漿苯丙氨酸濃度的未成年對(duì)象或者患有苯丙氨酸血癥的懷孕雌性對(duì)象)的方法，該方法包括向該對(duì)象施用治療有效量的一種包括原核PAL變異體以及藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物，其中該原核PAL變異體與野生型PAL相比具有較大的苯丙氨酸轉(zhuǎn)化活性和/或降低的免疫原性以及有效地將該對(duì)象的血液、血清或者血漿中的苯丙氨酸濃度降至上文所述的范圍。在一些實(shí)施方式中，該原核PAL變異體的一種或者多種氨基酸殘基已被另一種氨基酸取代，其中與野生型PAL相比，該取代提高了苯丙氨酸轉(zhuǎn)化活性和/或降低了免疫原性。在某些實(shí)施方式中，該原核PAL變異體的一種或者多種半胱氨酸殘基已被另一種氨基酸取代。在一些實(shí)施方式中，該原核PAL變異體的一種或者多種半胱氨酸殘基已被絲氨酸殘基取代。在一個(gè)實(shí)施方式中，該原核PAL變異體是AvPAL變異體。在某些實(shí)施方式中，該AvPAL變異體的一種或者多種半胱氨酸殘基已被選自如下的絲氨酸殘基取代：位置64、318、503和565上的半胱氨酸殘基；位置565上的絲氨酸殘基；或者位置503和565上的絲氨酸殘基。在一些實(shí)施方式中，該原核PAL變異體包括水溶性聚合物。在一些實(shí)施方式中，該水溶性聚合物是聚乙二醇。在具體的實(shí)施方式中，該原核PAL變異體是AvPAL變異體，以及AvPAL變異體和聚乙二醇的比率為約1:3(1:3AvPAL：PEG)。在一個(gè)實(shí)施方式中，該原核PAL變異體是AvPAL變異體，AvPAL變異體和聚乙二醇的比率為約1:3(1:3AvPAL：PEG)，以及該AvPAL變異體的位置503和565上的半胱氨酸殘基已被絲氨酸殘基取代。某些實(shí)施方式包括根據(jù)待治療的生物(例如哺乳動(dòng)物或者人類(lèi))的需要優(yōu)化劑量，以有效地改善病癥。原核PAL變異體可以按每日單劑量、每日多劑量、每周單劑量或者每周多劑量來(lái)給藥。在一些實(shí)施方式中，原核PAL變異體療法不是連續(xù)性的，而是每日給藥原核PAL變異體，直至該對(duì)象的血漿苯丙氨酸濃度降低，例如至小于360μM。在一些實(shí)施方式中，其中每日監(jiān)測(cè)該對(duì)象的血漿苯丙氨酸濃度，以及當(dāng)觀察到血漿苯丙氨酸濃度有10％的增長(zhǎng)時(shí)給藥該原核PAL變異體。在其他的實(shí)施方式中，劑量每周給藥一次。涉及至少0.001mg/kg、0.005mg/kg、0.01mg/kg或者0.05mg/kg的劑量，以及劑量的范圍可以高達(dá)每周0.1mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg或者更高。在一些實(shí)施方式中，劑量為2mg/kg/周、1mg/kg/周、0.1mg/kg/周或者0.01mg/kg/周。涉及多種進(jìn)行當(dāng)量劑量給藥的腸胃外或者非腸胃外給藥途徑，包含口腔、經(jīng)皮、透粘膜、肺內(nèi)(包含霧化)、肌內(nèi)、皮下或靜脈內(nèi)給藥。特別地涉及通過(guò)彈丸注射或者直接輸液進(jìn)入關(guān)節(jié)或者CSF進(jìn)行的給藥，例如鞘內(nèi)、腦內(nèi)、心室內(nèi)、經(jīng)由腰椎穿刺或者經(jīng)由小腦延髓池。在一些實(shí)施方式中，劑量通過(guò)皮下或者口服給藥。還涉及提高人類(lèi)對(duì)象體內(nèi)原核PAL變異體活性的其他手段，包含基因療法。原核PAL變異體基因的轉(zhuǎn)移可能通過(guò)本領(lǐng)域已知的多種手段(包含病毒載體、同源重組或者DNA直接注射)進(jìn)行。落入這方面范圍內(nèi)的是以核酸序列為特征的實(shí)施方式，該核酸序列編碼全部或者部分的原核PAL變異體或者其生物活性突變體或類(lèi)似物以及可以植入活體內(nèi)受PAH不足影響的細(xì)胞。在其他的實(shí)施方式中，原核PAL變異體或者其生物活性片段、突變體、變異體或者類(lèi)似物還可以結(jié)合限蛋白質(zhì)飲食施用。本文所述方法中施用的限蛋白質(zhì)飲食便是限制苯丙氨酸飲食，其中對(duì)象的總苯丙氨酸(Phe)攝入量限于小于600mg/日。在其他的實(shí)施方式中，該限蛋白質(zhì)飲食是限制苯丙氨酸飲食，其中總的Phe限于小于300mg/日。在仍然其他的實(shí)施方式中，該限蛋白質(zhì)飲食是補(bǔ)充有一種或者多種氨基酸(例如但不僅限于酪氨酸、纈氨酸、異亮氨酸和/或亮氨酸)的飲食。還涉及一種藥物組合物，該藥物組合物包括原核PAL變異體或者其生物活性片段、突變體、變異體或者類(lèi)似物以及藥學(xué)上可接受的載體、稀釋液或者賦形劑。該藥物組合物可以進(jìn)一步包括藥用蛋白質(zhì)補(bǔ)充劑。在其他的實(shí)施方式中，該原核PAL變異體組合物是未成年對(duì)象配方的部分。在仍然其他的實(shí)施方式中，該蛋白質(zhì)補(bǔ)充劑是不含苯丙氨酸的。該蛋白質(zhì)補(bǔ)充劑可以添加有L-酪氨酸、L-谷氨酸、補(bǔ)充劑濃度為20mg/100g的L-肉堿、補(bǔ)充劑濃度為40mg/100g的L-牛磺酸和硒，以增加營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。它可以進(jìn)一步包括推薦日劑量的礦物質(zhì)，例如鈣、磷和鎂。該補(bǔ)充劑進(jìn)一步可以包括推薦日劑量的選自如下的一種或者多種氨基酸：L-亮氨酸、L-脯氨酸、L-醋酸賴(lài)氨酸、L-纈氨酸、L-異亮氨酸、L-精氨酸、L-丙氨酸、甘氨酸、L-天冬酰胺一水物、L-色氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-組氨酸、L-蛋氨酸、L-谷氨酸和L-天冬氨酸。此外，該補(bǔ)充劑可以添加有推薦日劑量的維生素A、D和E，以增加營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。該補(bǔ)充劑可以包括提供該補(bǔ)充劑的至少40％能量的脂肪含量。這類(lèi)補(bǔ)充劑可以粉狀補(bǔ)充劑的形式或者以蛋白棒的形式提供。本文還提供通過(guò)向?qū)ο笫┯弥委熡行Я康囊环N包括原核PAL變異體的藥物組合物來(lái)治療各種形式的癌癥的方法。在一個(gè)寬泛的實(shí)施方式中，該癌癥是這樣一種癌癥，其中衍生自該癌癥的細(xì)胞其增殖和/或存活對(duì)苯丙氨酸的限制或者缺失敏感。在一些實(shí)施方式中，該癌癥是肺癌、腦癌或者中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌癥、結(jié)腸癌、前列腺癌、腎癌、肝癌或者轉(zhuǎn)移性黑素瘤。在其他的實(shí)施方式中，該癌癥是頭頸部癌、卵巢癌、子宮癌、白血病(例如急性骨髓性白血病或者急性成淋巴細(xì)胞性白血病)或者骨髓瘤。在仍然其他的實(shí)施方式中，該癌癥是小兒癌癥或者抗性癌癥(即，已顯示對(duì)癌癥治療劑或者靶向癌癥治療劑有抗性的癌癥)。本文還提供通過(guò)向?qū)ο笫┯弥委熡行Я康囊环N包括原核PAL變異體的藥物組合物來(lái)治療帕金森氏癥(PD)的方法。在第三個(gè)方面，本文提供原核PAL變異體的藥物組合物或者制劑，其包括原核PAL變異體及其生物活性片段、突變體、變異體或類(lèi)似物，以及藥學(xué)上可接受的載體，其中該藥學(xué)上可接受的載體包括穩(wěn)定劑。在一些實(shí)施方式中，該穩(wěn)定劑是L-苯丙氨酸或其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物。在一些實(shí)施方式中，該穩(wěn)定劑選自如下：L-苯丙氨酸、反式肉桂酸和苯甲酸。在某些實(shí)施方式中，該穩(wěn)定劑是L-苯丙氨酸。在一些實(shí)施方式中，該穩(wěn)定劑是反式肉桂酸。在其他的實(shí)施方式中，該穩(wěn)定劑是苯甲酸。還提供利用這類(lèi)藥物組合物或者制劑治療癌癥的方法。在具體的實(shí)施方式中，該藥物組合物或者制劑包括原核PAL變異體以及藥學(xué)上可接受的載體，其中該原核PAL變異體是AvPAL變異體，該AvPAL變異體和聚乙二醇的比率為約1:3(1:3AvPAL：PEG)，該AvPAL變異體的位置503和565上的半胱氨酸殘基已絲氨酸殘基取代，以及該藥學(xué)上可接受的載體包括穩(wěn)定劑。在一些實(shí)施方式中，該穩(wěn)定劑是L-苯丙氨酸或其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物。在其他的實(shí)施方式中，該穩(wěn)定劑選自如下：L-苯丙氨酸、反式肉桂酸和苯甲酸。在一些實(shí)施方式中，該穩(wěn)定劑是L-苯丙氨酸。在一個(gè)實(shí)施方式中，該穩(wěn)定劑是反式肉桂酸。還提供利用這類(lèi)藥物組合物或者制劑來(lái)治療高苯丙氨酸血癥(包含苯丙酮尿癥)的方法。在第四個(gè)方面，本文提供藥物組合物或者制劑，該藥物組合物或者制劑包括聚乙二醇化的AvPAL變異體，其中該AvPAL變異體和聚乙二醇的比率為約1:3(1:3AvPAL：PEG)以及該AvPAL變異體的一種或者多種半胱氨酸殘基已被絲氨酸殘基取代；以及藥學(xué)上可接受的載體，其中該藥學(xué)上可接受的載體包括一種或者多種(例如至少兩種)穩(wěn)定劑以及可選擇地，防腐劑(即抗菌劑)。該制劑中聚乙二醇化的AvPAL變異體的濃度可以從約1至50mg/mL(約0.016至0.8mM)，例如從約5至20mg/mL(約0.08至0.33mM)或者從約5至15mg/mL(約0.08至0.25mM)。在一些實(shí)施方式中，該藥物組合物或者制劑包括作為緩沖劑的Tris-HCl或者其等價(jià)物；和/或作為等滲調(diào)節(jié)劑的NaCl或者其等價(jià)物。該制劑中Tris-HCl或者其等價(jià)物的濃度可以從約5至50mM，例如從約5至20mM或者從約5至15mM。該制劑中NaCl或者其等價(jià)物的濃度可以從約100至200mM，例如從約120至170mM或者從約120至150mM。該制劑的pH可以從約pH6.0-8.0，例如約pH6.5-7.5或者約pH7.0-7.6。在一些實(shí)施方式中，該穩(wěn)定劑是L-苯丙氨酸(Phe)或者其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物以及甘氨酸(Gly)或者其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物。該制劑中Phe或者其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物的濃度可以從約0.1至10mM，例如從約0.5至5mM或者從約0.5至1.5mM。該制劑中Gly或者其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物的濃度可以從約0.1至100mM，例如從約1.0至100mM、從約1.0至20mM或者從約20至100mM。例如，該制劑中Gly的濃度可以為約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90或者100mM。在一些實(shí)施方式中，該防腐劑是間甲酚或者其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物。該制劑中間甲酚或者結(jié)構(gòu)類(lèi)似物的濃度可以從約0.1％至1％(w/v)，例如從約0.1％至0.5％(w/v)或者從約0.3％至0.5％(w/v)。在一些實(shí)施方式中，該穩(wěn)定劑是Phe和Gly以及該防腐劑是間甲酚。本文提供的所述組合物或者制劑周密地考慮了本文提供的AvPAL變異體、穩(wěn)定劑、緩沖劑、等滲劑、防腐劑和/或其他成分的任何組合以及相關(guān)的pH值和濃度。還提供了利用這類(lèi)藥物組合物或者制劑來(lái)治療HPA(例如PKU)或者癌癥的方法。在具體的實(shí)施方式中，該藥物組合物或者制劑包括聚乙二醇化的AvPAL變異體，其中該AvPAL變異體和聚乙二醇的比率為約1:3(1:3AvPAL：PEG)以及該AvPAL變異體的位置503和565上的半胱氨酸殘基已被絲氨酸殘基取代；以及藥學(xué)上可接受的載體，其包括作為緩沖劑的Tris-HCl、作為等滲劑的NaCl、作為穩(wěn)定劑的Phe和Gly以及可選擇地，作為防腐劑(即抗菌劑)的間甲酚。在一個(gè)實(shí)施方式中，該制劑中聚乙二醇化的AvPAL變異體的濃度為約10+/-5mg/mL(約0.16+/-0.08mM)。在一些實(shí)施方式中，該制劑中Tris-HCl的濃度為約10mM+/-5mM。在其他的實(shí)施方式中，該制劑的pH為約pH7.3+-0.3。在另一實(shí)施方式中，該制劑中NaCl的濃度為約135mM+/-15mM。在一些實(shí)施方式中，該制劑中Phe的濃度為約1+/-0.5mM。在一些實(shí)施方式中，該制劑中Gly的濃度為約10.5+/-9.5mM。在其他的實(shí)施方式中，該制劑中Gly的濃度為約60+/-40mM。在其他的實(shí)施方式中，該制劑中Gly的濃度為約50.5+/-49.5mM。在一些實(shí)施方式中，該制劑包括作為防腐劑的間甲酚。在另一實(shí)施方式中，該制劑中間甲酚的濃度為約0.4％+/-0.1％(w/v)。也周密考慮了上述濃度和pH值的組合。還提供利用這類(lèi)藥物組合物或者制劑來(lái)治療HPA(例如PKU)或者癌癥的方法。在第五個(gè)方面，本文提供以使得能夠在治療上采用酶的量生產(chǎn)重組原核PAL或者其生物活性片段、突變體、變異體或者類(lèi)似物的方法。在某些實(shí)施方式中，PAL衍生自細(xì)菌包括但不僅限于鏈霉菌屬、堆囊粘細(xì)菌屬、假單胞菌屬和藍(lán)細(xì)菌屬(例如念珠藻和魚(yú)腥藻)。在一些實(shí)施方式中，PAL衍生自如下菌種：海洋鏈霉菌、輪絲鏈霉菌、纖維堆囊粘細(xì)菌、點(diǎn)形念珠藻、煙草念珠藻(Nostoctobacum)、多變魚(yú)腥藻或者惡臭假單胞菌。在某些實(shí)施方式中，PAL衍生自藍(lán)細(xì)菌菌種：點(diǎn)形念珠藻或者多變魚(yú)腥藻。在具體的實(shí)施方式中，PAL衍生自多變魚(yú)腥藻。在另一實(shí)施方式中，原核PAL酶活性利用cDNA或者DNA序列生成，所述序列衍生自有時(shí)被描述為為HAL活性編碼、以PAL-HAL基序?yàn)樘卣?，但具有不同于HAL的關(guān)鍵PAL殘基的序列。在一個(gè)寬泛的實(shí)施方式中，該方法包括將為全部或者部分的原核PAL或者其生物活性片段、突變體、變異體或者類(lèi)似物編碼的cDNA或者DNA轉(zhuǎn)化入適于其表達(dá)的細(xì)胞的步驟。在一個(gè)實(shí)施方式中，表達(dá)載體被用于將DNA轉(zhuǎn)移入適于其表達(dá)的細(xì)胞或者細(xì)胞系。在具體的實(shí)施方式中，將該cDNA或者DNA轉(zhuǎn)化入大腸桿菌以及將重組原核PAL過(guò)表達(dá)，可選擇地為融合蛋白質(zhì)。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，該生產(chǎn)原核PAL的方法包括：(a)在合適的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培育細(xì)胞至合理密度，以產(chǎn)生種子培養(yǎng)物，所述細(xì)胞已通過(guò)編碼全部原核PAL或者其生物活性片段、突變體、變異體或者類(lèi)似物的cDNA或者DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)化，(b)將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞引入生物反應(yīng)器，(c)向該生物反應(yīng)器提供合適的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，以及(d)從該培養(yǎng)基分離包含該酶的轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，在大腸桿菌BLR(DE3)/pLysS(Novagen)或者大腸桿菌BL21(DE3)/pLysS(Invitrogen)細(xì)胞中，在具有誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(例如具有IPTG(異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)的載體(例如pIBX1(Su,等人,Appl.Environ.Microbiol.62:2723-2734(1996))或者pET28a(Invitrogen))中，在存在或者不存在N末端標(biāo)簽(例如八聚組氨酰基標(biāo)簽)的情況下，將重組原核PAL或者其生物活性片段、突變體、變異體或者類(lèi)似物過(guò)表達(dá)。在具體的實(shí)施方式中，該生產(chǎn)原核PAL的方法包括：(1)在搖瓶中從甘油菌為生物反應(yīng)器/發(fā)酵罐培育種子培養(yǎng)物；(2)以補(bǔ)料分批方式將這類(lèi)種子培養(yǎng)物引入可控的生物反應(yīng)器；(3)在補(bǔ)充有葡萄糖的培養(yǎng)基中、pH為7.8、溶解氧>20％、攪動(dòng)速度高達(dá)1200rpm、溫度為30℃的條件下培育所述培養(yǎng)物，直至細(xì)胞密度達(dá)到70-100OD600(～22-25hr)；(4)用0.4mMIPTG誘導(dǎo)所述培養(yǎng)物；(5)在降低的溫度22至26℃下培育所述培養(yǎng)物，直至活性變化值<0.1IU/mL(大約40-48hr以及OD600通常為200)；以及(6)通過(guò)連續(xù)離心收獲細(xì)菌。在一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞培養(yǎng)基包括酵母提取蛋白質(zhì)、蛋白胨-胰化蛋白胨、葡萄糖、甘油、酪蛋白氨基酸、痕量鹽和磷酸鹽緩沖鹽。在具體的實(shí)施方式中，該重組原核PAL或者其生物活性片段、突變體、變異體或者類(lèi)似物是AvPAL變異體，以及該生產(chǎn)AvPAL變異體的方法包括：(1)于37℃下在搖瓶中從表達(dá)AvPAL變異體的細(xì)菌的甘油菌為生物反應(yīng)器/發(fā)酵罐培育種子培養(yǎng)物，直至細(xì)胞密度達(dá)到2至4OD600；(2)將該種子培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移入可控的第一生物反應(yīng)器(例如4L發(fā)酵罐)；(3)于37℃下培育該培養(yǎng)物，直至細(xì)胞密度達(dá)到10至20OD600；(4)將該第一生物反應(yīng)器(例如4L發(fā)酵)培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移入可控的第二生物反應(yīng)器(例如100L發(fā)酵罐)；(5)于37℃下培育該培養(yǎng)物，直至細(xì)胞密度達(dá)到至少200OD600；(6)冷卻該培養(yǎng)物至約15℃；以及(7)通過(guò)離心作用從該培養(yǎng)基分離得到細(xì)菌細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，該方法進(jìn)一步包括將該第二生物反應(yīng)器(例如100L發(fā)酵)培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移入可控的第三生物反應(yīng)器(例如500L發(fā)酵罐或者更大)以及于37℃下培育該培養(yǎng)物，直至細(xì)胞密度達(dá)到至少200OD600，然后冷卻該培養(yǎng)物以及從該培養(yǎng)基分離得到細(xì)菌細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，該AvPAL變異體的位置503和565上的半胱氨酸殘基已被絲氨酸殘基取代(SEQIDNO:11)。在第六方面，本文提供一種純化原核PAL或者其生物活性片段、突變體、變異體或者類(lèi)似物的方法。根據(jù)第一實(shí)施方式，培育轉(zhuǎn)化的細(xì)胞團(tuán)塊(cellmass)并使其破碎，留下粗制重組酶。可從粗制塊(crudebulk)分離外源性物質(zhì)，以防止污染柱?？梢岳靡环N或者幾種色譜樹(shù)脂進(jìn)行色譜純化。接著，可以將純化的蛋白質(zhì)配制為緩沖液，設(shè)計(jì)該緩沖液以在較長(zhǎng)的時(shí)間段內(nèi)提供穩(wěn)定的活性。在另一實(shí)施方式中，該純化原核PAL的方法包括：(a)對(duì)包含重組原核PAL的細(xì)菌進(jìn)行裂解；(b)對(duì)裂解物進(jìn)行熱處理，以使大腸桿菌蛋白質(zhì)變性并沉淀；(c)利用第二連續(xù)離心步驟和/或深層過(guò)濾澄清該裂解物；(d)使澄清的裂解物通過(guò)木炭過(guò)濾步驟；(e)在(d)中使濾出液通過(guò)中間深層過(guò)濾步驟(如用一種或者多種深層過(guò)濾器，例如PallEKSP、PallKS50P和/或PallEKMP過(guò)濾器)，然后通過(guò)最終的過(guò)濾步驟(如用SartoriousSartopore或者PallEDF0.2μm過(guò)濾器)；(f)使最終的濾出液通過(guò)疏水作用色譜樹(shù)脂，例如丁基疏水作用色譜；(g)在(f)中使洗出液通過(guò)陰離子色譜樹(shù)脂，例如Q離子交換柱；(h)可選擇地，通過(guò)具有切向流過(guò)濾的緩沖液更換來(lái)回收最終產(chǎn)品；以及(i)對(duì)最終產(chǎn)品進(jìn)行消毒。本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易地理解可以省略或者取代色譜法步驟的一步或者多步；或者可以改變色譜法步驟的順序。最后，根據(jù)需要可以進(jìn)行適當(dāng)?shù)南静襟E。本文還提供純化的原核PAL或者其生物活性片段、突變體、變異體或者類(lèi)似物(例如通過(guò)本文提供的純化方法而產(chǎn)生)，及其藥物組合物和制劑，及其使用方法。在具體的實(shí)施方式中，該重組原核PAL或者其生物活性片段、突變體、變異體或者類(lèi)似物是具有最小聚集的聚乙二醇化的AvPAL變異體，以及該純化聚乙二醇化的AvPAL變異體的方法包括：(a)通過(guò)均化作用裂解包含AvPAL變異體的細(xì)菌細(xì)胞，以生成細(xì)胞裂解物；(b)加熱該細(xì)胞裂解物至65℃達(dá)30至120min；(c)離心加熱的細(xì)胞裂解物，其中保留包括該AvPAL變異體的上清液；(d)過(guò)濾該上清液，以去除沉淀物；(e)通過(guò)在陰離子交換(AIEX)柱(例如ToyopearlGigaCapQ650M柱)，然后是疏水作用(HIC)柱(例如Toyopearl丁基650M柱)上進(jìn)行的依序?qū)游龇◤奈廴镜鞍踪|(zhì)中分離該AvPAL變異體，其中來(lái)自該HIC柱的洗出液包括該AvPAL變異體；(f)對(duì)來(lái)自該HIC柱的包括該AvPAL變異體的洗出液進(jìn)行超濾或者超濾/滲濾；(g)通過(guò)混合聚乙二醇與該AvPAL變異體對(duì)該AvPAL變異體進(jìn)行聚乙二醇化；(h)通過(guò)超濾/滲濾將游離的聚乙二醇從聚乙二醇化的AvPAL變異體除去；以及(h)配制該聚乙二醇化的AvPAL變異體。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述AvPAL變異體的位置503和565上的半胱氨酸殘基已被絲氨酸殘基取代(SEQIDNO:11)。在一個(gè)實(shí)施方式中，該聚乙二醇化的AvPAL變異體包括聚乙二醇。在一個(gè)實(shí)施方式中，該聚乙二醇化的AvPAL變異體包括聚乙二醇，其中AvPAL變異體和該聚乙二醇的比率為約1:3。在一個(gè)實(shí)施方式中，該AIEX柱是ToyopearlGigaCapQ650M柱。在一個(gè)實(shí)施方式中，該HIC柱是Toyopearl丁基650M柱。在一個(gè)實(shí)施方式中，該純化聚乙二醇化的AvPAL變異體的方法進(jìn)一步包括冷凍和融化來(lái)自該HIC柱的包括該AvPAL變異體的洗出液，其中在冷凍之前，向HIC柱洗出液添加一種或者多種多元醇或者糖，例如約2.5％、5％、7.5％、10％、12.5％或者15％的甘油、蔗糖、葡萄糖、海藻糖、甘露醇或者山梨醇或諸如此類(lèi)。在一個(gè)實(shí)施方式中，該多元醇是甘油。在一個(gè)實(shí)施方式中，甘油的濃度是10％(v/v)。在一個(gè)實(shí)施方式中，該糖是蔗糖。在一個(gè)實(shí)施方式中，蔗糖的濃度是10％(v/v)。在一個(gè)實(shí)施方式中，該純化聚乙二醇化的AvPAL變異體的方法進(jìn)一步包括在冷凍之前，通過(guò)超濾將來(lái)自該HIC柱的包括該AvPAL變異體的洗出液濃縮至約16X或更多(例如約2X、3X、4X、5X、6X、8X、10X、12X、14X、16X、18X、20X或者25X)。在一個(gè)實(shí)施方式中，利用離散(discrete)溫度步驟冷凍來(lái)自該HIC柱的包括該AvPAL變異體的洗出液。在一個(gè)實(shí)施方式中，利用離散溫度步驟融化來(lái)自該HIC柱的包括該AvPAL變異體的洗出液。在一個(gè)實(shí)施方式中，利用離散溫度步驟冷凍和融化來(lái)自該HIC柱的包括該AvPAL變異體的洗出液。在一個(gè)實(shí)施方式中，聚乙二醇化后，在包括磷酸鉀(Kpi)和一種或者多種降低聚集和/或保持酶活性的藥劑(例如反式肉桂酸(t-CA)和甘油)的滲濾緩沖液中滲濾來(lái)自該HIC柱的包括該AvPAL變異體的洗出液。在一個(gè)實(shí)施方式中，該滲濾緩沖液包括50mMKpi、10mMt-CA、5％甘油，pH為8.5。在一個(gè)實(shí)施方式中，向來(lái)自該HIC柱的包括該AvPAL變異體的超濾/滲濾洗出液添加一種非離子去垢劑，例如聚山梨醇酯80(PS80)。在一個(gè)實(shí)施方式中，該非離子去垢劑是PS80。在一個(gè)實(shí)施方式中，PS80的濃度是0.02％(v/v)。本文還提供具有最小聚集的聚乙二醇化的AvPAL變異體(例如通過(guò)本文提供的純化方法而產(chǎn)生)，及其藥物組合物和制劑，及其使用方法。在具體的實(shí)施方式中，該重組原核PAL或者其生物活性片段、突變體、變異體或者類(lèi)似物是具有最小聚集的AvPAL變異體，以及該純化AvPAL變異體的方法包括：(a)通過(guò)均化作用裂解包含AvPAL變異體的細(xì)菌細(xì)胞，以生成細(xì)胞裂解物；(b)加熱該細(xì)胞裂解物至65℃達(dá)30至120min；(c)離心加熱的細(xì)胞裂解物，其中保留包括該AvPAL變異體的上清液；(d)過(guò)濾該上清液，以去除沉淀物；(e)通過(guò)在AIEX柱(例如ToyopearlGigaCapQ650M)，然后是疏水作用HIC柱(例如Toyopearl丁基650M)上進(jìn)行的依序?qū)游龇◤奈廴镜鞍踪|(zhì)分離該AvPAL變異體，其中來(lái)自該HIC柱的洗出液包括該AvPAL變異體。在一個(gè)實(shí)施方式中，在一個(gè)實(shí)施方式中，所述AvPAL變異體的位置503和565上的半胱氨酸殘基已被絲氨酸殘基取代(SEQIDNO:11)。在一個(gè)實(shí)施方式中，該AIEX柱是ToyopearlGigaCapQ650M柱。在一個(gè)實(shí)施方式中，該HIC柱是Toyopearl丁基650M柱。本文還提供具有最小聚集的AvPAL變異體(例如通過(guò)本文提供的純化方法而產(chǎn)生)，及其藥物組合物和制劑，及其使用方法。在第七個(gè)方面，本文提供用于識(shí)別可以通過(guò)使包含升高水平的苯丙氨酸的細(xì)胞接觸細(xì)菌PAL來(lái)預(yù)防、改善或者治療升高水平的苯丙氨酸的原核PAL或者其生物活性片段、突變體、變異體或者類(lèi)似物以及測(cè)定該細(xì)菌PAL是否降低這類(lèi)升高水平的苯丙氨酸的篩選檢定及其方法。這類(lèi)篩選檢定還可以包括先創(chuàng)建變異體，接著檢測(cè)該變異體的活體外苯丙氨酸轉(zhuǎn)化活性的步驟，該變異體在如下區(qū)域包括保守性或者非保守性取代：活性位點(diǎn)，例如來(lái)自海洋鏈霉菌的EncP中的Gly142、Thr-Ser-Gly三聯(lián)體(143-145)、Asp146、Leu147、Asn196、Ile195、Leu192、Leu76、Asn79、Met400、Thr428、Gln432或者其他原核PAL(例如點(diǎn)形念珠藻或者多變魚(yú)腥藻)中其等價(jià)物，其相當(dāng)于來(lái)自圓紅冬孢酵母菌的PAL(RtPAL)中的殘基Ser210、Ala-Ser-Gly三聯(lián)體(211-213)、Asp214、Leu215、Asn270、Val269、Leu266、Leu134、His137、Lys468、Glu496、Gln500；與該活性位點(diǎn)相鄰的區(qū)域；或者遍布整個(gè)多肽序列的區(qū)域。在某些實(shí)施方式中，該方法是一種高產(chǎn)量檢定。在一個(gè)實(shí)施方式中，利用生物信息學(xué)途徑對(duì)菌種的完整基因組進(jìn)行測(cè)序并進(jìn)行關(guān)于是否存在原核PAL同系物的篩選。在另一實(shí)施方式中，這類(lèi)同系物的蛋白質(zhì)產(chǎn)品的PAL催化活性通過(guò)，例如檢測(cè)在活體外將苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為反式肉桂酸的能力來(lái)確定。本文提供將原核PAL組合物用于診斷疾病的方法，所述疾病包含但不僅限于全部或者部分地由PAH活性不足導(dǎo)致的疾病。在一個(gè)實(shí)施方式中，原核PAL被用于測(cè)量血液、血漿或者血清樣本中的Phe水平。本文還提供一種診斷試劑盒，所述診斷試劑盒包括用于監(jiān)測(cè)對(duì)象的血液、血漿或者血清樣本的Phe水平的原核PAL。將由下文的詳細(xì)描述可見(jiàn)本文提供的所述組合物和方法的其他特征和優(yōu)點(diǎn)。然而，應(yīng)當(dāng)理解的是，詳細(xì)的描述和具體的實(shí)施例在表明本發(fā)明的具體實(shí)施方式的同時(shí)，僅僅通過(guò)描述性方法提供，因?yàn)榛谠撛敿?xì)的描述，本發(fā)明精神和范圍內(nèi)的各種改變和修飾對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將變得顯而易見(jiàn)。附圖說(shuō)明圖1.圖1A：點(diǎn)形念珠藻PAL(SEQIDNO:1)的基因序列；圖1B：點(diǎn)形念珠藻PAL(SEQIDNO:2)的蛋白質(zhì)序列。圖2.圖2A：多變魚(yú)腥藻PAL(SEQIDNO:3)的基因序列；圖2B：多變魚(yú)腥藻PAL(SEQIDNO:4)的蛋白質(zhì)序列。圖3.來(lái)自原核生物和真核生物的芳香族氨基酸解氨酶的相關(guān)度樹(shù)(Relatednesstree)。序列檢索自GenBank(登錄號(hào)提供在括號(hào)內(nèi))以及利用鄰接法使用ClustalX(1.83)進(jìn)行比對(duì)。圖4.點(diǎn)形念珠藻PAL(SEQIDNO:2)和多變魚(yú)腥藻PAL(SEQIDNO:4)與EncPPAL(SEQID.No.5)和惡臭假單胞菌HAL(SEQIDNO:6)的藻蛋白質(zhì)序列的比對(duì)。對(duì)應(yīng)于PAL或者HAL活性的活性位點(diǎn)殘基被顯著標(biāo)出。圖5.圖5A：在位置64具有半胱氨酸到絲氨酸的取代的多變魚(yú)腥藻苯丙氨酸解氨酶(PAL)的蛋白質(zhì)序列(AvPAL_C64S，SEQIDNO:7)；圖5B：在位置318具有半胱氨酸到絲氨酸的取代的多變魚(yú)腥藻PAL的蛋白質(zhì)序列(AvPAL_C318S,SEQIDNO:8)；圖5C：在位置503具有半胱氨酸到絲氨酸的取代的多變魚(yú)腥藻PAL的蛋白質(zhì)序列(AvPAL_C503S,SEQIDNO:9)；圖5D：在位置565具有半胱氨酸到絲氨酸的取代的多變魚(yú)腥藻PAL的蛋白質(zhì)序列(AvPAL_C565S,SEQIDNO:10)；圖5E：在位置503和565具有半胱氨酸到絲氨酸的取代的多變魚(yú)腥藻PAL的蛋白質(zhì)序列(AvPAL_C565SC503S,SEQIDNO:11)。半胱氨酸到絲氨酸的取代以黑體下劃線標(biāo)出。圖6.圖6A：37℃下孵育不同的時(shí)間段之后，非聚乙二醇化AvPAL的位置565或者兩位置565和503上半胱氨酸到絲氨酸的取代對(duì)活體外PAL酶比活的影響。圖6B：37℃下孵育不同的時(shí)間段之后，聚乙二醇化AvPAL的位置565或者兩位置565和503上半胱氨酸到絲氨酸的取代對(duì)活體外PAL酶比活的影響。圖7.圖7A：如變性條件(左邊小圖)或者天然條件(右邊小圖)下通過(guò)凝膠電泳進(jìn)行分析所得，AvPAL中半胱氨酸到絲氨酸的取代對(duì)溶液中蛋白質(zhì)聚集體形成的影響。圖7B：如通過(guò)SEC-HPLC進(jìn)行分析所得，AvPAL中半胱氨酸到絲氨酸的取代對(duì)溶液中蛋白質(zhì)聚集體形成的影響。圖8.各種PEG濃度下，AvPAL中(dbl突變體)位置565和503上的半胱氨酸到絲氨酸的取代對(duì)位點(diǎn)特異性聚乙二醇化作用的影響。圖9.如通過(guò)SEC-HPLC分析所得，用0.05％吐溫80或者10mMEDTA處理AvPAL對(duì)溶液中蛋白質(zhì)聚集體形成的影響。圖10.圖10A：如通過(guò)SEC-HPLC分析所得，通過(guò)二硫蘇糖醇(DTT)的AvPAL的處理對(duì)溶液中蛋白質(zhì)聚集體形成的影響。圖10B：如通過(guò)SEC-HPLC分析所得，通過(guò)DTT和N-乙基馬來(lái)酰亞胺(NEM)處理AvPAL對(duì)溶液中蛋白質(zhì)聚集體形成的影響。圖11.如所示，在4℃(上部小圖)、25℃(中部小圖)和37℃(下部小圖)存儲(chǔ)達(dá)不同的時(shí)間段(天數(shù))的條件下，Phe和反式肉桂酸(t-CA)對(duì)在位置565和503(AvPAL_C565SC503S)上具有半胱氨酸到絲氨酸取代的聚乙二醇化AvPAL(rAV-PAL-PEG)的酶活性的影響。圖12.如所示，在4℃(上部小圖)、25℃(中部小圖)和37℃(下部小圖)存儲(chǔ)達(dá)不同的時(shí)間段(天數(shù))的條件下，1和5mM酪氨酸(Tyr)對(duì)在位置565和503(AvPAL_C565SC503S)上具有半胱氨酸到絲氨酸取代的聚乙二醇化AvPAL(rAV-PAL-PEG)的酶活性的影響。圖13.圖13A：如所示，在4℃(上部小圖)和37℃(下部小圖)存儲(chǔ)達(dá)不同的時(shí)間段(周數(shù))的條件下，Phe、苯甲酸和吡哆胺，單獨(dú)或者組合地，對(duì)在位置565和503(AvPAL_C565SC503S)上具有半胱氨酸到絲氨酸取代的聚乙二醇化AvPAL(rAV-PAL-PEG)的酶活性的影響。圖13B：顯示了苯甲酸(左邊)、苯丙氨酸(中間)和反式肉桂酸(右邊)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。圖14.如所示，在4℃(上部小圖)、25℃(中部小圖)和40℃(下部小圖)存儲(chǔ)達(dá)不同的時(shí)間段(周數(shù))的條件下，防腐劑苯甲醇(Benz’OH，1.5％)或者間甲酚(mCresol，0.3％)和/或穩(wěn)定劑L-苯丙氨酸(Phe，1mM)和/或甘氨酸(Gly，1mM)對(duì)在位置565和503(AvPAL_C565SC503S)上具有半胱氨酸到絲氨酸取代的聚乙二醇化AvPAL(rAv-PAL-PEG)的比活(U/mg)的影響。圖15.圖15A：如所示，在25℃(上部小圖)和40℃(下部小圖)存儲(chǔ)達(dá)不同的時(shí)間段(如所示，周數(shù)或者月數(shù))的條件下，1至20mM的甘氨酸(Gly)對(duì)在位置565和503(AvPAL_C565SC503S)上具有半胱氨酸到絲氨酸取代的聚乙二醇化的AvPAL的歸一化活性(％)的影響。圖15B：如所示，在40℃存儲(chǔ)達(dá)不同的時(shí)間段(如所示，周數(shù))的條件下，20、50或者100mM的甘氨酸(Gly)對(duì)在位置565和503(AvPAL_C565SC503S)上具有半胱氨酸到絲氨酸取代的聚乙二醇化的AvPAL的酶活性(U/mL)的影響。圖16.與服用溶媒或者4.0IU野生型聚乙二醇化的AvPAL的ENU2小鼠相比，聚乙二醇化的AvPAL中位置565和503(AvPAL_C565SC503S)上的半胱氨酸到絲氨酸的取代對(duì)服用0.25IU(上部小圖)、1.0IU(中部小圖)或者4.0IU(下部小圖)酶的ENU2小鼠活體內(nèi)Phe水平的影響。圖17.與服用溶媒或者4.0IU野生型聚乙二醇化的AvPAL的ENU2小鼠相比，聚乙二醇化的AvPAL中位置565和503(AvPAL_C565SC503S)上的半胱氨酸到絲氨酸的取代對(duì)服用0.25IU、1.0IU或者4.0IU酶的ENU2小鼠的體重的影響。圖18.與服用溶媒或者4.0IU野生型聚乙二醇化的AvPAL(AvPAL：PEG比率為1:3)的ENU2小鼠相比，聚乙二醇化的AvPAL中位置565和503(AvPALC503S/565S)上的半胱氨酸到絲氨酸的取代對(duì)服用4IU酶(AvPAL：PEG比率不同，為1:1.6(上部小圖)、1:2.4(中部小圖)或者1:3(下部小圖))的ENU2小鼠活體內(nèi)Phe水平的影響。圖19.與服用溶媒或者4.0IU野生型聚乙二醇化的AvPAL(AvPAL：PEG比率為1:3)的ENU2小鼠相比，聚乙二醇化的AvPAL中位置565和503(AvPAL_C565SC503S)上的半胱氨酸到絲氨酸的取代對(duì)服用4IU酶(AvPAL：PEG比率不同，為1:1.6、1:2.4或者1:3)的ENU2小鼠的體重的影響。圖20.圖20A：以4mg/kg(菱形)和12mg/kg(正方形)的劑量向食蟹猴單次皮下注射在位置565和503(AvPAL_C565SC503S)上具有半胱氨酸到絲氨酸取代的聚乙二醇化AvPAL隨著時(shí)間的推移(hr)對(duì)血漿AvPAL_C565SC503S水平的影響。圖20B：以4mg/kg的劑量向食蟹猴單次皮下注射AvPAL_C565SC503S隨著時(shí)間的推移(hr)對(duì)血漿AvPAL_C565SC503S(菱形)和苯丙氨酸(正方形)水平的影響。圖21.圖21A：以1mg/kg(菱形)、5mg/kg(正方形)和25mg/kg(三角形)的劑量向大鼠單次靜脈注射在位置565和503(AvPAL_C565SC503S)上具有半胱氨酸到絲氨酸取代的聚乙二醇化AvPAL隨著時(shí)間的推移(hr)對(duì)血漿AvPAL_C565SC503S水平的影響。圖21B：以10mg/kg(菱形)、25mg/kg(正方形)和250mg/kg(三角形)的劑量向大鼠單次皮下注射AvPAL_C565SC503S水平隨著時(shí)間的推移(hr)對(duì)血漿AvPAL_C565SC503S的影響。圖22.用于大規(guī)模制造具有最小聚集的聚乙二醇化AvPAL變異體多肽的生產(chǎn)工藝的流程圖。指向左側(cè)的箭頭表示工序，其是降低聚集的目標(biāo)。發(fā)明詳述本文提供原核PAL和生物活性片段、突變體、變異體或類(lèi)似物的組合物及其在治療方面的用途，包含對(duì)高苯丙氨酸血癥(包含苯丙酮尿癥)以及其他疾病(包含癌癥)的治療。A.定義除非另有說(shuō)明，本申請(qǐng)(包含說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū))所用的下文的術(shù)語(yǔ)其定義在下文提供。必須指出的是，如說(shuō)明書(shū)和所附的權(quán)利要求書(shū)所用，單數(shù)形式的“一種”和“該”包含所指對(duì)象的復(fù)數(shù)含義，除非上下文另有明確規(guī)定。標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)術(shù)語(yǔ)的定義可以見(jiàn)于參考文獻(xiàn)，包括Carey和Sundberg,AdvancedOrganicChemistry,3rdEdition,Vols.A和B(PlenumPress,NewYork1992)。除非另行指明，本發(fā)明實(shí)踐中將采用本
技術(shù)領(lǐng)域：
中傳統(tǒng)的有機(jī)合成化學(xué)方法、質(zhì)譜分析法、色譜制備和分析法、蛋白質(zhì)化學(xué)、生物化學(xué)、重組DNA技術(shù)和藥理學(xué)。見(jiàn)，例如T.E.Creighton,Proteins：Structures和MolecularProperties(W.H.Freeman和Company,1993)；A.L.Lehninger,Biochemistry(WorthPublishers,Inc.,4thEdition,2004)；Sambrook,等人,MolecularCloning：ALaboratoryManual(2ndEdition,1989)；MethodsInEnzymology(S.Colowick和N.Kaplaneds.,AcademicPress,Inc.)；Remington’sPharmaceuticalSciences,18thEdition(Easton,Pennsylvania：MackPublishingCompany,1990)。無(wú)論是上文還是下文，本文引用的所有出版物、專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng)整體以引用方式并入本文。如下的氨基酸縮寫(xiě)詞在全文中都有使用：丙氨酸：Ala(A)精氨酸：Arg(R)天冬酰胺：Asn(N)天冬氨酸：Asp(D)半胱氨酸：Cys(C)谷氨酸：Gln(Q)谷氨酸：Glu(E)甘氨酸：Gly(G)組氨酸：His(H)異亮氨酸：Ile(I)亮氨酸：Leu(L)賴(lài)氨酸：Lys(K)蛋氨酸：Met(M)苯丙氨酸：Phe(F)脯氨酸：Pro(P)絲氨酸：Ser(S)蘇氨酸：Thr(T)色氨酸：Trp(W)酪氨酸：Tyr(Y)纈氨酸：Val(V)“多聚核苷酸”指由核苷酸單元組成的聚合物。多聚核苷酸包括天然存在的核酸，例如脫氧核糖核酸(“DNA”)和核糖核酸(“RNA”)以及核酸類(lèi)似物。核酸類(lèi)似物包括那些包含有與其它核苷酸而非天然存在的磷酸二酯鍵連接的非天然存在的堿基、核苷酸的核酸類(lèi)似物，或者包括通過(guò)連接部分而非磷酸二酯鍵連接的堿基的核酸類(lèi)似物。因此，核苷酸類(lèi)似物包括，例如以及不限于，磷硫酰、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、硼烷磷酸酯、膦酸甲酯、手性-膦酸甲酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)等等。這類(lèi)多聚核苷酸可以例如，利用自動(dòng)化的DNA合成儀合成。術(shù)語(yǔ)“核酸”通常指大的多聚核苷酸。術(shù)語(yǔ)“寡聚核苷酸”通常指短的多聚核苷酸，通常不大于約50個(gè)核苷酸。應(yīng)理解的是，當(dāng)核苷酸序列由DNA序列(即，A、T、G、C)表示時(shí)，這還包括RNA序列(即，A、U、G、C)其中“U”取代了“T”?！癱DNA”指單鏈或者雙鏈形式的與mRNA互補(bǔ)或者相同的DNA。本文中的傳統(tǒng)符號(hào)用于描述多聚核苷酸序列：?jiǎn)捂湺嗑酆塑账嵝蛄械淖蠖耸?’末端；雙鏈多聚核苷酸序列左手方向被稱(chēng)為5’方向。從5’到3’添加核苷酸至新生RNA轉(zhuǎn)錄物的方向被稱(chēng)為轉(zhuǎn)錄方向。與mRNA具有相同序列的DNA鏈被稱(chēng)為“編碼鏈”；在與由DNA轉(zhuǎn)錄得到的mRNA具有相同序列的該DNA鏈上的、位于RNA轉(zhuǎn)錄物的5’到5’末端的序列被稱(chēng)為“上游序列”；在與RNA具有相同序列的DNA鏈上的、位于編碼RNA轉(zhuǎn)錄物的3’到3’末端的序列被稱(chēng)為“下游序列”?！盎パa(bǔ)”指兩種多聚核苷酸的相互作用面具有拓?fù)浼嫒菪曰蛘咂ヅ湓谝黄?。因此，所述兩種分子可以描述為是互補(bǔ)的，而且，接觸面特性彼此互補(bǔ)。如果第一多聚核苷酸的核苷酸序列與第二多聚核苷酸的結(jié)合有多聚核苷酸的配體的核苷酸序列相同，那么該第一多聚核苷酸與該第二多聚核苷酸互補(bǔ)。因此，序列為5’-TATAC-3’的多聚核苷酸與序列為5’-GTATA-3’的多聚核苷酸是互補(bǔ)的。如果與目標(biāo)核苷酸序列(subjectnucleotidesequence)互補(bǔ)的核苷酸序列與參考核苷酸序列(referencenucleotidesequence)大體上相同，那么該核苷酸序列與該參考核苷酸序列“大體上互補(bǔ)”。“編碼”指一種多聚核苷酸(例如基因、cDNA或者mRNA)中核苷酸的特異性序列用作在生化過(guò)程中合成其他聚合物和大分子的模板的固有屬性，所述生化過(guò)程具有定義的核苷酸序列(即rRNA、tRNA和mRNA)或者定義的氨基酸序列；以及由此產(chǎn)生的生物學(xué)屬性。因此，如果由一種基因產(chǎn)生的mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯在細(xì)胞或者其他生物系統(tǒng)中產(chǎn)生了蛋白質(zhì)，那么就說(shuō)該基因編碼蛋白質(zhì)。基因或者cDNA的編碼鏈(其核苷酸序列與mRNA序列是相同的并且通常提供于序列表中)和非編碼鏈(用作轉(zhuǎn)錄模板)可以均視為編碼該基因或者cDNA的蛋白質(zhì)或者其他產(chǎn)品。除非另行指明，“編碼氨基酸序列的核苷酸序列”包括所有的彼此互為簡(jiǎn)并序列以及編碼相同的氨基酸序列的核苷酸序列。編碼蛋白質(zhì)和RNA的核苷酸序列可以包括內(nèi)含子?！爸亟M多聚核苷酸”指序列不是天然地結(jié)合在一起的多聚核苷酸。擴(kuò)增或者裝配的重組多聚核苷酸可以包含在合適的載體中，以及該載體可用于轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞。包括該重組多聚核苷酸的宿主細(xì)胞便被稱(chēng)為“重組宿主細(xì)胞”。然后在該重組宿主細(xì)胞中表達(dá)基因，以產(chǎn)生，例如“重組多肽”。重組多聚核苷酸也可發(fā)揮非編碼功能(例如啟動(dòng)子、復(fù)制起點(diǎn)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)等等)。“表達(dá)控制序列”指多聚核苷酸中，調(diào)節(jié)可操作地連接至其的核苷酸序列的表達(dá)(轉(zhuǎn)錄和/或翻譯)的核苷酸序列。“可操作地連接”指兩部分之間的功能關(guān)系，其中一部分的活性(例如調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的能力)造成對(duì)另一部分的影響(例如序列的轉(zhuǎn)錄)。表達(dá)控制序列可以包括，例如以及不限于，啟動(dòng)子(例如誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或者組成型啟動(dòng)子)、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄終止子、起始密碼子(即ATG)、內(nèi)含子剪接信號(hào)和終止密碼子的序列?！氨磉_(dá)載體”指包括重組多聚核苷酸的載體，該重組多聚核苷酸包括可操作地連接至待表達(dá)的核苷酸序列的表達(dá)控制序列。表達(dá)載體包括足夠的用于表達(dá)的順式作用元件；用于表達(dá)的其他元件可以由宿主細(xì)胞或者活體外表達(dá)系統(tǒng)提供。表達(dá)載體包括本領(lǐng)域已知的所有那些表達(dá)載體，例如粘粒、質(zhì)粒(例如裸露的質(zhì)粒或者包含在脂質(zhì)體內(nèi)的質(zhì)粒)以及結(jié)合有重組多聚核苷酸的病毒。“擴(kuò)增”指借此可復(fù)制多聚核苷酸序列，以及因此將其擴(kuò)展為更多數(shù)量的多聚核苷酸分子的任何手段，例如逆轉(zhuǎn)錄、聚合酶鏈反應(yīng)和連接酶鏈反應(yīng)?！耙铩敝改軌蛱禺愋噪s交至指定的多聚核苷酸模板并為互補(bǔ)多聚核苷酸的合成提供起始點(diǎn)的多聚核苷酸。當(dāng)多聚核苷酸引物置于下面的條件下時(shí)，這類(lèi)合成便會(huì)發(fā)生：其中，即，在核苷酸、互補(bǔ)多聚核苷酸模板和用于聚合反應(yīng)的藥劑(例如DNA聚合酶)的存在下，對(duì)合成進(jìn)行了誘導(dǎo)。引物通常是單鍵的，但也可以是雙鍵的。引物通常是脫氧核糖核酸，但很多合成引物和天然存在的引物也有多種應(yīng)用。引物與經(jīng)設(shè)計(jì)，雜交有該引物并將該引物作為合成起始位點(diǎn)的模板是互補(bǔ)的，但是該引物并不必反映該模板的確切序列。在這種情況下，引物特異性雜交至模板取決于雜交條件的嚴(yán)格性。引物可以用，例如顯色、放射性或者熒光部分進(jìn)行標(biāo)記以及可用作可檢測(cè)的部分?！岸嚯摹笔怯扇缦鲁煞纸M成的聚合物：氨基酸殘基、相關(guān)的天然存在的結(jié)構(gòu)變異體及其經(jīng)由肽鍵連接的合成的非天然存在的類(lèi)似物、相關(guān)的天然存在的結(jié)構(gòu)變異體及其合成的非天然存在的類(lèi)似物。合成的多肽可以例如，利用自動(dòng)化的多肽合成儀來(lái)合成。術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”通常指大的多肽。術(shù)語(yǔ)“肽”通常指短的多肽。本文中用傳統(tǒng)符號(hào)描述多肽序列：多肽序列的左端是氨基末端；多肽序列的右端是羧基末端。“保守性取代”指用功能上相似的氨基酸取代氨基酸的多肽。下面六組中每組包含彼此互為保守性取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酸(Q)；4)精氨酸(R)、賴(lài)氨酸(K)；5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、纈氨酸(V)；以及6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。氨基酸還可以分為如下幾組：(1)疏水性：Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性親水性：Cys、Ser、Thr；(3)酸性：Asp、Glu；(4)堿性：Asn、Gln、His、Lys、Arg；(5)影響鏈取向的殘基：Gly、Pro；以及(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。術(shù)語(yǔ)“一致”或者百分比“一致度”，在兩種或者兩種以上的多聚核苷酸或者多肽序列的情況下，是指當(dāng)進(jìn)行最大對(duì)應(yīng)性比較和比對(duì)時(shí)，利用2005年9月19日提交的、申請(qǐng)?zhí)枮?1/230,374的現(xiàn)有同時(shí)待審的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)(其以引用方式全部并入本文)中描述的序列比較算法或者通過(guò)目檢所測(cè)得，兩種或者兩種以上序列或者子序列是相同的或者具有指定百分比的相同的核苷酸或者氨基酸殘基。短語(yǔ)“大體上同源”或者“大體上一致”，在兩種核酸或者多肽的情況下，通常指當(dāng)進(jìn)行最大對(duì)應(yīng)性比較和比對(duì)時(shí)，利用下文的序列比較算法之一或者通過(guò)目檢所測(cè)得，兩種或者兩種以上序列或者子序列具有至少40％、60％、80％、90％、95％、98％的核苷酸或者氨基酸殘基一致度。大體上一致性可存在于長(zhǎng)度為至少約50個(gè)殘基的序列的區(qū)域，例如至少約100個(gè)殘基的區(qū)域或者至少約150個(gè)殘基的區(qū)域。在某些實(shí)施方式中，所比較的生物聚合物的任一種或者兩種其整個(gè)長(zhǎng)度范圍內(nèi)都具有大體上一致的序列?！按篌w上純的”或者“分離的”指對(duì)象物種(objectspecies)是存在的主要物種(即，基于摩爾，比組合物中任何其他個(gè)體的大分子物種都要含量豐富)，以及大體上純的組分是這樣的，其中該對(duì)象物種包括存在的所有大分子物種的至少約50％(基于摩爾)。通常，大體上純的組合物指組合物中存在的大分子物種的約80％至90％或者更多是所需的純化物種。如果組合物主要包括單一大分子物種，對(duì)象物種則純化至基本上是均質(zhì)的(通過(guò)常規(guī)的檢測(cè)方法不能檢測(cè)出組合物中的雜質(zhì)物種)。溶劑類(lèi)、小分子(<500Da)、穩(wěn)定劑(例如BSA)和元素離子類(lèi)不認(rèn)為是本定義的大分子物種。在一些實(shí)施方式中，該原核PAL變異體組合物是大體上純的或者分離的。在一些實(shí)施方式中，該原核PAL變異體組合物相對(duì)于在其合成中所用的大分子起始物料是大體上純的或者分離的。在一些實(shí)施方式中，該藥物組合物包括混有一種或者多種藥學(xué)上可接受的賦形劑的大體上純的或者分離的原核PAL變異體?！疤烊淮嬖诘摹?，當(dāng)應(yīng)用于對(duì)象時(shí)，指該對(duì)象可以發(fā)現(xiàn)于自然界這一事實(shí)。例如，生物(包含病毒)中存在的、可以從天然源中分離得到而未經(jīng)實(shí)驗(yàn)室刻意的人工修飾的多肽或者多聚核苷酸序列便是天然存在的。術(shù)語(yǔ)“野生型”(wt)指生物的天然遺傳形式。野生型不同于突變體形式(具有基因突變的生物)。術(shù)語(yǔ)“多肽”和“蛋白質(zhì)”指氨基酸殘基的聚合物以及不僅限于最小長(zhǎng)度的產(chǎn)品。因此，肽、低聚肽、二聚體、多聚體等等包含在該定義內(nèi)。全長(zhǎng)蛋白質(zhì)及其片段均包含在該定義內(nèi)。該術(shù)語(yǔ)還包含多肽的表達(dá)后修飾，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等等。進(jìn)一步地，如本文所用，“多肽”指一種包含對(duì)原生序列所做的各種修飾(例如刪除、添加和取代(通常是保守性的))的蛋白質(zhì)，前提是該蛋白質(zhì)保持所需的活性。這類(lèi)多肽在本文中可稱(chēng)為“突變體”。這些修飾可以是刻意的，如通過(guò)定點(diǎn)誘變進(jìn)行修飾；或者可以是非刻意的，例如通過(guò)在宿主體內(nèi)發(fā)生突變而產(chǎn)生蛋白質(zhì)或者由于PCR擴(kuò)增發(fā)生錯(cuò)誤而導(dǎo)致的修飾。如本文所用，“變異體”、“類(lèi)似物”或者“衍生物”是一種與給定的化合物(例如肽)相比，具有大于約70％但小于100％的序列相似度的化合物(例如肽)。這類(lèi)變異體、類(lèi)似物或者衍生物可以由非天然存在的氨基酸殘基(作為例子包括但不僅限于高精氨酸、鳥(niǎo)氨酸、青霉胺和正纈氨酸)以及天然存在的氨基酸殘基組成。這類(lèi)變異體、類(lèi)似物或者衍生物還可以由一種或者多種D-氨基酸殘基組成，以及可以包含兩種或者兩種以上氨基酸殘基之間的非肽連接部分。如本文所用，PAL多肽(例如AvPAL)和水溶性聚合物(例如聚乙二醇或者PEG)的“比率”指該P(yáng)AL多肽和該水溶性聚合物之間的反應(yīng)條件摩爾比。例如，AvPAL和聚乙二醇約1:3的比率(1:3AvPAL：PEG)指在如下的反應(yīng)條件下產(chǎn)生化學(xué)修飾的PAL：每3mol的聚乙二醇配比AvPAL上的約1mol賴(lài)氨酸殘基。因?yàn)锳vPAL單體具有18個(gè)賴(lài)氨酸殘基，所以約1:3的AvPAL：PEG比率相當(dāng)于在聚乙二醇化反應(yīng)中1molAvPAL/54molPEG。下文實(shí)施例6中所描述的反應(yīng)條件下，約1:3AvPAL：PEG的比率產(chǎn)生約10-12molPEG/molAvPAL單體。如本文所用，“治療”指預(yù)防性治療或者治療性治療(therapeutictreatment)或者診斷性治療?！邦A(yù)防性”治療是對(duì)未表現(xiàn)出疾病或病理(即癌癥)跡象或者只表現(xiàn)出早期跡象的對(duì)象采用的以降低病理發(fā)展風(fēng)險(xiǎn)為目的的治療。本文提供的包含制劑的所述原核PAL組合物可以作為預(yù)防性治療提供，以降低病理(即癌癥)發(fā)展的可能性；或者在病理發(fā)展的情況下提供以盡量降低病理的嚴(yán)重程度?！爸委熜浴敝委熓窍虮憩F(xiàn)出病理(即癌癥)跡象或者癥狀的對(duì)象采用的以減少或消除這些跡象或者癥狀為目的的治療。該跡象或癥狀可以是生化、細(xì)胞、組織、功能、主觀或客觀方面的。該原核PAL組合物可作為治療性治療提供或者用于診斷。“診斷”指識(shí)別病理狀況(即癌癥)的存在或者性質(zhì)。診斷方法的特異性和選擇性各不相同。一個(gè)具體的診斷方法可能不會(huì)提供對(duì)病情的明確診斷，但是如果該方法提供了積極的有助于診斷的啟示，那就足夠了?！八幬锝M合物”指一種適于作為藥物用于動(dòng)物對(duì)象(包含人類(lèi)和哺乳動(dòng)物)的組合物。藥物組合物包括藥理學(xué)上有效量的原核PAL多肽，還包括藥學(xué)上可接受的載體。藥物組合物指包括有效成分、構(gòu)成載體的惰性成分和由如下途徑產(chǎn)生的任何產(chǎn)品的組合物：直接或者間接地產(chǎn)自任何兩種或者兩種以上成分的組合、絡(luò)合或者聚集；或者產(chǎn)自一種或者多種成分的分解反應(yīng)；或者產(chǎn)自一種或者多種成分的其他類(lèi)型的反應(yīng)或者相互作用。相應(yīng)地，該藥物組合物包含通過(guò)混合本文提供的原核PAL多肽與藥學(xué)上可接受的載體而制得的任何組合物。“藥學(xué)上可接受的載體”指任何標(biāo)準(zhǔn)的藥物賦形劑、溶媒、稀釋液、穩(wěn)定劑、防腐劑、增溶劑、乳化劑、佐劑和/或載體(例如，作為舉例但不僅限于，磷酸鹽緩沖鹽水、5％的右旋糖水溶液和乳劑，如油/水或者水/油乳劑)以及各種類(lèi)型的潤(rùn)濕劑和/或佐劑。合適的藥物載體和制劑的描述見(jiàn)于Remington’sPharmaceuticalSciences,19thEd.(MackPublishingCo.,Easton,1995)。待用的藥物載體可以取決于預(yù)期的活性劑給藥方式。典型的給藥方式包括腸(例如口腔)或者腸胃外(例如皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)或者腹膜內(nèi)注射；或者局部、經(jīng)皮或者透粘膜給藥)?！八帉W(xué)上可接受的鹽”是可以配制為原核PAL變異體組合物用作藥物的鹽，其包括，例如金屬鹽(鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽等等)以及氨鹽或者有機(jī)胺鹽。“藥學(xué)上可接受的”或者“藥理學(xué)上可接受的”指從生物學(xué)上或者其他方面來(lái)講，材料不是不良的，也就是說(shuō)，該材料可以施用至個(gè)體，而不會(huì)產(chǎn)生任何不良的生物效果或者以任何有害的方式，與包含該材料的組合物中的任何組分相互作用。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“單位劑型”指物理上分離的單位，其適于作為用于人類(lèi)和動(dòng)物對(duì)象的單位劑量，每個(gè)單位包含結(jié)合有藥學(xué)上可接受的稀釋液、載體或者溶媒的預(yù)定量的原核PAL變異體，所述預(yù)定量是經(jīng)計(jì)算能足以產(chǎn)生所需效果的量。新型單位劑型的規(guī)格可取決于所采用的具體的原核PAL變異體和要實(shí)現(xiàn)的效果；以及宿主中與每種原核PAL變異體有關(guān)的藥效?！吧韕H”或者“生理范圍內(nèi)的pH”指包含在大約7.2至8.0范圍內(nèi)，更通常的情況下，包含在大約7.2至7.6范圍內(nèi)的pH。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“對(duì)象”包含哺乳動(dòng)物和非哺乳動(dòng)物。哺乳動(dòng)物的例子包括但不僅限于哺乳動(dòng)物類(lèi)的任何一員：人類(lèi)、非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物(例如黑猩猩以及其他猿類(lèi)和猴類(lèi))；農(nóng)用動(dòng)物，例如牛、馬、綿羊、山羊、豬；家養(yǎng)動(dòng)物，例如兔、狗和貓；實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物，包括嚙齒類(lèi)動(dòng)物(例如大鼠、小鼠和豚鼠)；以及諸如此類(lèi)。非哺乳動(dòng)物的例子包括但不僅限于鳥(niǎo)類(lèi)、魚(yú)類(lèi)等等。該術(shù)語(yǔ)不表示具體的年齡或者性別。B.原核PAL變異體對(duì)特定大分子的可靠三維結(jié)構(gòu)或者結(jié)構(gòu)模型的闡明使得有可能進(jìn)行合理的設(shè)計(jì)，以形成一種用于優(yōu)化所述大分子的具體結(jié)構(gòu)和/或功能的有效方法。利用三維結(jié)構(gòu)或者結(jié)構(gòu)模型來(lái)優(yōu)化PAL酶的方法在2005年9月19日提交的申請(qǐng)?zhí)枮?1/230,374的現(xiàn)有共同待審的美國(guó)專(zhuān)利中有描述，該專(zhuān)利以引用方式全部并入本文。原核PAL的高分辨三維蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)可用于涉及蛋白質(zhì)工程的方法，以改善原核PAL的生物化學(xué)和生物物理特性，以及提高原核PAL的活體內(nèi)療效。本文提供與野生型原核PAL相比，具有較大的苯丙氨酸轉(zhuǎn)化活性和/或降低的免疫原性的原核PAL變異體。本文還提供，與野生型原核PAL相比，具有較大的生化穩(wěn)定性和/或生化半衰期的原核PAL變異體。已有先前實(shí)驗(yàn)描述了修飾形式的PAL，例如PAL突變體(Schuster,等人,FEBSLett.349(2):252-254(1994)；Schuster,等人,ProcNatlAcadSciUSA92(18):8433–8437(1995)；Langer,等人,Biochemistry36:10867-10871(1997)；El-Batal,等人,ActaMicrobiolPol.49(1):51-61(2000)；等人,Eur.J.Biochem.269:3065-3075(2002))以及HAL突變體(Taylor,等人,J.Biol.Chem.269(44):27473-27477(1994)；Baedeker,等人,Eur.J.Biochem.269(6):1790-1797(2002))。具有增強(qiáng)的催化活性的原核PAL變異體本文提供的野生型PAL的生物活性位點(diǎn)可以進(jìn)行修飾，以?xún)?yōu)化PAL動(dòng)力學(xué)特性。提供的活性是最大值一半時(shí)的底物濃度Km與PAL在將Phe水平保持在可接受的范圍內(nèi)(即120μM至240μM)方面的療效密切相關(guān)。Km是酶對(duì)底物的親和力。通過(guò)控制親和力，人們可以限制或者控制任何酶對(duì)不同濃度的底物的效力。例如，如果Km是1000μM(例如來(lái)自圓紅冬孢酵母菌的PAL)，當(dāng)血液Phe水平為240μM時(shí)酶的活性將降至約12.5％以及當(dāng)血液Phe水平為60μM時(shí)，酶的活性將降至約3％。如果Km是240μM，當(dāng)血液Phe水平為240μM時(shí)，酶的活性將降至約50％以及當(dāng)血液Phe水平為60μM時(shí)，酶的活性將降至約12％。如果Km是120μM，當(dāng)血液Phe水平為240μM時(shí)，酶的活性將降至約70％以及當(dāng)血液Phe水平為60μM時(shí)，酶的活性將降至約35％。最佳情況下，治療目的將是具有的酶有足夠的活性來(lái)降低Phe同時(shí)將其維持在約120μM至約240μM的最佳范圍內(nèi)。具有高Km(即1000μM)的酶隨著Phe水平降至正常范圍內(nèi)會(huì)很快失去活性以及還會(huì)需要高濃度或者大量的劑量給藥，這是不切實(shí)際的。另一方面，具有太低Km的酶可以迅速地降低Phe水平，這對(duì)高苯丙氨酸血癥可能是致命的，但對(duì)管控癌癥卻可能是有用的。在一些實(shí)施方式中，生物活性修飾的PAL具有至少約0.1s-1或者大于約0.5s-1的kcat。在其他的實(shí)施方式中，生物活性修飾的PAL具有至少約0.2s-1或者大于約1.0s-1的kcat。在其他的實(shí)施方式中，生物活性修飾的PAL具有約10μM至約1000μM之間的Km。在其他的實(shí)施方式中，生物活性修飾的PAL具有約100μM至約1000μM之間的Km。在其他的實(shí)施方式中，生物活性修飾的PAL顯示出的酶催活性比野生型的高約2倍至約1000倍。在其他的實(shí)施方式中，生物活性修飾的PAL顯示出的酶催活性比野生型的高約10％至約100％。這類(lèi)生物活性修飾的PAL蛋白質(zhì)可以利用本領(lǐng)域熟知的方法(例如通過(guò)定點(diǎn)誘變)形成。除了H83和E414(其分別被纈氨酸和谷氨酸殘基取代)之外，HAL中全部的活性位點(diǎn)殘基均顯示存在于EncP中(Xiang，L.,等人，J.Biol.Chem.277:32505-32509(2002))。HAL中H83在結(jié)合和定位活性位點(diǎn)上L-組氨酸的咪唑部分以及固定酶結(jié)合陽(yáng)離子中間體方面的作用已有研究(Xiang,等人，J.Bacteriology187(12):4286-4289(2005)；Xiang,等人，J.Bacteriology188(14):5331(2006))。有人提出，E414的羧酸鹽基團(tuán)可在催化反應(yīng)中用作堿。在這項(xiàng)研究中，通過(guò)定點(diǎn)誘變生成了EncP突變體，以評(píng)估通過(guò)EncP形成肉桂酸時(shí)V83的貢獻(xiàn)。用組氨酸取代纈氨酸生成了突變體V83H，其以喪失PAL活性為特征。用丙氨酸取代纈氨酸產(chǎn)生了突變體V83A，其活性高于野生型EncPV83A，但是相比野生型酶23μM的Km，其Km為120μM，對(duì)L-苯丙氨酸的親和力略低。然而，與野生型EncP相比，V83A具有更高的kcat以及比野生型酶具有更高活性。具有降低的免疫原性的原核PAL變異體目前采用了許多策略來(lái)降低蛋白質(zhì)免疫原性。在某些實(shí)施方式中，為達(dá)到免疫響應(yīng)最小化而引入的修飾不破壞大分子的結(jié)構(gòu)、功能或者穩(wěn)定性。所用的有效策略包括增加人類(lèi)序列量(嵌合體和/或其他“人性化”方法)、改善溶液性質(zhì)、移除抗體表位、引入化學(xué)衍生化(例如聚乙二醇化)和/或識(shí)別和移除MHC限制位。對(duì)于注射治療，活體內(nèi)免疫反應(yīng)性可以通過(guò)如下途徑來(lái)解決：執(zhí)行表位作圖，接著通過(guò)理性突變來(lái)修飾免疫原性的諸多位點(diǎn)和/或以其他方式使這些位點(diǎn)變異，單獨(dú)地以及結(jié)合有位點(diǎn)特異性聚乙二醇化(Hershfield,等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:7185-7189(1991)；Leong,等人,Cytokine16(3):106-119(2001)；Lee,等人,Pharm.Res.20(5):818-825(2003))或者其他的化學(xué)衍生方法，以將蛋白質(zhì)免疫反應(yīng)性降至可接受的水平。對(duì)抗原表面蛋白質(zhì)區(qū)域的修飾降低免疫原性(Chirino,等人,DrugDiscov.Today9(2):82-90(2004))。一種改進(jìn)的方法涉及構(gòu)建尺寸較小的保留催化活性的蛋白質(zhì)(例如，用吸光度法測(cè)量活性)。還可以將蛋白質(zhì)工程與ELISA篩選聯(lián)系起來(lái)，用以識(shí)別具有降低的免疫反應(yīng)性的突變體。另一方法引入針對(duì)其他表面Lys位點(diǎn)的點(diǎn)突變，進(jìn)行聚乙二醇化衍生反應(yīng)，一種顯示用測(cè)試酶嘌呤核苷磷酸化酶來(lái)降低免疫原性的方法(Hershfield,等人(1991),出處同上)。替代性的途徑利用位于蛋白質(zhì)抗原表位區(qū)域的殘基突變來(lái)移除免疫原性位點(diǎn)(Yeung,等人,J.Immunol.172(11):6658-6665(2004))。在一種類(lèi)似物抗體人源化的方法中，將來(lái)自人類(lèi)抗體的同源環(huán)區(qū)和/或殘基替換為同源蛋白質(zhì)的相應(yīng)環(huán)區(qū)。改善蛋白質(zhì)的溶液性質(zhì)可以提高酶比活和/或降低免疫原性。細(xì)菌表達(dá)重組蛋白質(zhì)特有的一個(gè)溶液性質(zhì)是由于，例如鏈間二硫鍵形成、疏水作用和/或二價(jià)陽(yáng)離子而形成蛋白質(zhì)聚集體(Chi,等人,Pharm.Res.20(9):1325-1336(2003))。重組表達(dá)蛋白質(zhì)的聚集能夠提高免疫響應(yīng)(Hermeling,等人,Pharm.Res.21(6):897-903(2994)；Schellekens,Nephrol.Dial.Transplant.20(suppl6):vi3-9(2005))。一種改善方法涉及用其他的氨基酸殘基(例如絲氨酸)取代表面半胱氨酸殘基，以盡量減小形成鏈間二硫鍵的可能性。例如，用絲氨酸殘基取代兩種表面半胱氨酸殘基使分支酸裂合酶的聚集對(duì)酶活性的影響變得較小(Holden,等人,Biochim.Biophys.Acta1594(1):160-167(2002))。本文提供原核PAL變異體，其一種或者多種半胱氨酸殘基被其他的氨基酸殘基，例如絲氨酸殘基取代。在一些實(shí)施方式中，原核PAL的一種或者多種半胱氨酸殘基被其他的氨基酸殘基取代。在某些實(shí)施方式中，該原核PAL是AvPAL。在特定的實(shí)施方式中，AvPAL的一種或者多種半胱氨酸殘基被半胱氨酸殘基取代。C.化學(xué)修飾的原核PAL變異體大分子化學(xué)修飾可以非特異性方式(產(chǎn)生衍生化物種的混合物)或者以位點(diǎn)特異性方式(基于野生型大分子反應(yīng)活性導(dǎo)向的衍生化作用和/或利用定點(diǎn)誘變和化學(xué)修飾的組合的位點(diǎn)選擇性修飾)或者，替代性地，利用表達(dá)蛋白質(zhì)連接方法來(lái)執(zhí)行(Hofmann,等人,Curr.Opin.Biotechnol.13(4):297-303(2002))。在某些實(shí)施方式中，利用化學(xué)修飾來(lái)降低免疫原性。聚乙二醇化是一種得到論證的降低蛋白質(zhì)免疫原性的方法(Bhadra,等人,Pharmazie57(1):5-29(2002))，但利用磷酸化作用、酰胺化作用、羧化作用、乙?；饔?、甲基化作用、生成酸加鹽類(lèi)、酰胺類(lèi)、酯類(lèi)和N-?；苌镞M(jìn)行修飾的糖基化以及其他化學(xué)衍生程序也是可能的降低蛋白質(zhì)免疫原性的方法(Davis,Science303:480-482(2004))。聚乙二醇化的蛋白質(zhì)利用各種PEG化學(xué)試劑與PAL蛋白質(zhì)的比率在PAL上進(jìn)行的一系列不同的聚乙二醇化反應(yīng)將為每種修飾方法提供PEG-PAL衍生物。最佳程度的聚乙二醇化可以基于利用吸光度法結(jié)合PAGE和非變性凝膠分析法或者通過(guò)利用具有多角度光散射(MALS)的SE-HPLC測(cè)得的每種衍生化的PAL物種獲得的剩余活度來(lái)確定，以確定PEG衍生化作用的程度。最佳修飾的最初范圍確定后，最佳PEG-PAL物種的比較動(dòng)力學(xué)分析(包含Vmax和Km確定、底物的結(jié)合常數(shù)、蛋白水解穩(wěn)定性、活性的pH依賴(lài)性、活性的溫度依賴(lài)性)和免疫反應(yīng)性可以通過(guò)ELISA、免疫沉淀反應(yīng)和Westernblot來(lái)確定。蛋白質(zhì)工程還可用來(lái)通過(guò)利用最佳的衍生化條件生成最有利于聚乙二醇化的PAL突變體；通過(guò)盡量減小PAL蛋白質(zhì)的大小以及僅僅修飾PAL表面最具抗原性的區(qū)域?qū)?huì)降低PEG修飾的成本，與此同時(shí)保留最大量的酶催活性以及最小量的免疫原性。同樣地，位點(diǎn)特異性聚乙二醇化作用可用來(lái)提供酶類(lèi)衍生物。其他的化學(xué)修飾，例如Lys、Arg和Cys殘基的磷酸化作用或其他化學(xué)修飾可用來(lái)掩蓋免疫原性區(qū)域和/或蛋白水解敏感性區(qū)域。這類(lèi)化學(xué)修飾包括Bednarsaki的聚合物添加法(polymeradditionmethod)以及用于改善PAL穩(wěn)定性、降低免疫原性和改善蛋白酶抗性的AltusCorporation的交聯(lián)法是具有代表性的例子。Bednarsaki論證了聚合物添加能改善蛋白質(zhì)的溫度穩(wěn)定性(Wang,等人,J.Am.Chem.Soc.114(1):378-380(1992))，以及AltusCorporation已發(fā)現(xiàn)戊二醛交聯(lián)能改善酶的穩(wěn)定性。為確定蛋白質(zhì)(例如PAL)的活體內(nèi)治療半衰期是否得益于聚乙二醇化作用，合成了多種不同的PEG:PAL共軛物，并對(duì)其進(jìn)行活體外表征以及活體內(nèi)L-Phe降低檢測(cè)。為了達(dá)到優(yōu)化聚乙二醇化潛在影響以及識(shí)別PEG附著的一個(gè)或者多個(gè)位點(diǎn)這兩個(gè)目的，采用了一種設(shè)計(jì)策略，其中聚合物長(zhǎng)度、構(gòu)象以及PEG附著的程度各有不同。在一些實(shí)施方式中，用于制備聚乙二醇化的PAL的方法通常包括：(a)在各種條件下使PAL與聚乙二醇反應(yīng)，借以使PAL附著至一種或者多種PEG基團(tuán)，以及(b)獲得反應(yīng)產(chǎn)物。因?yàn)镻AL修飾的特異性位點(diǎn)可能極大地改變共軛物的內(nèi)在活性，所以探究了不同類(lèi)型和數(shù)量的PEG。用于PAL聚乙二醇化的化學(xué)反應(yīng)是利用甲氧基-PEG(O-[(N-琥珀酰亞胺基氧基羰基)-甲基]-O’-甲基聚乙二醇)的NHS酯對(duì)PAL的伯胺進(jìn)行?；磻?yīng)。利用甲氧基-PEG-NHS或者甲氧基-PEG-SPA的?；磻?yīng)產(chǎn)生酰胺鍵，所述酰胺鍵消除原伯胺上的電荷。本申請(qǐng)的方法提供聚合物：蛋白質(zhì)共軛物的大體上均質(zhì)的混合物。如本文所用，“大體上均質(zhì)”指觀察到的僅僅是聚合物：蛋白質(zhì)共軛物分子。該聚合物：蛋白質(zhì)共軛物具有生物活性以及本申請(qǐng)?zhí)峁┑摹按篌w上均質(zhì)的”聚乙二醇化的PAL制劑是那些足夠均質(zhì)以表現(xiàn)出均質(zhì)制劑優(yōu)勢(shì)(例如，在臨床應(yīng)用中易于預(yù)測(cè)批與批之間的藥代動(dòng)力學(xué))的制劑。涉及用于本文所述的聚乙二醇化方法的聚合物分子可以選自水溶性聚合物或者其混合物。水溶性聚合物可以選自如下：例如，聚乙二醇、單甲氧基-聚乙二醇、葡聚糖、聚-(N-乙烯基吡咯烷酮)、丙二醇均聚物、聚環(huán)氧丙烷/環(huán)氧乙烷共聚物、聚氧乙烯多元醇(例如甘油)、HPMA、Fleximer.TM.和聚乙烯醇、單-(C1-C10)烷氧基-PEG、芳氧基-PEG、三氟乙烷磺?；鶈渭籽趸鵓EG、PEG丙醛、二琥珀酰亞胺碳酸酯PEG、纖維素或者其他基于碳水化合物的聚合物。所選定的聚合物應(yīng)該是水溶性的，以便附著有該聚合物的蛋白質(zhì)不會(huì)在水相環(huán)境(例如生理環(huán)境)中沉淀。該聚合物可以是支化或者非支化的。在一些實(shí)施方式中，為了實(shí)現(xiàn)終產(chǎn)物制劑的治療用途，該聚合物將是藥學(xué)上可接受的。在一些實(shí)施方式中，此處所用的水溶性聚合物是聚乙二醇，縮寫(xiě)為PEG。如本文所用，聚乙二醇意在包含已用于使其他蛋白質(zhì)衍生化的任何形式的PEG，例如單-(C1-C10)烷氧基-或者芳氧基-聚乙二醇。聚乙二醇分子與蛋白質(zhì)分子的比例將隨著它們?cè)诜磻?yīng)混合物中濃度的變化而變化。通常情況下，最佳比率(從反應(yīng)效率來(lái)說(shuō)，沒(méi)有過(guò)量的未反應(yīng)的蛋白質(zhì)或聚合物)將通過(guò)選定的聚乙二醇的分子量以及基于存在的可用的反應(yīng)基團(tuán)(通常是ε氨基基團(tuán))的數(shù)量來(lái)確定。通常情況下，所用聚合物的分子量越高，可附著至蛋白質(zhì)的聚合物分子的數(shù)量越少。同樣地，當(dāng)對(duì)這些參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化時(shí)，可以考慮對(duì)聚合物進(jìn)行支化。通常，分子量越高(或者支鏈越多)，聚合物：蛋白質(zhì)比率越高。還涉及幾種不同的直鏈PEG聚合物長(zhǎng)度，包含但不僅限于5kDa和20kDa的兩臂支化PEG聚合物的共軛物，包含但不僅限于10kDa和40kDa。在一些實(shí)施方式中，對(duì)于本文涉及的聚乙二醇化反應(yīng)，平均分子量為約2kDa至約100kDa(術(shù)語(yǔ)“約”指+/-1kDa)。在其他的實(shí)施方式中，平均分子量為約5kDa至約40kDa。水溶性聚合物與PAL的比率范圍通常對(duì)于單聚乙二醇是1:1；對(duì)于二聚乙二醇是2:1；等等。聚乙二醇化的原核PAL變異體共同擁有的美國(guó)專(zhuān)利7,531,341(該專(zhuān)利以引用方式全部并入本文)的實(shí)施例7到9描述了來(lái)自圓紅冬孢酵母菌(RtPAL)、NpPAL和AvPAL的聚乙二醇化和非聚乙二醇化形式的賴(lài)氨酸突變體R91KPAL對(duì)ENU2或者BTBRenu2小鼠體內(nèi)Phe水平的影響。該動(dòng)物模型是PAH部位的純合突變體，導(dǎo)致動(dòng)物具有重度高苯丙氨酸血癥。高血漿Phe水平使得該動(dòng)物成為用于評(píng)估PAL降低血漿Phe的能力的合適模型。分別與非聚乙二醇化的NpPAL和AvPAL相比，聚乙二醇化形式的NpPAL和AvPAL的施用更多地降低了ENU2小鼠體內(nèi)的Phe。在十周的時(shí)間段內(nèi)，經(jīng)過(guò)每周注射維持了NpPAL的這些效果。這些結(jié)果顯示，來(lái)自藍(lán)細(xì)菌、點(diǎn)形念珠藻和多變魚(yú)腥藻的PAL的聚乙二醇化在降低罹患PKU小鼠體內(nèi)的Phe水平方面是至關(guān)重要的。本文實(shí)施例14描述了AvPAL多肽中半胱氨酸殘基(例如位置503和565上的半胱氨酸殘基)的絲氨酸取代對(duì)ENU2小鼠體內(nèi)Phe水平的影響。施用聚乙二醇化的AvPAL雙半胱氨酸突變體AvPAL_C565SC503S導(dǎo)致的血漿Phe的減少量與利用聚乙二醇化的野生型AvPAL實(shí)現(xiàn)的減少量相當(dāng)。此外，與聚乙二醇化的野生型AvPAL相比，注射有聚乙二醇化的AvPAL變異體的動(dòng)物體內(nèi)抗PAL抗體滴度較低。這些結(jié)果顯示，聚乙二醇化的AvPAL變異體具有(1)與該聚乙二醇化的野生型AvPAL相當(dāng)?shù)幕铙w內(nèi)PAL酶活性；以及(2)具有比該聚乙二醇化的野生型AvPAL低的免疫原性。本文提供具有降低的免疫原性的聚乙二醇化的PAL變異體。一個(gè)實(shí)施方式是具有降低的免疫原性的聚乙二醇化形式的NpPAL變異體。另一實(shí)施方式是具有降低的免疫原性的聚乙二醇化形式的AvPAL變異體。具體的實(shí)施方式涉及NpPAL或者AvPAL變異體，其中聚乙二醇化通過(guò)使NpPAL或者AvPAL變異體與水溶性聚合物，例如聚乙二醇(PEG)反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)。在一些實(shí)施方式中，聚乙二醇化通過(guò)使NpPAL或者AvPAL變異體與PEG按至少1:1、至少1:1.5、至少1:2、至少1:3或者至少1:4的PAL：PEG比率反應(yīng)一次來(lái)實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)實(shí)施方式中，該P(yáng)AL變異體是AvPAL變異體，以及聚乙二醇化利用1:3的PAL：PEG比率來(lái)實(shí)現(xiàn)。本文還提供用于制備聚乙二醇化的PAL變異體的方法。在某些實(shí)施方式中，在原核PAL變異體的活性位點(diǎn)上和/或其附近引入一種或者多種賴(lài)氨酸殘基，以部分地通過(guò)阻斷該酶的活性位點(diǎn)上和/或其附近其他氨基酸殘基(例如酪氨酸)的潛在聚乙二醇化或者通過(guò)阻斷對(duì)酶活性具有重要性的賴(lài)氨酸殘基的潛在聚乙二醇化來(lái)提高催化活性、降低免疫原性和/或改善生化穩(wěn)定性。不受限于特定的理論，假定原核PAL的活性位點(diǎn)(即AvPAL中的位置78或者314)上和/或其附近的酪氨酸殘基可以是用于聚乙二醇化的位點(diǎn)，其降低了酶活性。在一些實(shí)施方式中，該原核PAL的活性位點(diǎn)上和/或其附近的一種或者多種不為酶活性所需的氨基酸殘基由賴(lài)氨酸殘基取代。在某一實(shí)施方式中，該原核PAL是AvPAL。在一個(gè)實(shí)施方式中，位置78或者314上的AvPAL酪氨酸殘基不可用于聚乙二醇化。再次不受限于特定的理論，假定原核PAL(即AvPAL中的位置419)的賴(lài)氨酸殘基(其聚乙二醇化通常因臨近的賴(lài)氨酸殘基PAL(即AvPAL中的位置413)的聚乙二醇化而受到阻斷)可以是用于聚乙二醇化的位點(diǎn)，其降低了底物結(jié)合和/或催化活性。在一些實(shí)施方式中，該原核PAL的一種或者多種氨基酸殘基由賴(lài)氨酸殘基取代，使得對(duì)該酶的底物結(jié)合和/或催化活性具有重要性的賴(lài)氨酸殘基不可用于聚乙二醇化。在具體的實(shí)施方式中，該原核PAL是AvPAL。在一個(gè)實(shí)施方式中，位置419上的AvPAL賴(lài)氨酸殘基不可用于聚乙二醇化。D.原核PAL變異體的治療用途和給藥1.各種形式的高苯丙氨酸血癥(HPA)本文提供治療各種HPA患者群的方法，該方法包括單獨(dú)利用原核PAL變異體組合物或者結(jié)合其他治療方案來(lái)管控HPA和/或PKU。具體地涉及如下：原核PAL變異體組合物可用于治療苯丙氨酸濃度足夠低使得通常不采用膳食干預(yù)的患者群(即輕度HPA患者)、中度PKU患者、典型或者重度PKU患者以及任何其亞群。對(duì)用原核PAL變異體組合物進(jìn)行的治療具有依從性以改善輕度HPA影響的這類(lèi)患者包括血清濃度小于200μM的孕婦和嬰幼兒。本節(jié)進(jìn)一步詳細(xì)地討論了各種患者群及其不同的治療需求。某些實(shí)施方式涉及通過(guò)結(jié)合包括原核PAL變異體或者其生物活性變異體、突變體或片段的組合物，向?qū)ο笫┯孟薜鞍踪|(zhì)飲食來(lái)治療典型重度PKU，其中該限蛋白質(zhì)飲食和原核PAL變異體的聯(lián)合施用使得所述對(duì)象的血漿內(nèi)苯丙氨酸濃度與不進(jìn)行所述聯(lián)合施用時(shí)的所述濃度相比得到有效的降低。此外，提供治療患有HPA的孕婦的方法，該方法包括結(jié)合原核PAL變異體或者其生物活性衍生物，向該孕婦施用限蛋白質(zhì)飲食，以便該限蛋白質(zhì)飲食和原核PAL變異體的聯(lián)合施用使得該孕婦血漿內(nèi)的苯丙氨酸濃度與不進(jìn)行所述聯(lián)合施用時(shí)這樣的濃度相比得到有效的降低。在具體的實(shí)施方式中，為表現(xiàn)的Phe水平大于420μM的患者設(shè)計(jì)療法。其他的實(shí)施方式需要向任何患有HPA的個(gè)體施用原核PAL變異體組合物，其中所述HPA的特點(diǎn)是在施用原核PAL變異體之前血漿Phe濃度大于180μM以及按能導(dǎo)致該患者的這類(lèi)血漿Phe濃度下降的有效量給藥。本文提供的方法還可用于通過(guò)利用本文所述的原核PAL變異體組合物來(lái)治療患有以大于300μM的高Phe濃度為特征的PKU的未成年對(duì)象。“未成年對(duì)象”指0到約36個(gè)月之間的患者。重度典型PKU的特點(diǎn)及其治療方法重度PKU表現(xiàn)在血漿Phe濃度大于1200μM以及有發(fā)現(xiàn)表明，該濃度高至4800μM?；加羞@種疾病的患者必須進(jìn)行不含Phe的食療，以便將其血漿Phe濃度降至臨床上可接受的水平(通常小于600μM或者小于300μM)。這些患者僅能容許每日最多250-350mg之間的Phe攝入(Spaapen等人,Mol.GenetMetab.78:93-99(2003))。就此而言，這類(lèi)患者自出生后7-10天之間開(kāi)始按限Phe的配方進(jìn)食以及終生將受累于這種飲食限制。為緩解嚴(yán)格飲食限制獲得的任何成果對(duì)受累于此的群體來(lái)說(shuō)將是一份福祉。下文進(jìn)一步詳細(xì)地描述了用于診斷患有典型Phe的個(gè)體的檢測(cè)。這些檢測(cè)已表明，典型重度PKU患者需要低苯丙氨酸飲食(Lucke等人，Pediatr.Neurol.28:228-230(2003))。因此，考慮到的是，本文提供的某些方法將需要通過(guò)監(jiān)測(cè)個(gè)體的血漿Phe濃度來(lái)確定該個(gè)體是否是典型PKU患者。然后可以通過(guò)單獨(dú)地施用原核PAL變異體組合物或者實(shí)施低蛋白質(zhì)飲食和PAL變異體的聯(lián)合方案來(lái)治療該患者，使得該患者的血漿Phe濃度產(chǎn)生至少25％的降幅。在一些實(shí)施方式中，該方法將產(chǎn)生30％的血漿Phe濃度降幅。在其他的實(shí)施方式中，該方法將產(chǎn)生40％、50％、60％、70％、80％、90％或者更大的個(gè)體血漿Phe濃度降幅(例如，其中重度典型PKU患者的Phe濃度為4800μM，Phe濃度的90％降幅將產(chǎn)生480μM的血漿Phe濃度，此濃度足夠低，以至于幾乎不需要飲食限制)。當(dāng)然，應(yīng)理解的是，本文提供的治療方法，不論是用于治療重度典型PKU還是本文所述的任何其他HPA，都應(yīng)嘗試將患者的血漿Phe濃度降至盡可能靠近約120μM至約360μM±15μM的范圍或者約120μM至約240μM的最佳范圍的水平。在一些實(shí)施方式中，正在接受治療的典型PKU患者的血漿Phe濃度從大于1000μM的任何量的不受限的血漿Phe濃度降至小于600μM的任何血漿Phe水平。當(dāng)然，即使原核PAL變異體和限蛋白質(zhì)飲食的聯(lián)合治療產(chǎn)生的血漿Phe濃度降幅較小，例如降至800μM至約1200μM之間的水平，這仍將被視作臨床上有用的治療成果，因?yàn)檠獫{Phe濃度在這個(gè)范圍內(nèi)的患者通過(guò)簡(jiǎn)單地限制飲食中蛋白質(zhì)的量便可管控其病情，而無(wú)需按照限Phe的配方進(jìn)食，從而顯著地改善個(gè)體的生活質(zhì)量以及提高患者對(duì)飲食限制的依從性。患者由于治療可以容許的飲食中Phe水平的任何增量將視為治療有效的成果。例如，考慮到的是，由于接受了原核PAL變異體療法，患者將能夠?qū)⑵滹嬍持蠵he的攝入量從250-350mg/日提高至350-400mg/日(即患者的Phe容許表型從典型PKU患者的Phe容許表型變?yōu)橹卸萈KU患者的Phe容許表型)。當(dāng)然，本文教導(dǎo)的治療干預(yù)將有望允許患者將其飲食中Phe的攝入量從250-350mg/日提高至400-600mg/日(即患者的Phe容許表型從典型PKU患者的Phe容許表型變?yōu)檩p度PKU患者的Phe容許表型)或者在有些情況下，將有望允許患者的Phe攝入量大于600mg/日(即正常飲食攝入量)。不對(duì)BH4做出響應(yīng)的PKU患者的特點(diǎn)及其治療方法可以用本文提供的所述組合物和方法治療的第二組患者是那些已確定具有升高的血漿Phe濃度(即任何大于200μM的濃度)但已診斷不對(duì)BH4療法做出響應(yīng)(通過(guò)下文所述的BH4負(fù)荷試驗(yàn)確定)的個(gè)體。這類(lèi)患者可以包括那些患有輕度PKU(即血漿Phe濃度高達(dá)600μM)的個(gè)體、患有中度PKU(即血漿Phe濃度在600μM至約1200μM之間)的個(gè)體以及典型重度PKU(即血漿Phe濃度大于1200μM)患者。在一些實(shí)施方式中，為了降低不對(duì)BH4療法做出響應(yīng)的患者體內(nèi)的血漿Phe濃度，向其施用PAL變異體并結(jié)合以降低其飲食中的蛋白質(zhì)量。施用原核PAL變異體時(shí)產(chǎn)生的患者體內(nèi)血漿Phe濃度的降幅可以比不采用原核PAL變異體療法而施用相同的飲食方案時(shí)產(chǎn)生的所述降幅大。飲食限制可以是這樣一種飲食，其通過(guò)提供含有減少的Phe量的合成醫(yī)用蛋白質(zhì)配方來(lái)限制Phe攝入量；或者替代性地，飲食限制可以是這樣一種飲食，其簡(jiǎn)單地要求患者限制其蛋白質(zhì)攝入總量但仍然允許患者限量進(jìn)食普通食品。討論的針對(duì)典型PKU患者的治療成果以引用方式并入本節(jié)。例如，針對(duì)中度PKU患者(即血漿Phe濃度從600μM至1200μM不受限的患者)的治療成果可以包括該患者體內(nèi)血漿Phe濃度的至少25％的降幅。在一些實(shí)施方式中，該方法將產(chǎn)生血漿Phe濃度的30％降幅。在其他的實(shí)施方式中，該方法將產(chǎn)生個(gè)體的血漿Phe濃度的40％、50％、60％、70％、80％、90％或者更大的降幅(例如，其中中度典型PKU患者的Phe濃度為1000μM，Phe濃度的90％降幅將產(chǎn)生100μM的血漿Phe濃度，此濃度足夠低，以至于幾乎不需要或者無(wú)需飲食限制)。在一些實(shí)施方式中，正在接受治療的中度PKU患者的血漿Phe濃度從600μM至1200μM之間的任何量的不受限的血漿Phe濃度降至小于300μM的任何血漿Phe水平。在一個(gè)實(shí)施方式中，利用原核PAL變異體(單獨(dú)或者結(jié)合飲食限制)進(jìn)行的治療降低了血漿Phe濃度，例如降至200μM至約400μM之間的水平，這仍將被視作臨床上有用的治療成果，因?yàn)檠獫{Phe濃度在這個(gè)范圍內(nèi)的患者通過(guò)簡(jiǎn)單地限制飲食中蛋白質(zhì)的量便可管控其病情，而無(wú)需按照限Phe的配方進(jìn)食。事實(shí)上，許多研究教導(dǎo)說(shuō)，這類(lèi)患者甚至可以正常飲食。患者由于治療可以容許的飲食中Phe水平的任何增量將視為治療有效的成果。例如，考慮到的是，由于接受了原核PAL變異體療法(單獨(dú)或者結(jié)合其他治療干預(yù))，患者將能夠?qū)⑵滹嬍持蠵he的攝入量從350-400mg/日提高至400-600mg/日(即患者的Phe容許表型從中度PKU患者的Phe容許表型變?yōu)檩p度PKU患者的Phe容許表型)。當(dāng)然，本文教導(dǎo)的治療干預(yù)將有望允許患者將其飲食中Phe的攝入量提高至350-400mg/日以上，甚至達(dá)到大于600mgPhe/日的攝入量(即正常飲食攝入量)。僅僅表現(xiàn)出輕度PKU的患者(即飲食許可量為400-600mgPhe攝入量/日)可以利用本文提供的所述組合物和方法來(lái)治療以及可以受益于基于原核PAL變異體的療法，因?yàn)橛型a(chǎn)生近可能接近360μM±15μM的正常的血漿Phe濃度。對(duì)于這類(lèi)患者，有利的治療成果將包括患者血漿Phe濃度的至少25％的降幅。在一個(gè)實(shí)施方式中，該方法將產(chǎn)生血漿Phe濃度的30％降幅。在另一實(shí)施方式中，該方法將產(chǎn)生個(gè)體的血漿Phe濃度的40％、50％、60％或者更大的降幅(例如，其中輕度PKU患者的Phe濃度為600μM，Phe濃度的60％降幅將產(chǎn)生360μM的血漿Phe濃度，即可接受的正常血漿Phe濃度)。在一些實(shí)施方式中，正在接受治療的輕度PKU患者的血漿Phe濃度從400μM至600μM之間的任何量的不受限的血漿Phe濃度降至小于100μM的任何血漿Phe水平。當(dāng)然，即使利用原核PAL變異體(單獨(dú)或者結(jié)合飲食限制)進(jìn)行的治療產(chǎn)生的血漿Phe濃度降幅較小，例如降至200μM至約400μM之間的水平，這仍將被視作臨床上有用的治療成果?；颊哂捎谥委熆梢匀菰S的飲食中Phe水平的任何增量將視為治療有效的成果。例如，考慮到的是，由于接受了原核PAL變異體療法(單獨(dú)或者結(jié)合其他治療干預(yù))，患者將能夠?qū)⑵滹嬍持蠵he的攝入量提高至400-600mg/日以上(即患者的Phe容許表型從輕度PKU患者的Phe容許表型變?yōu)檩p度HPA患者的Phe容許表型)，甚至允許患者的攝入量大于600mgPhe/日(即正常飲食攝入量)。此外，即使患者僅僅表現(xiàn)出非PKU的HPA癥狀(即具有高達(dá)600μM的高血漿Phe濃度，但仍然允許進(jìn)行正常的蛋白質(zhì)飲食)，該患者仍將受益于原核PAL變異體療法，因?yàn)樯叩腜he濃度已顯示對(duì)這類(lèi)群體的智商具有顯著的影響。而且，如下文所討論，具有特殊需求的對(duì)象(例如孕婦和嬰幼兒)的原核PAL變異體治療干預(yù)尤為重要，即使患者的血漿Phe水平在小于200μM這一被視為“安全”水平的范圍內(nèi)。母源性PKU及其治療方法對(duì)患有PKU的計(jì)劃懷孕的成年女子和這類(lèi)孕婦體內(nèi)的血漿Phe水平進(jìn)行代謝控制是很重要的，因?yàn)椴还芴旱腜AH狀態(tài)如何，在子宮內(nèi)胎兒暴露至哪怕中度升高的Phe水平也會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的后果。血漿Phe濃度的治療控制在妊娠的前三個(gè)月尤為重要，因?yàn)槿粑茨軐?shí)現(xiàn)適當(dāng)?shù)目刂疲銜?huì)導(dǎo)致多種疾病，包括小頭畸形、智力缺陷和先天性心臟病。例如，據(jù)關(guān)于苯丙酮尿癥的NIH共識(shí)聲明(卷17#3，2000年10月)報(bào)道，胎兒暴露至3-10mg/dL的母體Phe水平導(dǎo)致24％的小頭畸形發(fā)病率，而那些暴露至大于20mg/dL(即大于1200μM)的胎兒具有73％的小頭畸形發(fā)病率。同樣地，先天性心臟病發(fā)現(xiàn)于超過(guò)10％的曾暴露至大于20mg/dL的母體Phe水平的兒童中。重要的是，已經(jīng)指出大于6mg/dL的Phe水平極大地降低兒童的智力水平。因此，當(dāng)務(wù)之急是確?；加兴行问降谋奖虬Y的成年女子(甚至那些表現(xiàn)出最輕微HPA的成年女子)的血漿Phe濃度必須得到嚴(yán)格控制，以避免母源性PKU綜合征的風(fēng)險(xiǎn)。然而，美國(guó)診所已采用的PKU成年女子血漿Phe濃度的可接受目標(biāo)水平在10mg/dL和15mg/dL之間的范圍內(nèi)，該水平比英國(guó)和德國(guó)診所以降低罹患母源性PKU綜合征風(fēng)險(xiǎn)為目的而推薦孕婦適用的2-6mg/dL水平或者其采用的1-4mg/dL要高得多。為孕婦所做的另一重要考慮是她們的總體蛋白質(zhì)攝入量。妊娠期內(nèi)，成年女子進(jìn)食足夠的蛋白質(zhì)是很重要的，因?yàn)橐延薪虒?dǎo)說(shuō)，妊娠期內(nèi)低蛋白質(zhì)飲食將導(dǎo)致腎臟發(fā)育遲緩和腎單位數(shù)目后續(xù)減少并有可能導(dǎo)致成年后高血壓。(D’Agostino,N.Engl.J.Med.348(17)1723-1724,(2003))。下文的表格為不同的個(gè)體提供示例性的有關(guān)推薦的總飲食蛋白質(zhì)攝入量的指南。美國(guó)飲食蛋白質(zhì)需求指南從上文示例性的指南可以看出，在美國(guó)，育齡成年女子(例如小于51)的推薦蛋白質(zhì)攝入量從約44g/日至50g/日，而孕婦需求的攝入量推薦為約60g/日。在加拿大和英國(guó)，孕婦的推薦蛋白質(zhì)攝入量為約70g/日和52g/日。因此，確保孕婦的血漿Phe濃度水平得到嚴(yán)格控制的需要因這類(lèi)PKU患者比年齡相當(dāng)?shù)奈磻言械腜KU女性需要更多的蛋白質(zhì)這一事實(shí)而進(jìn)一步變得復(fù)雜化。鑒于上述情況，考慮到本文提供的PAL變異體療法將對(duì)孕婦特別有用?？紤]到可以將罹患任何形式的HPA的孕婦或者打算懷孕的女性置于原核PAL變異體療程，以確保維持其血漿Phe濃度水平盡可能地接近180μM至約360μM。這類(lèi)療程將允許她提高其正常蛋白質(zhì)攝入量水平。本申請(qǐng)上文所述的有關(guān)血漿Phe濃度的水平和這類(lèi)Phe濃度應(yīng)得的降幅的討論并入本節(jié)，適用于孕婦。未成年對(duì)象PKU管控及其治療方法如本文全篇所討論，已確定未成年對(duì)象(0至3歲)血漿Phe濃度的上升導(dǎo)致該對(duì)象智商的顯著下降。然而，如已在本說(shuō)明書(shū)其他處所討論的那樣，具有高達(dá)400μM的高血漿Phe濃度的患者通常不接受任何飲食干預(yù)。因此，目前的療法使0至3歲的未成年對(duì)象遭受重大的有害影響。本申請(qǐng)涉及用包括原核PAL變異體的治療組合物來(lái)治療具有大于360μM±15μM的不受限的血漿Phe濃度的任何未成年對(duì)象，以使得該對(duì)象的血漿Phe濃度產(chǎn)生有益的下降。在一些實(shí)施方式中，該未成年對(duì)象的年齡在0到3歲之間并在原核PAL變異體給藥之前具有約1200μM的不受限的血漿Phe濃度，以及所述給藥降低該血漿Phe濃度。在一個(gè)實(shí)施方式中，該血漿Phe濃度在給藥后從大于1800μM降至約1500μM、約1200μM、約1100μM、約1000μM、約900μM、約800μM、約700μM、約600μM、約550μM、約500μM、約450μM、約400μM、約350μM、約300μM、約275μM、約250μM。在其他的實(shí)施方式中，該未成年對(duì)象的年齡在0到3歲之間并具有大于1200μM的不受限的血漿Phe濃度以及，該血漿Phe濃度在原核PAL變異體給藥(單獨(dú)或者結(jié)合有飲食)后降至約800μM、降至約500μM或者降至約360μM。涉及用原核PAL變異體來(lái)治療具有大于360μM的不受限的血漿Phe濃度的未成年對(duì)象以降低所述血漿Phe濃度，對(duì)此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會(huì)理解。上文關(guān)于通過(guò)治療降低血漿Phe濃度的討論以引用方式并入本文。此外，最初不受限的血漿Phe濃度的任何大于10％的降幅將被視作針對(duì)該未成年對(duì)象的治療方案的治療性成果。應(yīng)理解的是，該原核PAL變異體療法可以結(jié)合飲食限制以引起這類(lèi)未成年對(duì)象體內(nèi)血漿Phe濃度的治療性下降。2.其他的治療用途各種形式的癌癥及其治療方法本文還提供治療各種形式的癌癥的方法，該方法包括向?qū)ο笫┯弥委熡行Я康陌ㄔ薖AL變異體的藥物組合物。在一個(gè)寬泛的實(shí)施方式中，該癌癥是這樣一種癌癥，其中衍生自該癌癥的細(xì)胞其增殖和/或存活對(duì)苯丙氨酸的限制或者缺失敏感。在一些實(shí)施方式中，該癌癥是肺癌、腦癌或者中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌癥、結(jié)腸癌、前列腺癌、腎癌、肝癌或者轉(zhuǎn)移性黑素瘤。在其他的實(shí)施方式中，該癌癥是頭頸部癌、卵巢癌、子宮癌、白血病(例如急性骨髓性白血病或者急性成淋巴細(xì)胞性白血病)或者骨髓瘤。在仍然其他的實(shí)施方式中，該癌癥是小兒癌癥或者抗性癌癥(即，已顯示對(duì)癌癥治療劑或者靶向癌癥治療劑有抗性的癌癥)。在某些實(shí)施方式中，提供一種用于治療癌癥的方法，該方法包括向需要這類(lèi)治療的對(duì)象施用治療有效量的包括原核PAL變異體和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物，其中該原核PAL變異體與野生型PAL相比具有較大的苯丙氨酸轉(zhuǎn)化活性和/或降低的免疫原性，以及有效地將該對(duì)象的血液、血清或者血漿中的苯丙氨酸濃度降至從低于檢測(cè)水平到約20μM至60μM之間的范圍，例如小于約20μM或者小于約10μM，以及可選擇地進(jìn)一步包括向該對(duì)象施用限蛋白質(zhì)(即不含苯丙氨酸的)飲食。帕金森氏癥及其治療方法一份有關(guān)Pahenu2小鼠(PKU模型)腦部的詳細(xì)的神經(jīng)病理評(píng)估報(bào)告顯示腦部的兩個(gè)多巴胺能區(qū)域黑質(zhì)(SN)和下丘腦中活化的小膠質(zhì)細(xì)胞或者巨噬細(xì)胞(CD11b+細(xì)胞)在數(shù)量上增加以及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的免疫反應(yīng)性增加(見(jiàn)Embury等人,Pediatr.Res.58:283-287,2005)。在帕金森氏癥(PD)中也觀察到SN中浸潤(rùn)C(jī)D11+細(xì)胞和iNOS上調(diào)的存在。PD和HPA/PKU的另一共同特征是腦部多巴胺的減少，后者的發(fā)生是由于Phe未轉(zhuǎn)化為左旋多巴的前體酪氨酸(Tyr)，而左旋多巴又是多巴胺的前體。此外，PD和PKU均與多巴胺能神經(jīng)元的缺失或者損傷有關(guān)，以及PD以及至少Pahenu2小鼠臨床顯示運(yùn)動(dòng)功能紊亂。本文提供治療PD的方法，該方法包括向?qū)ο笫┯弥委熡行Я康陌ㄔ薖AL變異體的藥物組合物。原核PAL變異體療法可以結(jié)合其他療法來(lái)治療PD，包括，例如，神經(jīng)遞質(zhì)(像多巴胺前體左旋多巴，已知其能夠穿過(guò)血腦屏障)。治療有效量的原核PAL變異體的施用將產(chǎn)生有益效果的疾病適應(yīng)癥包括但不僅限于HPA、PKU、酪氨酸血癥、癌癥和PD。腸胃外、口服或其他標(biāo)準(zhǔn)的給藥途徑和劑量可以利用標(biāo)準(zhǔn)方法確定。2.用于治療的組合物本文還提供PKU/HPA的治療干預(yù)。這類(lèi)干預(yù)最初基于使用原核PAL變異體，其可以單獨(dú)使用或者結(jié)合飲食限制。進(jìn)一步地，原核PAL變異體和/或飲食限制可以進(jìn)一步結(jié)合其他設(shè)計(jì)以，例如對(duì)抗PKU其他表現(xiàn)癥狀(例如中性大氨基酸)的治療組合物，以預(yù)防腦部Phe累積(見(jiàn)Koch,等人,Mol.Genet.Metabol.79:110-113(2003))或者酪氨酸補(bǔ)充劑。本節(jié)討論可以用于本文涉及的治療的組合物。原核PAL變異體組合物、藥物組合物和制劑本文提供的藥物組合物包括治療有效量的原核PAL變異體以及一種或者多種藥學(xué)上可接受的賦形劑、溶媒、稀釋液、穩(wěn)定劑、防腐劑、增溶劑、乳化劑、佐劑和/或載體。這類(lèi)藥物組合物包括緩沖液內(nèi)容物(例如Tris-HCl、磷酸鹽)、pH和離子強(qiáng)度各異的稀釋液；添加劑，例如去垢劑和增溶劑(例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80)、抗氧化劑(例如抗壞血酸、焦亞硫酸鈉)、防腐劑(例如乙基汞硫代水楊酸鈉、苯甲醇)和填充劑(例如乳糖、甘露醇)；見(jiàn)，例如Remington’sPharmaceuticalSciences,18thEdition(1990,MackPublishingCo.,Easton,Pa.)1435-1712頁(yè)，其以引用方式并入本文。有效成分的有效量是治療上、預(yù)防上或者診斷上有效的量，其可以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員通過(guò)考慮諸如體重、年齡和治療目標(biāo)之類(lèi)的因素容易地確定。在一些實(shí)施方式中，該原核PAL變異體藥物組合物包括緩沖劑，以將溶液的pH值維持在所需的范圍內(nèi)。這類(lèi)緩沖劑包括Tris-HCl、乙酸鈉、磷酸鈉和檸檬酸鈉。也可以使用這些緩沖劑的混合物?？捎糜谒鼋M合物的緩沖劑的量在很大程度上取決于所用的具體緩沖液以及該溶液的pH。例如，pH＝5的乙酸鹽緩沖液比pH＝6的效率高，因此，pH＝5的乙酸鹽在溶液中的用量可以比pH＝6的少。在一些實(shí)施方式中，該緩沖劑是Tris-HCl。在某些實(shí)施方式中，該藥物組合物的pH范圍為約pH6.0-8.0，例如約pH6.5-7.5或者約pH7.0-7.6。本文提供的藥物組合物可以進(jìn)一步包括等滲調(diào)節(jié)劑，以使溶液變得等滲并更適于注射。在一些實(shí)施方式中，該等滲調(diào)節(jié)劑是濃度范圍在100-200mM之間(例如120-170mM或者120-150mM)的氯化鈉。藥學(xué)上可接受的載體或者賦形劑可以包括穩(wěn)定劑，其是穩(wěn)定本文提供的原核PAL變異體組合物的分子。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“穩(wěn)定”意在包括，例如但不僅限于，延長(zhǎng)原核PAL酶的儲(chǔ)存期限、保護(hù)原核PAL酶使其不發(fā)生蛋白水解消化作用(proteolyticdigestion)、保持原核PAL酶處于活性構(gòu)象和/或使原核PAL酶在升高的溫度下儲(chǔ)存后保持活性。例如，穩(wěn)定劑可以將聚乙二醇化的原核PAL變異體的儲(chǔ)存期限(T90)延長(zhǎng)至少約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或者更多(例如約1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或者10倍或者在其任何范圍內(nèi))(例如與不存在穩(wěn)定劑時(shí)的聚乙二醇化的原核PAL變異體相比)，所述儲(chǔ)存期限即在給定的溫度(例如4℃、25℃、37℃、40℃或者42℃)下活體外酶比活(利用實(shí)施例3中所述的測(cè)定法確定)降低≥10％所需的時(shí)間。在某些實(shí)施方式中，該T90在4℃時(shí)延長(zhǎng)6倍至7倍之間；25℃時(shí)延長(zhǎng)4倍至5倍之間，37℃時(shí)延長(zhǎng)2倍至3倍之間，42℃時(shí)延長(zhǎng)2倍至3倍之間，或者其組合。在一些實(shí)施方式中，該聚乙二醇化的原核PAL變異體是聚乙二醇化的雙半胱氨酸突變體AvPAL_C565SC503S以及該穩(wěn)定劑是Phe。替代性地，穩(wěn)定劑可以使聚乙二醇化的原核PAL變異體在升高的溫度下儲(chǔ)存后保持酶活性，即該變異體在25℃、37℃或者40℃下儲(chǔ)存特定的時(shí)間段(例如1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、3個(gè)月、4個(gè)月、6個(gè)月、9個(gè)月、1年、2年、5年或者更長(zhǎng)或者其任何范圍)后保留其活體外酶比活(利用實(shí)施例3中所述的測(cè)定法確定)的至少約40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或者更多或者在其任何范圍內(nèi)(例如與不存在穩(wěn)定劑時(shí)的聚乙二醇化的原核PAL變異體相比)。穩(wěn)定劑包括L-苯丙氨酸(Phe)及其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，例如反式肉桂酸(t-CA)、苯甲酸、酪氨酸(Tyr)等等。來(lái)自菜豆(PvPAL)的植物PAL已顯示在親和純化去除其底物L(fēng)-苯丙氨酸之后其活性受損(DaCunha,Eur.J.Biochem.178:243-248(1988))，以及來(lái)自圓紅冬孢酵母菌(RtPAL)的酵母PAL已顯示受到酪氨酸的保護(hù)，沒(méi)有因蛋白酶失活(Wang,等人,Mol.Genet.Metab.86:134-140(2005)；Pilbak,等人,FEBSJ.273:1004-1019(2006))。下文顯示，Phe和某些其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物有能力穩(wěn)定來(lái)自AvPAL的原核PAL的PEG：PAL共軛物(見(jiàn)實(shí)施例11)。不受限于特定的理論，假定原核PAL酶作為酶-底物復(fù)合物更穩(wěn)定，其中所結(jié)合的底物Phe轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物t-CA或者t-CA的過(guò)渡態(tài)類(lèi)似物。該t-CA仍結(jié)合至其他具有高活性的活性位點(diǎn)中心(MIO基團(tuán))，從而穩(wěn)定該原核PAL酶。相應(yīng)地，該原核PAL酶底物、Phe、產(chǎn)物、t-CA或者其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物可以用作穩(wěn)定劑。還提供包括原核PAL變異體以及藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物，其中該藥學(xué)上可接受的載體包括穩(wěn)定劑。該穩(wěn)定劑可以是Phe或者其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物。該穩(wěn)定劑可以選自如下：L-苯丙氨酸、反式肉桂酸和苯甲酸。該穩(wěn)定劑的示例性范圍是每摩爾原核PAL活性位點(diǎn)從約0.1至20mol的穩(wěn)定劑，例如每摩爾原核PAL活性位點(diǎn)從約0.5至10mol的穩(wěn)定劑或者每摩爾原核PAL活性位點(diǎn)從約1至10mol的穩(wěn)定劑。在一些實(shí)施方式中，該藥物組合物包括原核PAL變異體以及藥學(xué)上可接受的載體，其中該原核PAL變異體與野生型PAL相比具有較大的苯丙氨酸轉(zhuǎn)化活性和/或降低的免疫原性，以及其中該藥學(xué)上可接受的載體包括穩(wěn)定劑。在一些實(shí)施方式中，該穩(wěn)定劑是Phe或者其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物。在一些實(shí)施方式中，該穩(wěn)定劑選自如下：L-苯丙氨酸、反式肉桂酸和苯甲酸。在某些實(shí)施方式中，該藥物組合物包括原核PAL變異體以及藥學(xué)上可接受的載體，其中該原核PAL變異體是AvPAL變異體，其中該AvPAL變異體位置503和565上的半胱氨酸殘基已被絲氨酸殘基取代，該AvPAL變異體進(jìn)一步包括水溶性聚乙二醇聚合物，其中AvPAL變異體和聚乙二醇的比率為約1:3，以及其中該藥學(xué)上可接受的載體包括穩(wěn)定劑。在一些實(shí)施方式中，該穩(wěn)定劑是Phe或者其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物。在一些實(shí)施方式中，該穩(wěn)定劑選自如下：L-苯丙氨酸、反式肉桂酸和苯甲酸。藥學(xué)上可接受的載體或者賦形劑可以包括防腐劑(例如抗菌劑)，其是終止或者防止微生物(例如細(xì)菌、真菌或者原生動(dòng)物)生長(zhǎng)以及殺死病毒的物質(zhì)?？咕鷦┛梢詺⑺牢⑸?殺菌)或者防止它們生長(zhǎng)(抑菌)。防腐劑可用于，例如但不僅限于，保護(hù)原核PAL酶使其免受微生物污染、延長(zhǎng)原核PAL酶的儲(chǔ)存期限、保持原核PAL酶處于活性構(gòu)象以及使原核PAL酶在升高的溫度下儲(chǔ)存后保持活性。本文提供的防腐劑可以包括酚及其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，例如間甲酚等等。該防腐劑(例如間甲酚)的濃度示例性范圍從約0.1％至1％(w/v)。在某些實(shí)施方式中，間甲酚的范圍從約0.1％至0.5％(w/v)。在其他的實(shí)施方式中，間甲酚的范圍從約0.3％至0.5％(w/v)。本文提供的穩(wěn)定劑，當(dāng)單獨(dú)或者結(jié)合防腐劑使用時(shí)，包括Phe及其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物和Gly及其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物。穩(wěn)定劑(例如Phe)的濃度示例性范圍從約0.1至10mM。在一些實(shí)施方式中，Phe的范圍從約0.5至5mM。在其他的實(shí)施方式中，Phe的范圍從約0.5至1.5mM。穩(wěn)定劑(例如Gly)的濃度示例性范圍從約0.1至100mM。在一些實(shí)施方式中，Gly的范圍從約1至100mM。在其他的實(shí)施方式中，Gly的范圍從約1至20mM。在其他的實(shí)施方式中，Gly的范圍從約20至100mM。在一些實(shí)施方式中，該藥物組合物包括原核PAL變異體以及藥學(xué)上可接受的載體，其中該原核PAL變異體與野生型PAL相比具有較大的苯丙氨酸轉(zhuǎn)化活性和/或降低的免疫原性，以及其中該藥學(xué)上可接受的載體包括至少兩種穩(wěn)定劑以及可選擇地，一種防腐劑(即抗菌劑)。在一些實(shí)施方式中，該至少兩種穩(wěn)定劑是Phe或者其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物和Gly或者其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物或者其任何組合。在一些實(shí)施方式中，該穩(wěn)定劑是Phe和Gly。在一些實(shí)施方式中，該防腐劑是間甲酚或者其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物。在具體的實(shí)施方式中，該穩(wěn)定劑是Phe和Gly以及該防腐劑是間甲酚。在某些實(shí)施方式中，該藥物組合物或者制劑包括聚乙二醇化的AvPAL變異體以及藥學(xué)上可接受的載體，其中該AvPAL變異體和聚乙二醇的比率為約1:3(1:3AvPAL：PEG)以及該AvPAL變異體位置503和565上的半胱氨酸殘基已被絲氨酸殘基取代，以及其中該藥學(xué)上可接受的載體包括至少兩種穩(wěn)定劑以及可選擇地，一種防腐劑(即抗菌劑)。在一些實(shí)施方式中，該至少兩種穩(wěn)定劑是Phe或者其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物和Gly或者其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物或者其任何組合。在一些實(shí)施方式中，該穩(wěn)定劑是Phe和Gly。在一些實(shí)施方式中，該防腐劑是間甲酚或者其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物。在具體的實(shí)施方式中，該穩(wěn)定劑是Phe和Gly以及該防腐劑是間甲酚。如本文所用，以及當(dāng)涉及原核PAL變異體時(shí)，術(shù)語(yǔ)“治療有效量”指導(dǎo)致對(duì)患者有益的血液、血漿或者血清L-苯丙氨酸的下降的量。該量將因個(gè)體的不同而不同并將取決于多種因素，包括患者的整體身體條件、飲食和病況。用于治療的原核PAL變異體的所述量導(dǎo)致血液、血漿或者血清L-苯丙氨酸水平的可接受的降幅并在原核PAL變異體治療期間將該數(shù)值保持在有益的水平(通常至少約30％以及通常在10％至50％的范圍內(nèi))。本申請(qǐng)組合物的治療有效量可以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員利用公開(kāi)可得的材料和程序容易地確定。在某些實(shí)施方式中，原核PAL變異體或者其藥物組合物的給藥頻率比原生PAL少。給藥頻率將因正在治療的疾病的不同而不同，但一般情況下，將是約1次/周。理解的是，實(shí)際采用的給藥頻率可因不同的個(gè)體對(duì)該原核PAL變異體作出的反應(yīng)有差異而與本文披露的所述頻率有所不同；術(shù)語(yǔ)“約”意在反映這種差異?？紤]到的是，該原核PAL變異體的給藥頻率為每周約2次、每周約1次、每?jī)芍芗s1次、每月約1次或者比每月約1次更久。本文提供的所述組合物和方法可以用來(lái)降低血液、血漿或者血清L-苯丙氨酸水平。如上文所討論，最常見(jiàn)的是血清L-苯丙氨酸水平因HPA而上升?？赏ㄟ^(guò)本文提供的所述組合物和方法治療的疾病包括與PKU有關(guān)的HPA?？芍委煹倪€有可導(dǎo)致血清L-酪氨酸水平提高的疾病(如這類(lèi)發(fā)現(xiàn)的酪氨酸血癥)。可以用本文提供的所述原核PAL變異體藥物組合物和方法治療的還有許多與癌癥相關(guān)的疾病，其中血液、血漿或者血清L-苯丙氨酸水平的降低會(huì)是有益的。在某些實(shí)施方式中，本文提供的所述原核PAL變異體藥物組合物通過(guò)腸胃外注射(靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)或者鞘內(nèi)注射)給藥。然而，其他給藥途徑也可以有效地利用，這對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。本文所述的方法使用原核PAL變異體藥物組合物，該原核PAL變異體藥物組合物包括上文所述的分子，以及一種或者多種藥學(xué)上可接受的賦形劑、溶媒、稀釋液、穩(wěn)定劑、防腐劑(例如抗菌劑)、增溶劑、乳化劑、佐劑和/或載體，以及可選擇地，其他治療性和/或預(yù)防性成分。這類(lèi)賦形劑包括液體，例如水、鹽水、甘油、聚乙二醇、透明質(zhì)酸、乙醇、環(huán)糊精、修飾的環(huán)糊精(即磺丁基醚環(huán)糊精)等等。非液體制劑的合適賦形劑也為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。可用于所述組合物的藥學(xué)上可接受的鹽包括，例如，礦物酸鹽，如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽等等；以及有機(jī)酸鹽，例如醋酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽、甲苯酸鹽等等。有關(guān)藥學(xué)上可接受的賦形劑和鹽的深刻討論可見(jiàn)于Remington’sPharmaceuticalSciences，第18版(Easton,Pennsylvania:MackPublishingCompany,1990)。附加地，輔助物質(zhì)，例如潤(rùn)濕劑或者乳化劑、生物緩沖物質(zhì)、表面活性劑等等可以存在于這類(lèi)溶媒中。事實(shí)上，生物緩沖液可以是藥理學(xué)上可接受的以及為制劑提供所需pH(即生理學(xué)上可接受范圍內(nèi)的pH)的任何溶液。緩沖液的例子包括鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水、Tris緩沖鹽水、Hank氏緩沖鹽水等等。根據(jù)預(yù)期的給藥途徑，該藥物組合物可以是例如，固體、半固體或者液體劑型的形式，如片劑、栓劑、丸劑、膠囊、粉末、液體、混懸液、乳膏、軟膏、洗液或者諸如此類(lèi)，例如適于精確劑量單一給藥的單位劑型。該組合物可以包括結(jié)合有藥學(xué)上可接受的載體的治療有效量的所述原核PAL變異體；此外，可以可選擇地包括其他藥劑、佐劑、稀釋液、緩沖液等等。通常情況下，本文提供的所述原核PAL變異體藥物組合物將作為藥物制劑給藥，所述藥物制劑包含那些適于口服(包含口腔和舌下)、直腸、鼻內(nèi)、局部、肺部、陰道或者腸胃外(包含肌內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、鞘內(nèi)、皮下和靜脈內(nèi))給藥或者適于吸入或者吹入給藥的形式的藥物制劑。在某些實(shí)施方式中，該組合物利用可以根據(jù)病痛程度進(jìn)行調(diào)整的方便的每日給藥方案通過(guò)例如，靜脈內(nèi)給藥。對(duì)于組合物，常規(guī)的無(wú)毒固體載體包括，例如，制藥等級(jí)的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石粉、纖維素、葡萄糖、蔗糖、碳酸鎂等等。藥學(xué)上可給藥的液體組合物可以例如，通過(guò)將本文所述的原核PAL變異體組合物以及可選地藥物佐劑溶解、分散(或者以其他方式)在例如，賦形劑(如水、鹽水、水性右旋糖、甘油、乙醇等等)中從而形成溶液或者混懸液來(lái)制備。若需要，待給藥的所述藥物組合物還可以包含微量的無(wú)毒輔助物質(zhì)，例如潤(rùn)濕劑或者乳化劑、pH緩沖劑、補(bǔ)益劑(tonicifyingagent)以及諸如此類(lèi)，例如，乙酸鈉、失水山梨醇單月桂酸酯、三乙醇胺乙酸鈉、三乙醇胺油酸酯等等。制備這類(lèi)劑型的實(shí)際方法為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知或者將是顯而易見(jiàn)；例如，見(jiàn)上文引用的Remington’sPharmaceuticalSciences。對(duì)于口服給藥，該組合物通常會(huì)采取片劑、膠囊或者軟膠囊的形式或者可以是水溶液或者非水溶液、混懸液或者糖漿。片劑和膠囊可以用作口服給藥劑型。用于口服的片劑和膠囊通常會(huì)包括一種或者多種常用的載體，例如乳糖和玉米淀粉。通常還添加潤(rùn)滑劑，例如硬脂酸鎂。當(dāng)使用混懸液時(shí)，活性劑可以結(jié)合乳化劑和懸浮劑。如果需要，也可以添加調(diào)味劑、著色劑和/或甜味劑。本文用來(lái)?yè)饺肟诜苿┑钠渌蛇x的組分包括但不僅限于，防腐劑、懸浮劑、增稠劑等等。腸胃外制劑可以常規(guī)形式制備：作為液體溶液或者混懸液；適于在注射之前于液體中還原、增溶或者混懸的固體或者凍干形式；或者作為乳劑。在某些實(shí)施方式中，可無(wú)菌注射的混懸液根據(jù)本領(lǐng)域已知的技術(shù)利用合適的載體、分散劑或者潤(rùn)濕劑和懸浮劑配制?？蔁o(wú)菌注射的制劑還可以是含于無(wú)毒的腸胃外可接受的稀釋液或者溶劑的可無(wú)菌注射的溶液或者混懸液?？梢圆捎玫目山邮艿娜苊胶腿軇┦撬?、林格氏溶液和等滲氯化鈉溶液。此外，無(wú)菌、不揮發(fā)油、脂肪酯或者多元醇通常被用作溶劑或者懸浮培養(yǎng)基。此外，腸胃外給藥可以涉及使用緩釋或者持續(xù)釋放系統(tǒng)，以便保持恒定的劑量水平。本文所述的所述原核PAL變異體組合物可以按治療有效劑量施用至患者來(lái)治療多種疾病，包含高苯丙氨酸血癥(包含苯丙酮尿癥)以及其他疾病(包含癌癥)。這類(lèi)原核PAL變異體組合物的毒性和療效可以通過(guò)例如細(xì)胞培養(yǎng)物或者實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)的藥物程序，如通過(guò)確定LD50(群半數(shù)致死劑量)和ED50(群半數(shù)治療有效劑量)來(lái)確定。毒性和治療作用之間的劑量比率是治療指數(shù)以及它可以表示為L(zhǎng)D50/ED50的比率。可以使用治療指數(shù)顯示大的原核PAL變異體組合物。從細(xì)胞培養(yǎng)物測(cè)定和動(dòng)物研究中獲得的數(shù)據(jù)可以用來(lái)配制各種用于人類(lèi)的劑量。該劑量可以處于循環(huán)濃度的范圍內(nèi)，所述循環(huán)濃度包括毒性幾乎為零或者毒性最小的ED50。該劑量可以根據(jù)所采用的劑型以及所用的給藥途徑在此范圍內(nèi)變動(dòng)。治療有效劑量或者治療有效量可以從細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定以及從動(dòng)物模型確定。飲食蛋白質(zhì)除了向HPA/PKU患者施用原核PAL變異體組合物，在某些實(shí)施方式中，考慮到，所述患者的飲食蛋白質(zhì)也可以受限或者改變。本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道各種市售的用于治療PKU的蛋白質(zhì)配方。這類(lèi)配方包括MAXIMAID、PHENEX1、PHENEX2(英國(guó)利物浦RossLaboratories)，LOFENALAC、PHENYL-FREE(Mead-Johnson)等等。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以使用所提到的蛋白質(zhì)配方，它們通常不含Phe組分。該蛋白質(zhì)配方常補(bǔ)充有PKU患者體內(nèi)缺乏的氨基酸。這類(lèi)氨基酸包括，例如L-酪氨酸和L-谷氨酸。已有教導(dǎo)說(shuō)，為PKU患者的飲食補(bǔ)充纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸會(huì)是可取的(見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,252,822)。某些臨床表現(xiàn)中，Phe阻礙腦部對(duì)其他氨基酸(例如酪氨酸和色氨酸)的攝取，從而導(dǎo)致PKU的毒性作用。已有發(fā)現(xiàn)表明，為PKU患者的飲食補(bǔ)充過(guò)多這類(lèi)中性大氨基酸阻礙腦部對(duì)Phe的攝取并降低腦部Phe水平。因此，考慮到，對(duì)于本文提供的所述方法，飲食方案可以進(jìn)一步補(bǔ)充包括一種或者多種這類(lèi)氨基酸的組合物(Koch,等人,Mol.Genet.Metabol.79:110-113(2003))。進(jìn)一步地，如眾所周知，除了所述蛋白質(zhì)受限之外，還應(yīng)當(dāng)提供通常發(fā)現(xiàn)于人乳以及其他動(dòng)物源性食品中的L-肉堿和?；撬帷Ｔ谀承?shí)施方式中，所述L-肉堿可以作為20mg/100g的蛋白質(zhì)補(bǔ)充劑提供，以及牛磺酸可以作為40mg/100g蛋白質(zhì)補(bǔ)充劑提供，以有助于提供適量的通常發(fā)現(xiàn)于人乳和動(dòng)物源性食品中的這些因子。此外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員參照美國(guó)國(guó)家科學(xué)院2000年的NationalResearchCouncilDietaryReferenceIntakes進(jìn)一步查詢(xún)應(yīng)當(dāng)提供給患者的其他組分(例如基本維生素和礦物質(zhì))列表，以確保在盡管飲食蛋白質(zhì)受限的條件下，其他補(bǔ)充劑得以供應(yīng)。參考上文關(guān)于總蛋白質(zhì)量和所需血漿Phe濃度的討論，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將能夠確定所需的飲食蛋白質(zhì)受限量并因此對(duì)患者的飲食做出相應(yīng)調(diào)整。以年齡約11-14的雄性對(duì)象為例，該個(gè)體應(yīng)當(dāng)接受45g蛋白質(zhì)/日。倘若該個(gè)體是重度典型PKU對(duì)象，其不受限的血漿Phe濃度將會(huì)大于1200μM，以及對(duì)于該個(gè)體來(lái)說(shuō)，絕大部分(如果不是所有的)飲食蛋白質(zhì)來(lái)源很可能來(lái)自粉末狀蛋白質(zhì)補(bǔ)充劑，所述粉末狀蛋白質(zhì)補(bǔ)充劑可以將其血漿Phe濃度降至小于600μM。通過(guò)向該對(duì)象施用原核PAL變異體，治療成果會(huì)是使患者的血漿Phe濃度產(chǎn)生較大的降幅這樣一種情況；或者替代性地，該治療成果是這樣一種情況：其中該個(gè)體的血漿Phe濃度降至類(lèi)似的程度，但該個(gè)體能夠容許從正常飲食而非從飲食配方攝取蛋白質(zhì)。同樣地，對(duì)于年齡約11-14的患有中度PKU的雄性對(duì)象，可能會(huì)利用本文提供的所述方法通過(guò)正常蛋白質(zhì)攝入而非受限配方來(lái)為其提供指定量的45g蛋白質(zhì)/日。確定本文提供的所述方法是否有效將涉及定期測(cè)定該患者的血漿Phe濃度，以確保血漿Phe濃度保持在至少400μM以下。下文描述用于測(cè)定這類(lèi)濃度的檢測(cè)法。在一些實(shí)施方式中，實(shí)現(xiàn)少于或者約360μM的濃度。3.確認(rèn)和監(jiān)測(cè)患者群如本文討論，確定特定患者是否對(duì)原核PAL變異體療法有響應(yīng)會(huì)是有必要的；以及有必要的在最初階段測(cè)定該患者的苯丙氨酸濃度以確認(rèn)正在接受治療的PKU患者的類(lèi)別并在治療方案進(jìn)行過(guò)程中測(cè)定該患者的苯丙氨酸濃度以監(jiān)測(cè)該方案的療效。下文對(duì)這類(lèi)示例性的方法進(jìn)行描述。BH4負(fù)荷試驗(yàn)BH4負(fù)荷試驗(yàn)使得有可能辨別因BH4不足或者因PAH不足而患HPA的患者。最簡(jiǎn)易的BH4負(fù)荷試驗(yàn)是這樣的：其中施用外源性BH4以及測(cè)定該施用在降低血漿Phe濃度方面的效果。2mg/kgBH4靜脈內(nèi)負(fù)荷最初由Danks,等人,Lancet1:1236(1976)提出，隨著純度較高的BH4變得可得，已逐漸有可能通過(guò)按約2.5mg/kg體重的量口服給藥BH4來(lái)執(zhí)行所述試驗(yàn)。最終，Niederwieser等人提出了一種標(biāo)準(zhǔn)化的方法，其中施用7.5mg/kg口服單劑量的BH4(Niederwieser,等人,Eur.J.Pediatr.138:441(1982))，雖然有些實(shí)驗(yàn)室仍然使用20mgBH4/kg體重以上。為了使簡(jiǎn)易BH4負(fù)荷試驗(yàn)產(chǎn)生可靠的結(jié)果，患者的血液Phe水平需要高于400μM。因此，經(jīng)常習(xí)慣性的做法是在執(zhí)行該負(fù)荷試驗(yàn)之前，讓患者停止PKU飲食2天。BH4檢測(cè)試劑盒由Dr.SchircksLaboratories(瑞士的Jona市)銷(xiāo)售和分發(fā)。該試劑盒推薦攝入正常餐之后約30min20mgBH4/kg體重的劑量。Phe濃度測(cè)定用于測(cè)定血液中Phe的存在的方法有許多(參見(jiàn)，例如Shaw等人,AnalyticalMethodsinPhenylketonuria-ClinicalBiochemistry,InBickett等人Eds.,Phenylketonuria和SomeOtherInbornErrorsofAminoAcidMetabolism,Stuttgart,GeorgThiemVerlag,47-56(1971))。通常，利用熒光測(cè)定從患者的血清中測(cè)定苯丙氨酸和酪氨酸濃度。這種測(cè)定依賴(lài)于當(dāng)在亮氨?；彼岬拇嬖谙掠盟宪崛訜岜奖彼釙r(shí)熒光物質(zhì)的形成(McCaman,等人，J.Lab.Clin.Med.59:885-890(1962))。最普遍的用于測(cè)定Phe濃度的方法是Guthrie檢測(cè)，其中用來(lái)自患者的血樣本飽和濾紙，然后用打孔器將該濾紙打成一些圓片(disc)。在已種有枯草芽孢桿菌并包含枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)特異性抑制劑的瓊脂盤(pán)中孵育這些均一的圓片。隨著苯丙氨酸從該均一的圓片轉(zhuǎn)移至該瓊脂，Phe扭轉(zhuǎn)了細(xì)菌生長(zhǎng)抑制狀況，從而收獲細(xì)菌生長(zhǎng)區(qū)，該細(xì)菌生長(zhǎng)區(qū)與苯丙氨酸濃度的相關(guān)性情況可以通過(guò)與利用包含已知量的Phe的圓片執(zhí)行的類(lèi)似測(cè)定相比得出。量化Phe濃度的其他方法包括HPLC、質(zhì)譜、薄層色譜法等等。這類(lèi)方法可用于在治療前測(cè)定患者的血漿Phe濃度以及在治療方案進(jìn)行過(guò)程中監(jiān)測(cè)該P(yáng)he濃度以確定其功效。考慮到的是，患者的血漿Phe水平將在治療方案的整個(gè)時(shí)間期內(nèi)以方便的時(shí)間間隔(例如每天、每隔一天或者每周)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。通過(guò)這樣定期地監(jiān)測(cè)血漿Phe水平，臨床醫(yī)師將能夠?qū)Ο熜нM(jìn)行評(píng)估以及相應(yīng)地調(diào)整原核PAL變異體和/或飲食蛋白質(zhì)要求。4.聯(lián)合療法在本文提供的所述方法的某些實(shí)施方式中，原核PAL變異體和飲食蛋白質(zhì)限制聯(lián)合使用，以在患有各種形式的HPA的患者體內(nèi)產(chǎn)生治療成果。為了在本文涉及的所述組合療法中實(shí)現(xiàn)適當(dāng)?shù)闹委煶晒?，人們通常?huì)向?qū)ο笫┯米阋援a(chǎn)生所需治療成果(即降低血漿Phe濃度和/或能夠容許較大的量的Phe/蛋白質(zhì)攝入量而不產(chǎn)生隨之增加的血漿Phe濃度)的有效組合量的所述原核PAL變異體組合物和所述飲食限制。這種方法可以涉及同時(shí)施用該原核PAL變異體組合物和飲食蛋白質(zhì)治療組合物。這可以通過(guò)施用單一組合物或者藥理蛋白質(zhì)制劑實(shí)現(xiàn)，所述藥理蛋白質(zhì)制劑包括所有的飲食蛋白質(zhì)要求以及還包括所述蛋白質(zhì)制劑內(nèi)的原核PAL變異體。替代性地，飲食蛋白質(zhì)(補(bǔ)充劑或者正常蛋白質(zhì)餐)的進(jìn)食與原核PAL變異體的藥理制劑(片劑、注射液或者飲品)的施用大約是同時(shí)的。原核PAL變異體還可以配制成蛋白棒或者其他適于攝入的食品，例如布朗尼、薄煎餅、蛋糕。其他替代性的情況是，原核PAL變異體治療可以在飲食蛋白質(zhì)療法之前或者之后，時(shí)間間隔從分鐘到小時(shí)不等。在其中蛋白質(zhì)和原核PAL變異體組合物單獨(dú)給藥的實(shí)施方式中，人們通常會(huì)確保每次給藥時(shí)間點(diǎn)之間的顯著時(shí)間段不會(huì)過(guò)期，以便原核PAL變異體仍將能夠?qū)颊甙l(fā)揮有利的影響。在這種情況下，考慮到的是，會(huì)在飲食蛋白質(zhì)攝入(之前或者之后)約2-6h內(nèi)施用原核PAL變異體，在有些實(shí)施方式中，延遲時(shí)間僅僅為約1h。在某些實(shí)施方式中，考慮到的是，原核PAL變異體療法將是連續(xù)性療法，其中向患者無(wú)限期地施用日劑量的原核PAL變異體。在其他情況下，例如對(duì)于僅僅患有比較輕度的PKU和HPA的孕婦，原核PAL變異體療法可能僅僅持續(xù)孕期和/或哺乳期。此外，除僅僅基于原核PAL變異體的給藥和飲食蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)的療法之外，本文提供的所述方法還涉及與第三種組合物的聯(lián)合療法，所述第三種組合物具體地靶向HPA的一種或者多種癥狀。例如，已知HPA導(dǎo)致的酪氨酸的不足導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺和血清素的不足。因此，考慮到的是，基于原核PAL變異體和飲食蛋白質(zhì)的方法可以進(jìn)一步結(jié)合左旋多巴、卡比多巴和5-羥基色氨酸神經(jīng)遞質(zhì)的給藥，以糾正飲食中酪氨酸量的降低導(dǎo)致的缺陷。由于原核PAL變異體的給藥不會(huì)生成酪氨酸(不同于PAH的給藥)，這類(lèi)治療仍將導(dǎo)致酪氨酸是針對(duì)這類(lèi)患者的基本氨基酸。因此，飲食補(bǔ)充酪氨酸對(duì)于接受原核PAL變異體并結(jié)合以BH4療法的患者來(lái)說(shuō)必定是可取的。E.原核PAL變異體的產(chǎn)物本文還提供一種生產(chǎn)原核PAL或者其生物活性片段、突變體、變異體或者類(lèi)似物的方法。在一種示例性的實(shí)施方式中，在大腸桿菌BLR(DE3)/pLysS(Novagen)或者大腸桿菌BL21(DE3)/pLysS(Invitrogen)細(xì)胞中，在具有誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(例如具有IPTG(異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)的載體(例如pIBX1(Su,等人,Appl.Environ.Microbiol.62:2723-2734(1996))或者pET28a(Invitrogen))中，在存在或者不存在N末端標(biāo)簽(例如八聚組氨?；鶚?biāo)簽)的情況下，將重組原核PAL或者其生物活性片段、突變體、變異體或者類(lèi)似物過(guò)表達(dá)。在搖瓶中從甘油菌為生物反應(yīng)器/發(fā)酵罐培育種子培養(yǎng)物。然后以補(bǔ)料分批方式將這類(lèi)種子培養(yǎng)物用以引入(spikeinto)可控的生物反應(yīng)器。補(bǔ)充葡萄糖，用堿(NH4OH)控制pH，以及攪動(dòng)達(dá)1200rpm。輸入O2保持溶氧大于20％。在37℃溫度下培育細(xì)胞直至達(dá)到70-100的OD600(～22-25h)，然后用0.4mMIPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。將溫度降至30℃并培育直至活性變化<0.1IU/mL(大約40-48h和OD600通常為200)。細(xì)胞培養(yǎng)基通常定義為包括酵母提取蛋白質(zhì)、蛋白胨-胰化蛋白胨、葡萄糖、甘油、酪蛋白氨基酸、痕量鹽和磷酸鹽緩沖鹽。重組原核PAL產(chǎn)物或者其生物活性片段、突變體、變異體或者類(lèi)似物在細(xì)胞內(nèi)而非分泌產(chǎn)生。通過(guò)連續(xù)離心(Alfa-Laval、Carr、Cepa或者等同物)收獲細(xì)菌。本示例性方案的其他變化對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將是顯而易見(jiàn)的。F.原核PAL變異體的純化本文還提供一種純化原核PAL或者其生物活性片段、突變體、變異體或者類(lèi)似物的方法。根據(jù)示例性的第一實(shí)施方式，培育轉(zhuǎn)化的細(xì)胞團(tuán)塊并使其破碎，留下粗制重組酶。通常從粗制塊分離外源性物質(zhì)，以防止污染管柱。利用一種或者幾種色譜樹(shù)脂進(jìn)行色譜純化。接著，將純化的蛋白質(zhì)配制為緩沖液，設(shè)計(jì)該緩沖液以在較長(zhǎng)的時(shí)間段內(nèi)提供穩(wěn)定的活性。在另一實(shí)施方式中，所述純化原核PAL或者其生物活性片段、突變體、變異體或者類(lèi)似物的方法包括：(a)利用壓力均質(zhì)機(jī)(但潛在地，通過(guò)其他物理手段，例如玻璃珠裂解)對(duì)包含重組原核PAL或者其生物活性片段、突變體、變異體或者類(lèi)似物的細(xì)菌進(jìn)行裂解；(b)加熱處理；(c)利用第二連續(xù)離心步驟和/或深層過(guò)濾(如用CuonoZetaPlus或者M(jìn)aximizer，PallFiltron或者M(jìn)illiporeMillistak或者Opticao過(guò)濾器)澄清該裂解物；(d)通過(guò)木炭過(guò)濾步驟(如用MilliporeMillistak40AC)；(e)通過(guò)中間深層過(guò)濾步驟(如用一種或者多種深層過(guò)濾器，例如PallEKSP、PallKS50P和/或PallEKMP過(guò)濾器)，然后是最終的過(guò)濾步驟(如用SartoriousSartopore或者PallEDF0.2μm過(guò)濾器)；(f)通過(guò)丁基疏水作用色譜(如在來(lái)自TosohBiosciences的ToyopearlButyl650M中)；(g)通過(guò)Q離子交換柱(如在來(lái)自BioRad的MacroprepHighQ中)；以及(h)可選擇地，通過(guò)具有切向流過(guò)濾(如用SartoriousHydrosart或者PES30kDa膜)的緩沖液更換來(lái)回收最終產(chǎn)品。本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易地理解可以省略或者取代色譜法步驟或者過(guò)濾步驟的一步或者多步；或者可以改變色譜法步驟或者過(guò)濾步驟的順序。最后，根據(jù)需要可以進(jìn)行適當(dāng)?shù)南静襟E?，F(xiàn)已對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了一般描述，本發(fā)明可以通過(guò)下文對(duì)如下實(shí)施例的參考更容易地理解。所述實(shí)施例的提供僅為說(shuō)明性用途，而無(wú)論如何不會(huì)限制本發(fā)明的范圍。已經(jīng)努力確保關(guān)于所用數(shù)據(jù)(例如量、溫度等等)的準(zhǔn)確性，但是當(dāng)然應(yīng)該考慮到有一些實(shí)驗(yàn)誤差和偏差。實(shí)施例實(shí)施例1點(diǎn)形念珠藻和多變魚(yú)腥藻PAL的克隆DNA操作點(diǎn)形念珠藻基因組DNA購(gòu)自ATCC(29133D)以及PAL基因(ZP_00105927)從引物5’-CACTGTCATATGAATATAACATCTCTACAACAGAACAT-3’(SEQIDNO:12)和5’-GACAGTGGCGGCCGCTCACGTTGACTTTAAGCTCGAAAAAATATG-3’(SEQIDNO:13)PCR擴(kuò)增得到。由此產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物用NdeI和NotI消化以及將1.7kb片段連接入pET-28a(+)和pET-30a(+)(Novagen)，分別進(jìn)行N-His標(biāo)簽化和不進(jìn)行N-His標(biāo)簽化。多變魚(yú)腥藻細(xì)胞購(gòu)自ATCC(29413)。提取了基因組DNA(Qiagen)以及通過(guò)SOE-PCR擴(kuò)增了PAL基因(YP_324488)以去除NheI位點(diǎn)。引物1(5’-CACTGTGCTAGCATGAAGACACTATCTCAAGCACAAAG-3’)(SEQIDNO:14)和引物2(5’-GGAAATTTCCTCCATGATAGCTGGCTTGGTTATCAACATCAATTAGTGG-3’)(SEQIDNO:15)被用來(lái)擴(kuò)增核苷酸1-1190以及引物3(5’-CCACTAATTGATGTTGATAACCAAGCCAGCTATCATGGAGGAAATTTCC-3’)(SEQIDNO:16)和引物4(5’-CACTGTGCGGCCGCTTAATGCAAGCAGGGTAAGATATCTTG-3’)(SEQIDNO:17)被用來(lái)擴(kuò)增核苷酸1142-1771。這兩種PCR產(chǎn)物結(jié)合起來(lái)以用引物1和4擴(kuò)增全長(zhǎng)基因。由此產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物用NheI消化，用Klenow(NEB)補(bǔ)平，然后用NotI消化。1.7kb片段連接至pET-28a(+)和pET-30a(+)(Novagen)。該質(zhì)粒稱(chēng)為3p86-23。AvPAL基因還被克隆入載體pIBX7(Tkalec,等人，Appl.Environ.Microbiol.66:29-35(2000))，該pIBX7衍生自pIBX1(Su,等人，Appl.Environ.Microbiol.62:2723-2734(1996))(見(jiàn)實(shí)施例7)。細(xì)菌菌株和培養(yǎng)條件對(duì)于點(diǎn)形念珠藻PAL(NpPAL)，大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞(Stratagene)用pGro7(TaKaRa)轉(zhuǎn)化以及BL21(DE3)pGro7感受態(tài)細(xì)胞通過(guò)Inoue方法制備(SambrookandRussell,MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rdEdition(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,2001))。這些細(xì)胞將用pET-28-NpPAL轉(zhuǎn)化以及于37℃下在含有50mg/L卡那霉素和20mg/L氯霉素的25mLLB中培養(yǎng)過(guò)夜。將20mL這種培養(yǎng)物種入含有卡那霉素、氯霉素和500mg/LL-阿拉伯糖的1LLB培養(yǎng)基中并于37℃下培育。當(dāng)OD600為0.6時(shí)，將培養(yǎng)物在冰上冷卻。5min之后，用0.3mMIPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)物并于20℃下培育16h。通過(guò)離心作用收獲細(xì)胞。BL21(DE3)pLysS細(xì)胞(Stratagene)用AvPAL轉(zhuǎn)化以及其培養(yǎng)類(lèi)似于NpPAL而無(wú)阿拉伯糖誘導(dǎo)。克隆于pIBX7載體的AvPAL(見(jiàn)實(shí)施例7)通過(guò)轉(zhuǎn)化為BLR(DE3)/pLysS(Novagen)細(xì)胞而引入并于37℃下在含有50mg/L卡那霉素的25mLLB培養(yǎng)過(guò)夜。將20mL這種培養(yǎng)物種入含有卡那霉素的1LLB培養(yǎng)基并于37℃下培育。當(dāng)OD600為0.6時(shí)，將培養(yǎng)物在冰上冷卻。5min之后，用0.3mMIPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)物并于30℃下培育16h。通過(guò)離心作用收獲細(xì)胞。實(shí)施例2NpPAL和AvPAL的純化在臺(tái)式離心機(jī)中按離心力5,000g離心所述培養(yǎng)物達(dá)20min并將上清液丟棄。通常在進(jìn)一步處理之前于–70℃下冷凍沉淀細(xì)胞(cellpellet)。融化后，在TBS(25mMTris，150mMNaCl，pH7.8)中懸浮該沉淀細(xì)胞至大約80光密度單位(600nm)。按12-14,000psi將細(xì)胞兩次通過(guò)APV壓力均質(zhì)機(jī)來(lái)進(jìn)行裂解。然后在55℃下加熱處理粗制裂解物2h。按10,000g離心該裂解物30min，以及保留上清液并用0.2μm真空過(guò)濾器(Corning)過(guò)濾。通過(guò)將澄清的裂解物依次穿過(guò)丁基650M柱(TosohBioSciences)和MacroPrepHighQ柱(BioRad)從中純化得到PAL。通過(guò)SDSPAGE和反相HPLC兩種方法進(jìn)行洗脫后的產(chǎn)物均表明具有高純度。實(shí)施例3聚乙二醇化的PAL變異體的生成下文描述了用于使來(lái)自圓紅冬孢酵母菌(RtPAL)的PAL聚乙二醇化的方法。類(lèi)似的用于使原核PAL(例如NpPAL或者AvPAL)聚乙二醇化的方法在實(shí)施例6中有描述。蛋白質(zhì)聚乙二醇化聚乙二醇化利用文獻(xiàn)方法的修飾(Hershfield,等人,(1991),出處同上；美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,057,292；Lu,等人,Biochemistry40(44):13288-13301(2001)；NektarTherapeutics,2003目錄)?；罨腜EG既包括直鏈PEG琥珀酰亞胺琥珀酸酯(mPEG-SPA，MW5kDa或者M(jìn)W20kDa)又包括支鏈PEG羥基琥珀酰亞胺酯(mPEG2-NHS酯，MW10kDa或者M(jìn)W40kDa)，其均在一端封有甲氧基基團(tuán)以及可從NektarTherapeutics獲得；最佳聚乙二醇化的蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)確定通常是需要的(Veronese,等人,J.BioactiveCompatiblePolymers12:196-207(1997))。最佳聚乙二醇化的條件利用不同的PAL：PEG比率(考慮到蛋白質(zhì)的摩爾比連同每個(gè)蛋白質(zhì)單體的賴(lài)氨酸數(shù)量)、不同的pH、不同的緩沖液、各種溫度和孵育時(shí)間來(lái)確定。高PAL蛋白質(zhì)：PEG衍生比率是必要的，因?yàn)樵鶳AL具有大量的賴(lài)氨酸(每個(gè)圓紅冬孢酵母菌(Rt)和多變魚(yú)腥藻單體分別含29和18個(gè)賴(lài)氨酸)，也因?yàn)槲葱揎椀腜AL反復(fù)注射到小鼠體內(nèi)后表現(xiàn)出免疫反應(yīng)性，還因?yàn)槁阈?野生型)PAL暴露至蛋白酶后很快失活。通過(guò)–20℃冷凍停止聚乙二醇化反應(yīng)并通過(guò)SDS-PAGE、MALDI-TOF質(zhì)譜分析法以及活性、蛋白水解敏感性和免疫反應(yīng)性評(píng)估來(lái)分析樣本。在活性、蛋白水解和免疫評(píng)估之前，為了除去多余的未反應(yīng)的PEG，利用Tube-O-Dialyzer(GenoTechnology)用pH值為8.5的0.05M磷酸鉀緩沖液于4℃攪拌透析反應(yīng)過(guò)夜。利用NI蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑盒(GenoTechnology)確定蛋白質(zhì)濃度之后，如前所述，利用標(biāo)準(zhǔn)的反應(yīng)條件對(duì)未衍生化的和PEG衍生化的PAL樣本進(jìn)行PAL活性測(cè)量?；铙w外表征之后，利用PKU小鼠模型對(duì)最有望的聚乙二醇化的治療候選者進(jìn)行活體內(nèi)試驗(yàn)。表征利用PAL消光系數(shù)(針對(duì)RtPAL和AvPAL分別為0.5和0.75mgmL-1cm-1)在280nm處測(cè)定非修飾的蛋白質(zhì)樣本和聚乙二醇化的蛋白質(zhì)樣本的蛋白質(zhì)濃度，該濃度利用NI蛋白質(zhì)檢測(cè)(GenoTechnology)計(jì)算，該NI蛋白質(zhì)檢測(cè)包括樣本處理，以去除可能干擾準(zhǔn)確的蛋白質(zhì)濃度測(cè)定的非蛋白質(zhì)污染物。PEG-PAL產(chǎn)物用MALDI-TOFMS表征，以確定附著至每個(gè)PAL單體的PEG分子數(shù)量，以及利用活性評(píng)估、SDS-PAGE和非變性凝膠分析法表征，以分別確保活性保持、衍生化完全以及四聚物PAL結(jié)構(gòu)無(wú)損傷。對(duì)于PAL和PEG-PAL樣本，MALDI-TOF質(zhì)譜分析需要使用0.5M尿素或者0.025M鹽酸胍，以改善亞基解離和物種檢測(cè)的可再現(xiàn)性。PEG-PAL產(chǎn)物用肽圖譜技術(shù)表征以測(cè)定位點(diǎn)特異性聚乙二醇化(LC/ESI-MSD)以及用三硝基苯磺酸(TNBS)以測(cè)定聚乙二醇化前后的游離胺滴定。肽圖譜確定聚乙二醇化在多數(shù)以賴(lài)氨酸終止的胰蛋白酶肽上的相對(duì)占有率，然而，由于尺寸和多個(gè)臨近的賴(lài)氨酸胰蛋白酶肽，并非所有的位點(diǎn)利用這項(xiàng)技術(shù)都是可見(jiàn)的。TNBS檢測(cè)法更準(zhǔn)確地限定了每摩爾酶的平均PEG分子數(shù)量，但不提供關(guān)于對(duì)哪些位點(diǎn)進(jìn)行聚乙二醇化的信息。出于此因，兩種測(cè)定法均使用以及相輔相成。通過(guò)PEG的PAL產(chǎn)物衍生化百分比的粗略估算值可以通過(guò)SDS-PAGE和非變性凝膠分析法確定。利用酶法測(cè)定評(píng)估聚乙二醇化前后的比活以及提供有關(guān)四聚物PAL結(jié)構(gòu)無(wú)損傷的證據(jù)。PAL活性測(cè)定PAL活性測(cè)定利用CaryUV分光光度計(jì)(Cary50)以動(dòng)力學(xué)模式進(jìn)行。PAL對(duì)L-苯丙氨酸底物的活性在室溫(25℃)下通過(guò)測(cè)量反式肉桂酸的生產(chǎn)(其通過(guò)290nm處的吸光度增加來(lái)監(jiān)測(cè))來(lái)測(cè)定(Hodgins,(1968)，出處同上)。反式肉桂酸在290nm處的摩爾消光系數(shù)是10,238LM-1cm-1。反應(yīng)混合物包含含于pH值為8.5的100mMTris-HCl緩沖液的22.5mM苯丙氨酸。對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量來(lái)說(shuō)，最終酶濃度是0.0035mg/mL，但對(duì)于動(dòng)力學(xué)研究來(lái)說(shuō)，該測(cè)定中的酶濃度調(diào)整使得每分鐘在290nm處的斜度在0.005至0.02的范圍內(nèi)?；钚詳?shù)據(jù)表示為比活(μmol×min–1mg–1)。一單位的PAL定義為室溫下每分鐘產(chǎn)生1μmol反式肉桂酸的酶的量。實(shí)施例4活體外半衰期和免疫原性的檢測(cè)生化表征之后，利用三種不同的互補(bǔ)技術(shù)(Westernblot、ELISA和免疫沉淀反應(yīng)(IP))針對(duì)由注射了原生PAL(非聚乙二醇化的PAL)的PKU小鼠產(chǎn)生的抗體，對(duì)最有望的PEG-PAL候選者進(jìn)行免疫反應(yīng)性篩選。對(duì)于Westernblot分析，將PAL抗血清(來(lái)自注射了原生PAL的小鼠)按1:10,000稀釋使用。將來(lái)自緩沖液處理的小鼠的血清進(jìn)行相同的稀釋作為陰性對(duì)照組。將第二抗體堿性磷酸酶共軛的山羊抗小鼠IgG(Promega)稀釋至1:5,000并利用堿性磷酸酶底物WesternBlue(Promega)顯色。采用含于PBS的1mg/mLPAL以及用PBS、0.05％吐溫-20、2％BSA進(jìn)行封閉的標(biāo)準(zhǔn)程序之后，利用Nunc/ImmunoMaxisorp板(NalgeNuncInternational)執(zhí)行ELISA檢測(cè)。在EB封閉液(PBS、0.05％吐溫-20、2％BSA)中將小鼠抗血清(來(lái)自暴露于原生PAL的小鼠)按1:10,000稀釋?zhuān)约皩RP-山羊抗小鼠IgG用作第二抗體，其中將TMB用于450nm檢測(cè)。免疫沉淀反應(yīng)被用來(lái)檢測(cè)PAL抗體結(jié)合。在TTBS緩沖液(含有0.1％吐溫的Tris緩沖鹽水)中孵育蛋白質(zhì)樣本(PAL或者聚乙二醇化的PAL)以及在添加抗體樣本之前測(cè)量PAL活性。用8倍過(guò)量的陽(yáng)性對(duì)照抗PAL血清和利用非免疫小鼠血清的副本陰性對(duì)照反應(yīng)孵育每個(gè)樣本。孵育之后，考慮到磁珠的小鼠IgG結(jié)合能力，過(guò)量添加蛋白質(zhì)GSepharose4(50％，v/v)，以及4℃旋轉(zhuǎn)再次孵育所述樣本過(guò)夜。通過(guò)離心作用回收上清液以及在所述上清液上測(cè)定每個(gè)樣本的PAL活性。未丟棄沉淀磁珠(beadpellet)，以便可以執(zhí)行通過(guò)Westernblot的進(jìn)一步分析。為確認(rèn)抗體-磁珠結(jié)合已經(jīng)發(fā)生，將Westernblot用來(lái)檢測(cè)所述磁珠上的PAL抗原。用TTBS和TBS緩沖液對(duì)PAL結(jié)合步驟之后通過(guò)離心作用已回收的磁珠進(jìn)行多次清洗。這些清洗之后，向所述磁珠添加SDS-PAGE上樣緩沖液并95℃加熱所述樣本5min。然后利用PAL抗血清通過(guò)Westernblot分析樣本。如通過(guò)Westernblot檢測(cè)的那樣，抗體結(jié)合顯示差的酶變異體相應(yīng)地在沉淀磁珠組分中幾乎沒(méi)有PAL以及表現(xiàn)出的殘留在上清液中的活性與顯示高抗體結(jié)合的原生未修飾的PAL相比更高。實(shí)施例5蛋白酶敏感性檢測(cè)關(guān)于來(lái)自圓紅冬孢酵母菌的原生PAL的蛋白酶圖譜研究已經(jīng)指出蛋白水解敏感性的基本位點(diǎn)。這類(lèi)位點(diǎn)的去除可以降低或者消除蛋白水解敏感性并對(duì)有效PKU酶取代的發(fā)展有貢獻(xiàn)。然而，這類(lèi)蛋白水解敏感性位點(diǎn)的消除可以導(dǎo)致酶活性的降低或者喪失。蛋白質(zhì)工程已經(jīng)創(chuàng)建保留活性的改善型PAL(和PEG-PAL)突變體之后，通過(guò)利用胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶雞尾酒的孵育，繼之以活性保留(通過(guò)OD290測(cè)量)和減少的蛋白質(zhì)裂解(通過(guò)PAGE凝膠分析)的監(jiān)測(cè)而進(jìn)行的蛋白酶抗性篩選使得可能識(shí)別具有適當(dāng)?shù)幕铙w外性質(zhì)的突變體，以用于活體內(nèi)檢測(cè)。蛋白水解穩(wěn)定性將通過(guò)利用蛋白酶雞尾酒的孵育進(jìn)行評(píng)估，所述蛋白酶雞尾酒接近腸道環(huán)境以及包含2.3mM胰蛋白酶、3.5mM胰凝乳蛋白酶、3.05mM羧肽酶A和3.65mM羧肽酶B。蛋白水解檢測(cè)將涉及向PAL溶液添加蛋白酶的酶法孵育，以確定受測(cè)的不同蛋白質(zhì)變異體(聚乙二醇化或者非聚乙二醇化或者進(jìn)行其他化學(xué)修飾的原生或者突變體蛋白質(zhì))其蛋白酶敏感度，包含蛋白酶暴露之后活性保留和穩(wěn)定性保留的時(shí)間過(guò)程。SDS-PAGE和MALDI-TOF質(zhì)譜繪圖實(shí)驗(yàn)(繪圖experiment)將用來(lái)測(cè)定任何蛋白酶敏感位點(diǎn)的位置(Kriwacki，R.W.,等人，J.Biomol.Tech.9(3):5-15(1980))。這些繪圖結(jié)果對(duì)于蛋白酶易感性基本位點(diǎn)(例如已經(jīng)確認(rèn)的兩種基本位點(diǎn))的測(cè)定會(huì)是重要的，以便所有主要的敏感性位點(diǎn)可以利用聚乙二醇化保護(hù)和/或突變來(lái)去除，以去除易感區(qū)域和/或保護(hù)易感區(qū)域不受PAL構(gòu)架的影響。實(shí)施例6聚乙二醇化的NpPAL和AvPAL的生成通常情況下，NpPAL和AvPAL的聚乙二醇化均涉及混合蛋白質(zhì)和SUNBRIGHTME-200HS20kDaNHS-活化的PEG(NOF)。用于聚乙二醇化的方案，利用NHS-活化的20kDa直鏈PEG的標(biāo)準(zhǔn)“HC”方法：1)蛋白質(zhì)內(nèi)毒素的存在評(píng)估.將蛋白質(zhì)溶液(0.1mL)在0.9mL新鮮的MQ水中稀釋并用手提式CharlesRiver設(shè)備(EndoPTS)按0.5EU/mL的敏感性水平對(duì)其進(jìn)行內(nèi)毒素檢測(cè)。如果內(nèi)毒素大于0.5EU/mL，則最先通過(guò)MustangE過(guò)濾，然后通過(guò)SterogeneEtox樹(shù)脂或者通過(guò)進(jìn)一步的色譜純化減少內(nèi)毒素。通過(guò)穿過(guò)pH7.8的DEAEFF(Amersham)，減少量有限但足夠有用了。2)蛋白質(zhì)的濃度和緩沖液更換.蛋白質(zhì)濃縮至大于25mg/mL但小于或等于75mg/mL以及緩沖液更換為pH值為8.5的50mMKPO4。如果用旋轉(zhuǎn)濾波器來(lái)制備這種濃度，首先通過(guò)僅僅用緩沖液，按降低的速度和時(shí)間(3000rpm，3min)旋轉(zhuǎn)，然后對(duì)保留的緩沖液以與步驟1中蛋白質(zhì)相同的方式進(jìn)行內(nèi)毒素檢測(cè)從而進(jìn)行濾波器內(nèi)毒素檢測(cè)。pH值為8.5的50mMKPO4的緩沖液批記錄/配方由水(QS至1L)、磷酸氫二鉀(48.75mM的8.4913g/L)和磷酸二氫鉀(1.25mM的0.17011g/L)組成。將溶液通過(guò)0.2μm過(guò)濾器過(guò)濾并于室溫下儲(chǔ)存。將濃縮產(chǎn)物通過(guò)MustangEAcrodisc過(guò)濾器緩慢過(guò)濾(1-2mL/min)。測(cè)量用pH值為7.5的無(wú)菌TBS稀釋和空白的樣本的A280，以確定蛋白質(zhì)濃度。NpPAL和AvPAL的消光系數(shù)分別為0.83和0.75。3)NpPAL和AvPAL的聚乙二醇化.將通常儲(chǔ)存于–80℃的PEG加熱至室溫。向PEG添加KPO4緩沖液以通過(guò)按最高速度漩渦混合，以及手動(dòng)猛烈搖晃以確保所有的大塊懸浮起來(lái)實(shí)現(xiàn)PEG重新懸浮。替代性地，該P(yáng)EG重新懸浮在pH～5的水中。首先潤(rùn)濕該P(yáng)EG，繼之以通過(guò)非常輕柔的倒置進(jìn)行混合，這之后的1min之內(nèi)向懸浮好的PEG溶液添加蛋白質(zhì)。將裹于鋁箔的管置于震蕩器的軸上并于室溫下非常輕柔地震蕩3h。用TBS(pH7.5)填充所述管并進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾。懸浮液或者即刻配制或者4℃儲(chǔ)存以用于配制。4)配制.配制緩沖液配方/批記錄由水(QS至1L)、Tris-Base(3.2mM)、Tris-HCl(16.8mM)和氯化鈉組成；緩沖液通過(guò)0.2μm過(guò)濾器過(guò)濾并于室溫下儲(chǔ)存。利用帶有100MWCO再生纖維素膜的Vivaflow50(小批量)或者Vivaflow200(大批量)對(duì)緩沖液進(jìn)行切向流過(guò)濾。利用MQ水、0.1NNaOH以及再用200mL的水沖洗溶液。用pH值為7.5的TBS按50mL/min錯(cuò)流平衡溶液。測(cè)定滲透物的pH，以確保pH為7.5。溶液通過(guò)首先用TBS稀釋大約3倍并恢復(fù)最初體積進(jìn)行緩沖液更換至少四次。對(duì)于Vivaflow50和200，錯(cuò)流通常均為180-200mL/min。最終產(chǎn)品通過(guò)MustangE過(guò)濾。用1.9mL新鮮無(wú)菌水稀釋0.1mL之后評(píng)估內(nèi)毒素的存在。如果內(nèi)毒素大于1EU/mL，則利用SterogeneEtox凝膠降低內(nèi)毒素。配制的無(wú)菌聚乙二醇化的NpPAL或者AvPAL被密封在小瓶中并于–70℃置放，直至用于活體內(nèi)研究。實(shí)施例7AvPAL變異體(半胱氨酸突變體)的生成在AvPAL多肽中進(jìn)行氨基酸取代以降低發(fā)生在細(xì)菌表達(dá)的重組蛋白質(zhì)中的聚集。蛋白質(zhì)聚集可以降低酶活性和/或提高活體內(nèi)免疫原性。一種這類(lèi)形式聚集的發(fā)生是由于鏈間二硫鍵的形成。為最大限度地減少這種可能性，各種AvPAL半胱氨酸殘基，單獨(dú)或者組合地，被絲氨酸殘基取代。AvPAL多肽在位置64、235、318、424、503和565上具有6個(gè)半胱氨酸殘基(SEQIDNO:4)。生成了如下的AvPAL半胱氨酸單突變體：AvPAL_C64S(SEQIDNO:7)、AvPAL_C318S(SEQIDNO:8)、AvPAL_C503S(SEQIDNO:9)和AvPAL_C565S(SEQIDNO:10)。還生成了AvPAL半胱氨酸雙突變體：AvPAL_S565SC503S(SEQIDNO:11)。圖5A-5E顯示這些AvPAL半胱氨酸突變體的氨基酸序列。克隆AvPAL基因是利用正向引物AvarPALfor(5’-CACTGTCATATGAAGACACTATCTCAAGCACAAAG-3’)(SEQIDNO:18)和逆向引物AvarPALrev(5’-CACTGTCTCGAGATGCAAGCAGGGTAAGATATCTTG-3’)(SEQIDNO:19)從多變魚(yú)腥藻基因組DNA(ATCC29413-U，QiagenDNeasy試劑盒)擴(kuò)增得到的。由此產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物用Taq處理，然后連接入pCR2.1TOPOTA(Invitrogen)。由此產(chǎn)生的質(zhì)粒稱(chēng)為1p40。添加5’NheI位點(diǎn)以及通過(guò)SOE-PCR去除內(nèi)部NheI位點(diǎn)。上游AvPAL片段是利用正向引物N-Nhe-AvPAL(5’-CACTGTGCTAGCATGAAGACACTATCTCAAGCACAAAG-3’)(SEQIDNO:20)和逆向引物Nhe-AvPALrev(5’-GGAAATTTCCTCCATGATAGCTGGCTTGGTTATCAACATCAATTAGTGG-3’)(SEQIDNO:21)從1p40擴(kuò)增得到的，以及下游AvPAL片段是利用正向引物Nhe-AvPALfor(5’-CCACTAATTGATGTTGATAACCAAGCCAGCTATCATGGAGGAAATTTCC-3’)(SEQIDNO:22)和逆向引物AvPALrev-r(5’-ACAGTGGCGGCCGCTTAATGCAAGCAGGGTAAGATATCTTG-3’)(SEQIDNO:23)從1p40擴(kuò)增得到的。在單PCR反應(yīng)中，這兩種PCR產(chǎn)物被退火以及利用DNA聚合酶延伸以產(chǎn)生全長(zhǎng)AvPAL基因，然后利用引物N-Nhe-AvPAL和AvPALrev-r進(jìn)行擴(kuò)增。由此產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物用NheI消化、用Klenow補(bǔ)平、用NotI消化以及連接入pET28a+載體(其通過(guò)用NdeI消化、用Klenow補(bǔ)平以及用NotI消化得以制備)。由此產(chǎn)生的質(zhì)粒稱(chēng)為3p86-23。通過(guò)PCR添加新的限制性酶切位點(diǎn)。AvPAL是利用正向引物AvEcoRIfor(5’-CACTGTGAATTCATGAAGACACTATCTCAAGCACAAAG-3’)(SEQIDNO:24)和逆向引物AvSmaIrev(5’-CACTGTCCCGGGTTAATGCAAGCAGGGTAAGATATCT-3’)(SEQIDNO:25)從質(zhì)粒3p86-23擴(kuò)增得到。由此產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物用EcoRI和SmaI消化以及連接入通過(guò)EcoRI和SmaI消化的pIBX7載體。由此產(chǎn)生的質(zhì)粒稱(chēng)為7p56Av3。半胱氨酸突變體AvPAL基因中的兩個(gè)半胱氨酸密碼子(對(duì)應(yīng)于AvPAL多肽的位置503和565)通過(guò)定點(diǎn)誘變(QuickChangeXLII，Stratagene)用絲氨酸密碼子取代。位置503上的半胱氨酸密碼子利用正向引物Av_C503S(5’-GTCATTACGATGCACGCGCCTCTCTATCACCTGCAACTGAG-3’)(SEQIDNO:26)和逆向引物Av_C503Srev(5’-CTCAGTTGCAGGTGATAGAGAGGCGCGTGCATCGTAATGAC-3’)(SEQIDNO:27)通過(guò)PCR更換為質(zhì)粒7p56Av3中的絲氨酸密碼子。該絲氨酸密碼子用下劃線標(biāo)出以及編碼鏈中G到C的突變(非編碼鏈中C到G突變)以粗體顯示。由此產(chǎn)生的質(zhì)粒稱(chēng)為j282。位置565上的半胱氨酸密碼子利用正向引物Av_C565S(5’-CAGTTCAAGATATCTTACCCTCCTTGCATTAACCCGGGCTGC-3’)(SEQIDNO:28)和逆向引物Av_C565Srev(5’-GCAGCCCGGGTTAATGCAAGGAGGGTAAGATATCTTGAACTG-3’)(SEQIDNO:29)更換為質(zhì)粒j282中的絲氨酸密碼子。該絲氨酸密碼子用下劃線標(biāo)出以及編碼鏈中G到C的突變(非編碼鏈中C到G突變)以粗體顯示。由此產(chǎn)生的質(zhì)粒稱(chēng)為j298a。在AvPAL多肽位置64、318和565上的AvPAL基因中的半胱氨酸密碼子類(lèi)似地利用如下的引物對(duì)以絲氨酸密碼子取代：C64S，正向引物Av_C64S(5’-GCAGGGTATTCAGGCATCTTCTGATTACATTAATAATGCTGTTG-3’)(SEQIDNO:30)和逆向引物Av_C64Srev(5’-CAACAGCATTATTAATGTAATCAGAAGATGCCTGAATACCCTGC-3’)(SEQIDNO:31)；C318S，正向引物Av_C318S(5’-CAAGATCGTTACTCACTCCGATCCCTTCCCCAGTATTTGGGGC-3’)(SEQIDNO:32)和逆向引物Av_C318Srev(5’-GCCCCAAATACTGGGGAAGGGATCGGAGTGAGTAACGATCTTG-3’)(SEQIDNO:33)；以及C565S，正向引物Av_C565S(SEQIDNO:28)和逆向引物Av_C565Srev(SEQIDNO:29)。所述絲氨酸密碼子用下劃線標(biāo)出以及編碼鏈中G到C的突變和非編碼鏈C到G的突變以粗體顯示。實(shí)施例8AvPAL變異體(半胱氨酸突變體)的活體外酶活性該項(xiàng)研究的目的是確定AvPAL多肽中各種半胱氨酸殘基的絲氨酸取代對(duì)活體外苯丙氨酸解氨酶(PAL)酶活性的影響。如實(shí)施例7中所述克隆了AvPAL變異體(即半胱氨酸突變體。AvPAL半胱氨酸突變體表達(dá)質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化入細(xì)菌，以及AvPAL半胱氨酸突變體多肽如實(shí)施例1中所述進(jìn)行表達(dá)以及如實(shí)施例2中所述進(jìn)行純化。野生型(WT)AvPAL和AvPAL半胱氨酸突變體如實(shí)施例3中所述進(jìn)行活體外PAL酶活性檢測(cè)。表1顯示，與非聚乙二醇化的WTAvPAL相比，純化的非聚乙二醇化的AvPAL半胱氨酸突變體蛋白質(zhì)的活體外PAL比活因位置64(AvPAL_C64S)上半胱氨酸殘基的絲氨酸取代而降低，但并未受到位置503或565其一上或者503和565兩個(gè)位置(分別是AvPAL_C503S、AvPAL_C565S和AvPAL_C565SC503S)上半胱氨酸殘基的絲氨酸取代的不利影響。表1：AvPAL半胱氨酸突變體的比活A(yù)vPAL蛋白質(zhì)聚乙二醇化比活(U/mg)WTAvPAL-1.7AvPAL_C503S-1.9AvPAL_C64S-1.3AvPAL_C565SE1-2.0AvPAL_C565SE2-2.1AvPAL_C565SC503S-2.2WTAvPAL+1.1AvPAL_C565SC503S+1.1為了確定絲氨酸殘基的引入是否對(duì)聚乙二醇化的AvPAL蛋白質(zhì)的酶催活性有所影響，如實(shí)施例6中所述對(duì)WTAvPAL和半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S進(jìn)行了聚乙二醇化。表1顯示聚乙二醇化的AvPAL蛋白質(zhì)的活體外PAL比活并未受到503和565兩個(gè)位置上的半胱氨酸殘基的絲氨酸取代的不利影響。實(shí)施例9AvPAL變異體(半胱氨酸突變體)的活體外生化表征該項(xiàng)研究的目的是確定AvPAL多肽中各種半胱氨酸殘基的絲氨酸取代對(duì)如下三項(xiàng)的影響：(1)加速穩(wěn)定性；(2)聚集體形成；以及(3)位點(diǎn)特異性聚乙二醇化。加速穩(wěn)定性AvPAL中半胱氨酸殘基的絲氨酸取代對(duì)活體外穩(wěn)定性的影響通過(guò)如下方式測(cè)定：將純化的AvPAL半胱氨酸突變體(聚乙二醇化的或者非聚乙二醇化的)于37℃儲(chǔ)存不同的時(shí)間段，然后如實(shí)施例3中所述，測(cè)量這些蛋白質(zhì)的活體外PAL比活。野生型AvPAL和非聚乙二醇化的或者聚乙二醇化的AvPAL半胱氨酸突變體如實(shí)施例8中所述進(jìn)行制備。如圖6A中所示，非聚乙二醇化的AvPAL蛋白質(zhì)37℃至少5天保持其比活穩(wěn)定性，以及未受到位置565上或者503和565兩個(gè)位置上半胱氨酸殘基的絲氨酸取代的不利影響。同樣地，如圖6B中所示，聚乙二醇化的AvPAL蛋白質(zhì)37℃至少6天保持其比活穩(wěn)定性。37℃下6天之后，發(fā)現(xiàn)與野生型AvPAL和半胱氨酸AvPAL雙突變體AvPAL_C565SC503S相比，半胱氨酸AvPAL單突變體AvPAL_C565S的穩(wěn)定性有所降低。聚集體形成AvPAL中半胱氨酸殘基的絲氨酸取代對(duì)溶液中蛋白質(zhì)聚集體形成的影響通過(guò)利用變性和非變性凝膠電泳或者利用SEC-HPLC對(duì)純化的非聚乙二醇化的野生型AvPAL和AvPAL半胱氨酸突變體進(jìn)行分離來(lái)測(cè)定。純化的AvPAL制劑在變性條件(4-12％NuPAGEBis-Tris)或者非變性條件(8％Tris-Gly，pH8.3)下通過(guò)凝膠電泳來(lái)分離。分離得到的AvPAL蛋白質(zhì)用考馬斯藍(lán)染色。純化的AvPAL制劑通過(guò)SEC-HPLC進(jìn)行分離。將AvPAL蛋白質(zhì)裝入含于pH值為6.9的20mM磷酸鈉、300mMNaCl的TSK凝膠柱(G3000SWxl，7.8mmx30cm，5μm(TosohBioscience，LLC))，并用0.5mL/min的流速洗脫。將分離得到的AvPAL蛋白質(zhì)在Agilent系列1100分光計(jì)上進(jìn)行分析。通過(guò)凝膠電泳(圖7A)或者SEC-HPLC(圖7B)判斷發(fā)現(xiàn)，野生型AvPAL制劑以及AvPAL_C503S和AvPAL_C64S制劑中存在聚集體，但AvPAL_C565S和AvPAL_C565SC503S制劑中則無(wú)聚集體。位點(diǎn)特異性聚乙二醇化AvPAL中半胱氨酸殘基的絲氨酸取代對(duì)位點(diǎn)特異性聚乙二醇化的影響通過(guò)如下方式得以測(cè)定：如實(shí)施例6中所述，對(duì)野生型AvPAL和半胱氨酸雙突變體AvPAL_C503SC565S進(jìn)行聚乙二醇化，然后與如下AvPAL賴(lài)氨酸殘基上的相對(duì)聚乙二醇化進(jìn)行比較：K2、K10、K32、K115、K145、K195、K301、K335、K413、K419、K493、K494和K522。在8M尿素中對(duì)大約100μg(濃度10μg/μL，共10μL)的非聚乙二醇化的或者聚乙二醇化的AvPAL蛋白質(zhì)進(jìn)行變性處理。然后將變性的蛋白質(zhì)在含于0.8M尿素的pH值為8.2的胰蛋白酶100μL反應(yīng)體積中于37℃下消化過(guò)夜(～20h)。通過(guò)于37℃下用1μL的1MDTT處理1h來(lái)還原胰蛋白酶消化的蛋白質(zhì)，然后用3μL15％TFA淬滅。在C18反相柱上對(duì)消化的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。聚乙二醇化的AvPAL肽的每個(gè)的聚乙二醇化百分比通過(guò)相應(yīng)的非聚乙二醇化的肽的消減肽圖譜(substractivepeptidemapping)來(lái)計(jì)算。如圖8中所示，AvPAL蛋白質(zhì)：PEG的比率為1:3時(shí)，任何賴(lài)氨酸(K)殘基的聚乙二醇化百分比并無(wú)顯著差異，但可能K419是個(gè)例外，其中與野生型AvPAL相比，半胱氨酸雙突變體C565SC503S的聚乙二醇化百分比低得多。然而，按增加的AvPAL蛋白質(zhì)：PEG比率利用半胱氨酸雙突變體獲得的結(jié)果(其中未觀察到劑量應(yīng)答關(guān)系)，連同相對(duì)小的聚乙二醇化百分比，表明從K1419處觀察到的差異可能是無(wú)意義的。因此，位置503和565上的半胱氨酸殘基的絲氨酸取代看起來(lái)并未影響AvPAL的位點(diǎn)特異性聚乙二醇化。實(shí)施例10AvPAL蛋白質(zhì)的聚集機(jī)制為了弄清細(xì)菌表達(dá)的AvPAL蛋白質(zhì)的聚集機(jī)制，進(jìn)行了多項(xiàng)研究。對(duì)純化的AvPAL制劑進(jìn)行濃縮并對(duì)濃縮的蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行37℃2h孵育，這加速了純化的AvPAL蛋白質(zhì)在溶液中的聚集。通過(guò)利用SEC-HPLC進(jìn)行AvPAL蛋白質(zhì)分離來(lái)檢測(cè)聚集。為確定二硫化物交聯(lián)是否是聚集發(fā)生的原因，向濃縮的蛋白質(zhì)溶液中添加50mM二硫蘇糖醇(DTT)，然后37℃孵育2h。在細(xì)菌中表達(dá)的AvPAL蛋白質(zhì)如實(shí)施例2中所述進(jìn)行純化以及利用旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器(MilliporeBiomax–10KNMWL)濃縮。將蛋白質(zhì)在EppendorfCentrifuge5415C中以約15,000g旋轉(zhuǎn)幾分鐘。對(duì)于傾向于聚集的半胱氨酸突變體(例如AvPAL_C503S和AvPAL_C64S)，蛋白質(zhì)濃縮至約20mg/mL并進(jìn)行37℃2h孵育。對(duì)于抗聚集的半胱氨酸突變體(例如AvPAL_C565S和AvPAL_C565SC503S)，蛋白質(zhì)濃縮至約40mg/mL并進(jìn)行37℃2h孵育。如表2中所示，純化的AvPAL半胱氨酸突變體AvPAL_C64S和AvPAL_C503S的制劑在37℃2h的孵育后形成了聚集體。正如所料，AvPAL蛋白質(zhì)在37℃2h的孵育之前進(jìn)行濃縮的情況下，這種聚集更加嚴(yán)重。該聚集可以通過(guò)將濃縮的蛋白質(zhì)暴露于DTT得以阻斷，這表明該聚集是二硫化物交聯(lián)引起的。相比之下，純化的AvPAL半胱氨酸突變體AvPAL_C565S和AvPAL_C565SC503S的制劑在37℃2h的孵育后未形成聚集體，這表明位置565上的半胱氨酸殘基參與經(jīng)由二硫化物交聯(lián)的AvPAL聚集。表2：AvPAL半胱氨酸突變體與二硫化物交聯(lián)相關(guān)的聚集情況AvPAL蛋白質(zhì)處理聚集體形成AvPAL_C503S37℃/2h+AvPAL_C64S37℃/2h+AvPAL_C565SE137℃/2h-AvPAL_C565SE237℃/2h-AvPAL_C565SC503S37℃/2h-AvPAL_C503S濃縮+37℃/2h++AvPAL_C64S濃縮+37℃/2h++AvPAL_C565SE1濃縮+37℃/2h-AvPAL_C565SE2濃縮+37℃/2h-AvPAL_C565SC503S濃縮+37℃/2h-AvPAL_C503S濃縮+DTT+37℃/2h-AvPAL_C64S濃縮+DTT+37℃/2h-AvPAL_C565SE1濃縮+DTT+37℃/2h-AvPAL_C565SE2濃縮+DTT+37℃/2h-AvPAL_C565SC503S濃縮+DTT+37℃/2h-為確定哪個(gè)半胱氨酸殘基作為游離巰基存在，純化的AvPAL制劑在8M尿素的存在下變性、通過(guò)碘乙酰胺烷基化、利用胰蛋白酶消化以及通過(guò)LC/MS分析。所有的AvPAL半胱氨酸殘基都被碘乙酰胺標(biāo)記，這表明細(xì)菌表達(dá)的AvPAL的所有半胱氨酸殘基均作為游離巰基存在(數(shù)據(jù)未提供)。為確定哪個(gè)半胱氨酸殘基存在于原生蛋白質(zhì)的表面上，純化的AvPAL制劑首先用N-乙基馬來(lái)酰亞胺(NEM)處理，然后在8M尿素的存在下變性、通過(guò)碘乙酰胺烷基化、利用胰蛋白酶消化以及通過(guò)LC/MS分析。位置235和424上的半胱氨酸殘基未通過(guò)NEM烷基化，以及位置318上的半胱氨酸殘基通過(guò)NEM只是部分地烷基化，這表明位置64、503和565上的半胱氨酸殘基在原生AvPAL的表面上以及位置318上的半胱氨酸殘基部分地暴露在原生AvPAL的表面上(數(shù)據(jù)未提供)。為確定哪個(gè)半胱氨酸殘基參與鏈間二硫化物交聯(lián)，將純化的非聚乙二醇化的野生型AvPAL制劑的濃度為0.7mg/mL的67μL溶液在37℃的包含20mM碘乙酰胺的8M尿素中進(jìn)行變性和烷基化1h，然后在25℃的pH值為8.2的胰蛋白酶100μL反應(yīng)體積中消化過(guò)夜(～17.5h)。胰蛋白酶消化的蛋白質(zhì)通過(guò)質(zhì)譜進(jìn)行分離和分析，其中確認(rèn)對(duì)應(yīng)于預(yù)期二硫化物的肽并定量為總離子計(jì)數(shù)(TIC)。表3顯示對(duì)二硫化物對(duì)的C503-C503、C503-C565、C565-C318和C565-C565檢測(cè)。在純化的AvPAL制劑的二硫化物對(duì)中發(fā)現(xiàn)了位置565上，以及在較小程度上，發(fā)現(xiàn)了位置503上的半胱氨酸殘基。表3：聚集體二硫化物對(duì)二硫化物對(duì)結(jié)果(TIC/1000)C64-C318n.d.#C64-C64n.d.C64-C503n.d.C64-C565n.d.C503-C318n.d.C503-C50311C503-C565112C565-C31813C565-C56537C318-C318n.d.#未檢測(cè)出的為確定除了二硫化物交聯(lián)之外，是否有其他的機(jī)制可能參與AvPAL蛋白質(zhì)聚集，進(jìn)行了多項(xiàng)研究。將純化的AvPAL制劑用0.05％吐溫或者10mMEDTA孵育，然后如實(shí)施例9中所述通過(guò)SEC-HPLC進(jìn)行分離。由于疏水性相互作用，吐溫減少了蛋白質(zhì)聚集，以及由于二價(jià)陽(yáng)離子的存在，EDTA減少了蛋白質(zhì)聚集。如圖9中所示，暴露于0.05％吐溫或者10mMEDTA沒(méi)有對(duì)AvPAL蛋白質(zhì)聚集產(chǎn)生影響。在用10mMEDTA處理的AvPAL中10min時(shí)的附加峰是由210nm波長(zhǎng)處EDTA的吸光導(dǎo)致的。為了進(jìn)一步研究二硫化物交聯(lián)在AvPAL蛋白質(zhì)聚集中的作用，通過(guò)用DTT處理來(lái)還原純化的AvPAL，然后脫鹽再通過(guò)SEC-HPLC進(jìn)行分離。如圖10A中所示，AvPAL蛋白質(zhì)聚集通過(guò)用DTT進(jìn)行處理得以最小化，以及37℃18h孵育之后，聚集體再形成。相比之下，如圖10B中所示，一旦在DTT暴露之后，但是在脫鹽和37℃18h孵育之前，通過(guò)用N-甲基馬來(lái)酰亞胺(NEM)處理進(jìn)行了AvPAL表面半胱氨酸修飾(即烷基化)，聚集體沒(méi)有再形成?；谏衔?，細(xì)菌表達(dá)的AvPAL其聚集看起來(lái)僅僅是由于鏈間二硫鍵的形成，而非由于疏水效應(yīng)或者二價(jià)陽(yáng)離子的存在。位置565和503上的半胱氨酸殘基參與AvPAL制劑中鏈間二硫鍵的形成。實(shí)施例11聚乙二醇化形式的AvPAL變異體(半胱氨酸突變體)的液體制劑為了弄清各種賦形劑(例如穩(wěn)定劑)對(duì)本文提供的制劑中聚乙二醇化形式的AvPAL多肽變異體(例如在位置503和565上具有半胱氨酸殘基的絲氨酸取代)的加速穩(wěn)定性的影響，進(jìn)行了多項(xiàng)研究。如實(shí)施例7中所述制備聚乙二醇化的AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S。利用活體外活性測(cè)定(試管測(cè)定或者平板測(cè)定)對(duì)聚乙二醇化的AvPAL_C565SC503S的不同制劑進(jìn)行加速穩(wěn)定性測(cè)定。對(duì)于試管測(cè)定，在TBS稀釋緩沖液中稀釋純化的聚乙二醇化的AvPAL_C565SC503S，然后加入包含100mMTris-HCl、22.5mMPhe的pH值為8.5的測(cè)定緩沖液中。30℃孵育2min之后，通過(guò)290nm波長(zhǎng)處的吸光度測(cè)量釋放的反式肉桂酸(t-CA)的量。對(duì)于平板測(cè)定，在加了BSA/Phe/Brij中的TBS稀釋緩沖液中稀釋純化的聚乙二醇化的AvPAL_C565SC503S，然后加入包含100mMTris-HCl、22.5mMPhe的pH值為8.5的測(cè)定緩沖液中。30℃孵育10-20min之后，通過(guò)290nm波長(zhǎng)處的吸光度測(cè)量釋放的反式肉桂酸(t-CA)的量。一個(gè)國(guó)際單位(IU)的PAL活性等于1μMolTCA/min。在第一項(xiàng)加速穩(wěn)定性研究中，評(píng)估了pH值對(duì)聚乙二醇化的半胱氨酸雙突變體AvPALAvPAL_C565SC503S的穩(wěn)定性的影響。在pH值從4至9不等的10mM緩沖液和140mMNaCl中預(yù)先配制純化的聚乙二醇化的AvPAL_C565SC503S。緩沖液檢測(cè)：檸檬酸鹽(pH4)、醋酸鹽(pH5)、組氨酸(pH6)、磷酸鹽(pH7)、Tris(pH7.5，pH8)和精氨酸(pH9)。4℃、25℃或者37℃儲(chǔ)存酶制劑30天之后，進(jìn)行活體外活性測(cè)量。觀察pH值為4時(shí)PAL酶活性的總損耗。選定從7到8的pH范圍進(jìn)行進(jìn)一步的評(píng)估。在第二項(xiàng)加速穩(wěn)定性研究中，評(píng)估了pH值和各種賦形劑對(duì)聚乙二醇化的AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S的穩(wěn)定性的影響。在沒(méi)有或者存在0.5％EDTA；0.5％EDTA加0.5％抗壞血酸；或者0.5％EDTA加5mM蛋氨酸(Met)的條件下，于pH值為7、7.5或者8.0的10mMTris和140mMNaCl中預(yù)先配制純化的聚乙二醇化的AvPAL_C565SC503S。4℃、25℃或者37℃儲(chǔ)存酶制劑60天之后，進(jìn)行活體外活性測(cè)量。pH值7.0和7.5在保持酶活性方面看起來(lái)是平衡的，EDTA對(duì)酶活性的影響很小甚或沒(méi)有，以及抗氧化劑抗壞血酸和蛋氨酸對(duì)酶活性有負(fù)面影響。在相同的加速穩(wěn)定性研究中，評(píng)估了AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S的聚乙二醇化的影響。非聚乙二醇化和聚乙二醇化的AvPAL_C565SC503S之間具有類(lèi)似的酶活性損失率。在第三項(xiàng)加速穩(wěn)定性研究中，評(píng)估了作為賦形劑的酶底物和產(chǎn)物對(duì)聚乙二醇化的AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S的穩(wěn)定性的影響。在沒(méi)有或者存在1mMPhe(每摩爾活性位點(diǎn)5mol底物)、2mMTCA(每摩爾活性位點(diǎn)10mol產(chǎn)物)或者0.05％吐溫80(一種表面活性劑)的情況下，于pH值為7.5的10mMTris和140mMNaCl中預(yù)先配制大約12mg/mL(0.2mM)的純化的聚乙二醇化的AvPAL_C565SC503S。4℃、25℃或者37℃儲(chǔ)存酶制劑不同的時(shí)間段后，每周進(jìn)行活體外活性測(cè)量。Phe和t-CA均顯著地提高了酶的穩(wěn)定性，而吐溫對(duì)酶穩(wěn)定性沒(méi)有影響。對(duì)加速穩(wěn)定性研究1、2和3的總結(jié)如圖11所示。在第四項(xiàng)加速穩(wěn)定性研究中，評(píng)估了作為賦形劑的低濃度的Phe和t-CA對(duì)聚乙二醇化的AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S的穩(wěn)定性的影響。在沒(méi)有或者存在0.4mMPhe(每摩爾活性位點(diǎn)2mol底物)或者0.4mMTCA(每摩爾活性位點(diǎn)2mol產(chǎn)物)的情況下，在pH值為7.5的10mMTris和140mMNaCl中預(yù)先配制大約12mg/mL(0.2mM)的純化的聚乙二醇化的AvPAL_C565SC503S。4℃、25℃或者37℃儲(chǔ)存酶制劑不同的時(shí)間段后，每周進(jìn)行活體外活性測(cè)量。低濃度的Phe和t-CA均有效地穩(wěn)定了酶活性。在第五項(xiàng)加速穩(wěn)定性研究中，評(píng)估了作為賦形劑的弱酶底物酪氨酸(Tyr)對(duì)聚乙二醇化的AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S的穩(wěn)定性的影響。在沒(méi)有或者存在1或5mMTyr(分別為每摩爾活性位點(diǎn)5或者25mol的底物)的情況下，在pH值為7.5的10mMTris和140mMNaCl中預(yù)先配制大約12mg/mL(0.2mM)的純化的聚乙二醇化的AvPAL_C565SC503S。4℃、25℃或者37℃儲(chǔ)存酶制劑不同的時(shí)間段后，每周進(jìn)行活體外活性測(cè)量。Tyr對(duì)酶活性穩(wěn)定性具有最小的非劑量依賴(lài)的影響(圖12)。在第六項(xiàng)加速穩(wěn)定性研究中，評(píng)估了作為賦形劑的親核清除劑對(duì)聚乙二醇化的AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S的穩(wěn)定性的影響。在沒(méi)有或者存在1Phe(每摩爾活性位點(diǎn)3mol底物)、2mM親核清除劑(每摩爾活性位點(diǎn)6mol苯甲酸或者吡哆胺)或者1mMPhe和2mM親核清除劑兩者的情況下，于pH值為7.5的10mMTris和140mMNaCl中預(yù)先配制大約20mg/mL(0.33mM)的純化的聚乙二醇化的AvPAL_C565SC503S。4℃或者37℃儲(chǔ)存酶制劑不同的時(shí)間段后，每周進(jìn)行活體外活性測(cè)量。苯甲酸有效地穩(wěn)定了酶活性，但吡哆胺沒(méi)有(圖13A)。沒(méi)有Phe和苯甲酸的附加效應(yīng)，這暗示存在類(lèi)似的穩(wěn)定機(jī)制。苯甲酸和t-CA的穩(wěn)定效應(yīng)暗示，他們作為Phe的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物發(fā)揮作用(見(jiàn)圖13B)。將來(lái)自該六項(xiàng)加速穩(wěn)定性研究的數(shù)據(jù)結(jié)合起來(lái)，以預(yù)測(cè)各種制劑中聚乙二醇化的AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S的有效儲(chǔ)存期限。儲(chǔ)存期限測(cè)定如下：(1)為每個(gè)制劑條件測(cè)定活性衰減率(k衰減)，其遵循一級(jí)動(dòng)力學(xué)；(2)繪制ln(k衰減)v.1/溫度(°K)圖；(3)為給定的制劑條件測(cè)定活性衰減所需的Ea(ΔG衰減)；(4)在給定的溫度下利用算得的Ea和觀察得到的k衰減外推得到4℃時(shí)的k衰減；以及(5)測(cè)定儲(chǔ)存期限(T90)，其是4℃時(shí)酶比活下降≥10％所需的時(shí)間。表4顯示Phe和t-CA極大地提高了聚乙二醇化的AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S的預(yù)測(cè)儲(chǔ)存期限。表4：具有各種賦形劑的聚乙二醇化的半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S的預(yù)測(cè)儲(chǔ)存期限T90(以周為單位)賦形劑42℃37℃25℃4℃*4℃(據(jù)觀察)無(wú)(TBS)0.670.82.112.9～9-13Phe1.632.29.185>20t-CAND2.07.185.8>20*數(shù)字是基于來(lái)自6項(xiàng)不同實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)得出的估算值?？偟膩?lái)說(shuō)，上文的預(yù)先配制研究表明，聚乙二醇化的AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S的最佳pH值是7至7.5?？寡趸瘎┑拇嬖趯?dǎo)致酶活性大幅損失。在加速的條件(25℃和37℃)下，Phe和反式肉桂酸(t-CA)均將rAvPAL-PEG的穩(wěn)定性提高了50％或者更多。每個(gè)rAvPAL-PEG活性位點(diǎn)2倍過(guò)量的Phe或者t-CA便足以穩(wěn)定活性以及更高的濃度看起來(lái)沒(méi)有附加的益處。更弱的PAL底物酪氨酸(Tyr)看起來(lái)沒(méi)有穩(wěn)定酶活性，而苯甲酸對(duì)rAvPAL-PEG活性的穩(wěn)定程度與其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物Phe類(lèi)似。當(dāng)結(jié)合Phe時(shí)，沒(méi)有觀察到苯甲酸具有附加的活性穩(wěn)定化作用，這暗示存在普通的活性穩(wěn)定化機(jī)制。實(shí)施例12聚乙二醇化形式的AvPAL變異體(半胱氨酸突變體)的凍干制劑為了弄清各種固體(例如凍干)制劑對(duì)聚乙二醇化形式的AvPAL多肽變異體(例如在位置503和565上具有半胱氨酸殘基的絲氨酸取代)的活性的影響，進(jìn)行了多項(xiàng)研究。如實(shí)施例7中所述制備聚乙二醇化的AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S。聚乙二醇化的AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S配制如下：(F1)10mg/mLAvPAL_C565SC503S，10mMTris，pH7.5；(F2)10mg/mLAvPAL_C565SC503S，10mMTris，pH7.5，25mg/mL甘露醇；或者(F3)10mg/mLAvPAL_C565SC503S，10mMTris，pH7.5，20mg/mL甘露醇，5mg/mL蔗糖。配制之后，每個(gè)的PAL酶活性為1.7至1.8U/mg。凍干之后，4℃儲(chǔ)存制劑達(dá)26，然后在新鮮的無(wú)菌過(guò)濾的MilliQ水中再懸浮。如實(shí)施例11中所述測(cè)定PAL酶活性。表5顯示各種AvPAL_C565SC503S制劑凍干、儲(chǔ)存或者再懸浮之后，看起來(lái)沒(méi)有活性損失。表5：凍干制劑(LF)之后聚乙二醇化的半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S的比活實(shí)施例13聚乙二醇化的AvPAL變異體的制劑為了弄清各種賦形劑(例如穩(wěn)定劑和防腐劑(即抗菌劑))對(duì)本文提供的制劑中的聚乙二醇化形式的AvPAL多肽變異體(例如在位置503和565(AvPAL_C565SC503S)上具有半胱氨酸殘基的絲氨酸取代)的加速穩(wěn)定性的影響，進(jìn)行了多項(xiàng)研究。如實(shí)施例7中所述配制聚乙二醇化的AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S。如實(shí)施例11中所述，利用活體外活性測(cè)定確定聚乙二醇化的AvPAL_C565SC503S的不同制劑的加速穩(wěn)定性。在初步防腐劑相容性(preservativecompatibility)研究中，評(píng)估了防腐劑(即抗菌劑)的存在對(duì)聚乙二醇化的AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S的活性和穩(wěn)定性的影響。在pH值為7.35的10mMTris緩沖液和135mMNaCl中配制純化的聚乙二醇化的AvPAL_C565SC503S。防腐劑檢測(cè)：苯甲醇(0.15％)；間甲酚(0.3％)；氯甲酚(0.25％)；以及酚(0.5％)。在沒(méi)有防腐劑或者在存在苯甲醇、間甲酚、氯甲酚或者酚的情況下，室溫孵育酶制劑1h之后，進(jìn)行初始活性測(cè)量。4℃儲(chǔ)存酶制劑達(dá)65天之后，進(jìn)行活體外活性測(cè)量。初始酶活性未受防腐劑的影響，以及所述酶與受測(cè)的每種防腐劑相容，雖然觀察到間甲酚的活性緩慢衰減。在第一項(xiàng)防腐劑相容性研究中，評(píng)估了，在存在或者沒(méi)有穩(wěn)定劑(即L-苯丙氨酸(Phe)或者Gly)的情況下，防腐劑(即抗菌劑)的存在對(duì)聚乙二醇化的AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S的活性和穩(wěn)定性的影響。在pH值為7.35的10mMTris緩沖液和135mMNaCl中配制純化的聚乙二醇化的AvPAL_C565SC503S。防腐劑檢測(cè)：苯甲醇(0.15％)；間甲酚(0.3％)；以及酚(0.5％)。穩(wěn)定劑檢測(cè)：Phe(1mM)；以及Gly(1mM)。在沒(méi)有任何防腐劑或者穩(wěn)定劑，或者在存在所述防腐劑的一種、所述穩(wěn)定劑的一種或者所述防腐劑的一種和所述穩(wěn)定劑的一種的各種組合的情況下，4℃、25℃或者40℃儲(chǔ)存酶制劑達(dá)18周之后，進(jìn)行活體外活性測(cè)量。在該項(xiàng)研究中，所有的防腐劑都降低了初始酶活性，以及酚和Gly的組合是強(qiáng)效的酶抑制劑。在所有的情況下，在存在防腐劑時(shí)配制的酶其穩(wěn)定性比單獨(dú)存在Phe的情況下配制的那些酶要低。在接下來(lái)的研究中，在pH值為7.3的50mMTris緩沖液、135mMNaCl中利用12mg/mL(0.19mM)酶制劑獲得了類(lèi)似結(jié)果。在第二項(xiàng)防腐劑相容研究中，評(píng)估了在存在或者沒(méi)有穩(wěn)定劑(即Phe或者Gly)的情況下，不同的Tris緩沖液濃度，以及防腐劑(即抗菌劑)的存在對(duì)聚乙二醇化的AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S的穩(wěn)定性的影響。在pH值為7.3的10mM、25mM或者50mMTris緩沖液和135mMNaCl中配制純化的聚乙二醇化的AvPAL_C565SC503S。防腐劑檢測(cè)：苯甲醇(1.5％)。穩(wěn)定劑檢測(cè)：Phe(1mM)；以及Gly(1mM)。僅僅在不同的Tris緩沖液中，或者在單獨(dú)存在苯甲醇或者Phe或者苯甲醇、Phe和Gly的各種組合的情況下，在50mMTris緩沖液中，4℃、25℃或者40℃儲(chǔ)存酶制劑達(dá)12周之后，進(jìn)行活體外活性測(cè)量。酶活性隨著Tris緩沖液濃度的增加而降低。在受測(cè)濃度下，苯甲醇與所述酶不相容。受測(cè)的所有制劑中的所述酶其穩(wěn)定性比單獨(dú)存在Phe時(shí)的酶制劑要低。在第三項(xiàng)防腐劑相容性研究中，評(píng)估了防腐劑(即抗菌劑)的各種組合以及一種或者多種穩(wěn)定劑(即Phe和Gly)的存在對(duì)聚乙二醇化的AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S的穩(wěn)定性的影響。在pH值為7.35的10mMTris緩沖液和135mMNaCl中配制純化的聚乙二醇化的AvPAL_C565SC503S。防腐劑檢測(cè)：苯甲醇(1.5％)；以及間甲酚(0.3％)。穩(wěn)定劑檢測(cè)：Phe(1mM)；以及Gly(1mM)。單獨(dú)在Phe中或者在Phe、Gly和苯甲醇或間甲酚的各種組合中，4℃、25℃或者40℃儲(chǔ)存酶制劑達(dá)37周之后，進(jìn)行活體外活性測(cè)量。該項(xiàng)研究的結(jié)果如圖14中所示。正如上文所見(jiàn)，制劑中防腐劑的存在降低了初始酶活性，然而，4℃和25℃時(shí)，在包含間甲酚、Phe和Gly的酶制劑中酶活性的損失僅僅是短暫的。發(fā)現(xiàn)這種酶制劑最接近實(shí)施例11中觀察到的針對(duì)單獨(dú)Phe的穩(wěn)定效應(yīng)。在第四項(xiàng)防腐劑相容性研究中，評(píng)估了存在防腐劑(即間甲酚)和穩(wěn)定劑(即Phe)的情況下，不同的Gly濃度對(duì)聚乙二醇化的AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S的穩(wěn)定性的影響。在沒(méi)有Gly或者存在1、3、5、10或者20mMGly的情況下，在pH值為7.2的10mMTris緩沖液、135mMNaCl、1mMPhe和3.2mg/mL(0.32％)中配制純化的聚乙二醇化的AvPAL_C565SC503S。25℃或者40℃儲(chǔ)存酶制劑達(dá)12周之后，進(jìn)行活體外活性測(cè)量。該項(xiàng)研究的結(jié)果如圖15A所示。25℃或者40℃儲(chǔ)存之后的酶活性損失(報(bào)告為歸一化的活性(儲(chǔ)存之前各種制劑中的酶活性％))通過(guò)添加Gly以劑量依賴(lài)性方式降低。如通過(guò)RP-HPLC所確定的，在包含防腐劑的制劑中通過(guò)Gly的酶活性的改善穩(wěn)定性與聚乙二醇化的AvPAL_C565SC503S的主峰的保持很有相關(guān)性。在第五項(xiàng)防腐劑相容性研究中，評(píng)估了存在穩(wěn)定劑(即Phe)但不存在防腐劑的情況下，不同的Gly濃度對(duì)聚乙二醇化的AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S的穩(wěn)定性的影響。存在各種濃度的Gly(從20到100mM的范圍)的情況下，在pH值為7.2的10mMTris緩沖液、135mMNaCl和1mMPhe中配制純化的聚乙二醇化的AvPAL_C565SC503S。40℃儲(chǔ)存酶制劑達(dá)8周之后，進(jìn)行活體外活性測(cè)量。這項(xiàng)研究的結(jié)果如圖15B中所示。40℃儲(chǔ)存之后的酶活性損失通過(guò)在沒(méi)有包含防腐劑的聚乙二醇化的AvPAL_C565SC503S制劑中添加Gly以劑量依賴(lài)性方式降低。實(shí)施例14小鼠體內(nèi)AvPAL變異體(半胱氨酸突變體)及其聚乙二醇化形式的影響這些研究的目的是確定AvPAL多肽中位置503和565上的半胱氨酸殘基的絲氨酸取代對(duì)小鼠體內(nèi)的活體內(nèi)Phe水平的影響?；旧先?006年6月12日提交的先有共同待審的申請(qǐng)?zhí)枮?1/451,999的美國(guó)專(zhuān)利(其以引用方式全部并入本文)的實(shí)施例7到9中所述，對(duì)純合ENU2(也稱(chēng)為BTBRenu2)小鼠體內(nèi)的聚乙二醇化形式的AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S進(jìn)行了活體內(nèi)活性檢測(cè)。所述ENU2小鼠是PAH部位的純合突變體，導(dǎo)致動(dòng)物具有嚴(yán)重的高苯丙氨酸血癥。高血漿Phe水平使得該動(dòng)物成為用于評(píng)估PAL降低血漿Phe的能力的合適模型。在第一項(xiàng)研究中，按各種劑量對(duì)AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S進(jìn)行檢測(cè)。將ENU2小鼠(雄性和雌性)分成5個(gè)劑量組：4個(gè)檢測(cè)組(n＝4)和一個(gè)溶媒組(n＝2)。對(duì)每只小鼠每周給予8次皮下劑量的溶媒、低劑量的聚乙二醇化的半胱氨酸雙突變體AvPAL(0.25IU)、中劑量的聚乙二醇化的半胱氨酸雙突變體AvPAL(1.0IU)、高劑量的聚乙二醇化的半胱氨酸雙突變體AvPAL(4.0IU)或者聚乙二醇化的野生型AvPAL(4.0IU)。給藥前采集血漿以及給藥后48h采集血漿(達(dá)57天)進(jìn)行Phe水平分析。而且，給藥前采集血清以及給藥后48h采集血清(達(dá)57天)用于抗AvPAL抗體水平的分析。從第一次給藥的前2天開(kāi)始，還對(duì)小鼠進(jìn)行每周一次的稱(chēng)重(達(dá)40天)。在該項(xiàng)研究進(jìn)行過(guò)程中，有兩只小鼠死亡，一只溶媒處理的小鼠和一只低劑量的聚乙二醇化的半胱氨酸雙突變體AvPAL處理的小鼠。圖16顯示每次皮下注射聚乙二醇化的半胱氨酸雙突變體AvPAL之后48h時(shí)所觀察到的血漿中Phe水平的劑量依賴(lài)性降低。在劑量相等的情況下，用聚乙二醇化的野生型AvPAL或者聚乙二醇化的半胱氨酸雙突變體AvPAL處理的小鼠之間血漿Phe水平?jīng)]有差異。如圖17中所示，用溶媒、聚乙二醇化的野生型AvPAL或者聚乙二醇化的半胱氨酸雙突變體AvPAL處理的小鼠之間體重也無(wú)顯著差異。觀察到的體重?zé)o顯著差異可能是因?yàn)樵诒卷?xiàng)研究中同時(shí)使用了雄性小鼠和雌性小鼠。利用間接的ELISA測(cè)定分析這些小鼠體內(nèi)的抗AvPAL抗體滴度。在該測(cè)定中，將微量滴定板涂覆AvPAL，封閉，然后暴露于從每只小鼠身上采血得到的適當(dāng)稀釋的血清。確認(rèn)粘附在微量滴定板表面的AvPAL并通過(guò)血清樣本中存在的AvPAL特異性抗體進(jìn)行粘合?？蓹z測(cè)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體檢測(cè)出結(jié)合的抗AvPAL抗體。對(duì)血清樣本進(jìn)行1:50的初始稀釋?zhuān)约皩?duì)比“閾值”(cutpoint)進(jìn)行分析，該閾值來(lái)自稀釋1:50的池存的小鼠血清。信號(hào)低于所述閾值的樣本據(jù)稱(chēng)<50或者是“陰性”的。將認(rèn)為是“陽(yáng)性”的其余樣本通過(guò)在1:3系列滴度中進(jìn)一步稀釋為一種稀釋物，其中信號(hào)降至所述閾值以下。產(chǎn)生陽(yáng)性信號(hào)(即高于所述閾值的信號(hào))的最高稀釋倍數(shù)(highestdilutionfactor)據(jù)稱(chēng)是該樣本的滴度。在該滴度系列執(zhí)行過(guò)程中，滴度的3倍變化可能不會(huì)反映出所檢測(cè)的抗體的顯著差異，因?yàn)椴町惪赡苁情撝邓降男盘?hào)最小變化的結(jié)果。如表6中所示，與用相等劑量(4.0IU)的聚乙二醇化的野生型AvPAL處理的小鼠相比，用聚乙二醇化的半胱氨酸雙突變體AvPAL處理的小鼠體內(nèi)的抗AvPAL抗體滴度要低。雖然未觀察到明顯的劑量應(yīng)答，與用低劑量(0.25IU)的聚乙二醇化的半胱氨酸雙突變體AvPAL處理的小鼠相比，用高劑量(4.0IU)的聚乙二醇化的半胱氨酸雙突變體AvPAL處理的小鼠的抗AvPAL抗體滴度要高。表6：抗AvPALIgG滴度*無(wú)樣本/數(shù)據(jù)不可用與施用了4.0IU聚乙二醇化的野生型AvPAL的小鼠相比，施用了4.0IU的聚乙二醇化的半胱氨酸雙突變體AvPAL的小鼠在該項(xiàng)研究的整個(gè)過(guò)程中保持體內(nèi)降低的抗AvPALIgG滴度。在第二項(xiàng)研究中，以不同的聚乙二醇化比率檢測(cè)AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S。將雄性對(duì)象ENU2小鼠分成5個(gè)劑量組：4個(gè)檢測(cè)組(n＝4)和一個(gè)溶媒組(n＝2)。對(duì)每只小鼠每周給予8次皮下劑量的溶媒、低劑量的聚乙二醇化的半胱氨酸雙突變體AvPAL(4IU和1:1.6AvPAL：PEG比率)、中劑量的聚乙二醇化的半胱氨酸雙突變體AvPAL(4IU和1:2.4AvPAL：PEG比率)、高劑量的聚乙二醇化的半胱氨酸雙突變體AvPAL(4IU和1:3AvPAL：PEG比率)或者聚乙二醇化的野生型AvPAL(4IU和1:3AvPAL：PEG比率)。給藥前采集血漿以及給藥后4天采集血漿(達(dá)61天)進(jìn)行Phe水平分析。而且，給藥前采集血清以及給藥后4天采集血清(達(dá)57天)用于抗AvPAL抗體水平的分析。從第一次給藥的前2天開(kāi)始，還對(duì)小鼠進(jìn)行每周一次的稱(chēng)重(達(dá)40天)。在該項(xiàng)研究進(jìn)行過(guò)程中，有一只溶媒處理的小鼠死亡。圖18顯示每次皮下注射聚乙二醇化的半胱氨酸雙突變體AvPAL之后4天時(shí)所觀察到的血漿中Phe水平的PEG比率依賴(lài)性降低。在PEG比率相等的情況下，用聚乙二醇化的野生型AvPAL或者聚乙二醇化的半胱氨酸雙突變體AvPAL處理的小鼠之間血漿Phe水平?jīng)]有差異。如圖19中所示，與溶媒處理的小鼠相比，用聚乙二醇化的野生型AvPAL或者聚乙二醇化的半胱氨酸雙突變體AvPAL處理的小鼠其體重明顯要高。如上文所述，利用間接的ELISA測(cè)定分析這些小鼠體內(nèi)的抗AvPAL抗體滴度。如表7中所示，與用相等劑量的聚乙二醇化的野生型AvPAL(具有相同的AvPAL：PEG比率(1:3))處理的小鼠相比，用聚乙二醇化的半胱氨酸雙突變體AvPAL處理的小鼠具有較低的抗AvPAL抗體滴度。據(jù)觀察，抗AvPAL抗體滴度AvPAL：PEG的比率之間具有反比劑量應(yīng)答關(guān)系(inversedoseresponse)，這與關(guān)于蛋白質(zhì)(例如AvPAL)聚乙二醇化與活體內(nèi)免疫原性的降低有關(guān)的預(yù)想是相符的。表7：抗AvPALIgG滴度*N/A：沒(méi)有這個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血清樣本上文結(jié)果顯示，聚乙二醇化的半胱氨酸雙突變體AvPALAvPAL_C565SC503S具有的活體內(nèi)PAL酶活性與聚乙二醇化的野生型AvPAL的相當(dāng)。因?yàn)榉蔷垡叶蓟囊吧虯vPAL沒(méi)有檢測(cè)出活體內(nèi)PAL酶活性(見(jiàn)2006年6月12日提交的申請(qǐng)?zhí)枮?1/451,999的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)中的實(shí)施例8)，可以得出這樣的結(jié)論：包含聚乙二醇化的半胱氨酸雙突變體AvPALAvPAL_C565SC503S和聚乙二醇化的野生型AvPAL的AvPAL變異體比野生型AvPAL具有更大的苯丙氨酸轉(zhuǎn)化活性。上文結(jié)果還顯示，聚乙二醇化的AvPAL變異體(由于503和565兩個(gè)位置上均有半胱氨酸到絲氨酸的取代，其活體外蛋白質(zhì)聚集得以減少)與聚乙二醇化的野生型AvPAL相比具有較低的免疫原性。因?yàn)榫垡叶蓟旧砼c免疫原性的降低有關(guān)，可以得出這樣的結(jié)論：AvPAL變異體與野生型AvPAL相比具有較低活體內(nèi)免疫原性。實(shí)施例15食蟹猴和大鼠體內(nèi)的聚乙二醇化形式的AvPAL變異體(半胱氨酸突變體)的毒性/藥物動(dòng)力學(xué)研究為了確定對(duì)食蟹猴以及大鼠施用單劑量的聚乙二醇化形式的AvPAL多肽變異體(例如在位置503和565上具有半胱氨酸殘基的絲氨酸取代)產(chǎn)生的影響，進(jìn)行了毒性/藥物動(dòng)力學(xué)研究。如實(shí)施例7中所述配制聚乙二醇化的AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S。食蟹猴毒性/藥物動(dòng)力學(xué)研究該項(xiàng)研究使用四(4)組猴，每組有三只雄性猴和三只雌性猴。組1接受安慰劑(mL/kg)；以及組2、組3和組4分別接受單次皮下注射4、12和60mg/kg聚乙二醇化的AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S溶液。給藥前，以及給藥后于從3至504h不等的時(shí)間點(diǎn)從這些猴中采集血漿樣本。發(fā)現(xiàn)60mg/kg劑量對(duì)這些猴有毒，因此終止該項(xiàng)研究的組4部分。圖20A顯示單次皮下注射4和12mg/kg之后不同的時(shí)間點(diǎn)血漿中聚乙二醇化的AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S的濃度。數(shù)據(jù)顯示聚乙二醇化的AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S的單相消除。具有一級(jí)吸收的一室模型看起來(lái)描述了單次皮下注射之后聚乙二醇化的AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S的血漿譜。圖20B顯示單次皮下注射4mg/kg之后不同的時(shí)間點(diǎn)血漿中Phe和聚乙二醇化的AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S的濃度。按這個(gè)劑量使血漿Phe濃度在24h之內(nèi)降到GC/MS測(cè)定中的定量限以下，以及血漿Phe的下降持續(xù)超過(guò)10天。大鼠毒性/藥物動(dòng)力學(xué)研究該項(xiàng)研究使用八(8)組大鼠，其中3只雄性和3只雌性在安慰劑組，以及6只雄性和6只雌性在檢測(cè)組。組1和組5接受單次靜脈內(nèi)和皮下注射安慰劑。組2、組3和組4分別接受單次靜脈注射1、5和25mg/kg聚乙二醇化的AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S。組6、組7和組8分別接受單次皮下注射10、25和250mg/kg聚乙二醇化的AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S。大鼠給藥前，以及給藥后在從1到360h不等的時(shí)間點(diǎn)采集血液樣本。在每個(gè)采集時(shí)間點(diǎn)，從每個(gè)組的3只大鼠中采集血液。在該項(xiàng)研究中未在大鼠體內(nèi)觀察到毒性。圖21A顯示單次靜脈注射1、5和25mg/kg之后不同的時(shí)間點(diǎn)血漿中聚乙二醇化的AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S的濃度。數(shù)據(jù)顯示單次靜脈注射之后來(lái)自血漿的聚乙二醇化的AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S的單相消除。圖21B顯示單次皮下注射10、25和250mg/kg之后不同的時(shí)間點(diǎn)血漿中聚乙二醇化的AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S的濃度。具有一級(jí)吸收的一室模型看起來(lái)描述了單次皮下注射之后聚乙二醇化的AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S的血漿譜。表8顯示單次靜脈內(nèi)或者皮下注射之后聚乙二醇化的AvPAL半胱氨酸雙突變體AvPAL_C565SC503S的藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)。表8：?jiǎn)未戊o脈內(nèi)或者皮下給藥之后聚乙二醇化的雙半胱氨酸突變體AvPAL_C565SC503S的藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)*皮下給藥途徑的終末t1/2比靜脈內(nèi)給藥途徑的要長(zhǎng)；這可能是由于來(lái)自皮下組織的吸收率比消除率慢(使得觀察到的t1/2實(shí)際上是吸收期)。#利用25mg/kg時(shí)靜脈內(nèi)AUC數(shù)據(jù)得出的生物度是21.5％。在這項(xiàng)藥物動(dòng)力學(xué)研究中，看起來(lái)沒(méi)有性別差異。對(duì)于靜脈內(nèi)和皮下給藥途徑，AUCinf和Cmax均與劑量大致成比例。大鼠和食蟹猴中的多劑量毒性研究在重復(fù)給藥毒性研究中，評(píng)估大鼠和食蟹猴體內(nèi)聚乙二醇化的AvPAL雙半胱氨酸突變體AvPAL_C565SC503S的安全性。對(duì)大鼠皮下給藥25mg/kg聚乙二醇化的AvPAL雙半胱氨酸突變體AvPAL_C565SC503S，每周兩次，超過(guò)28天，大鼠表現(xiàn)沒(méi)有毒性。對(duì)食蟹猴皮下給藥1mg/kg劑量的聚乙二醇化的AvPAL雙半胱氨酸突變體AvPAL_C565SC503S，每周兩次，超過(guò)28天，食蟹猴表現(xiàn)沒(méi)有顯著毒性。第一次給藥后觀察到血漿Phe水平的劑量依賴(lài)性下降；然而，第七次給藥之后，所有給藥組中血漿Phe水平恢復(fù)到基線，表明可能有針對(duì)施用的酶的抗體反應(yīng)。第28天時(shí)，在大部分1mg/kg處理的動(dòng)物中觀察到最小的抗AvPAL_C565SC503SIgG滴度。第28天時(shí)，在該項(xiàng)研究中的任何動(dòng)物中都沒(méi)觀察到IgM滴度。實(shí)施例16示例性的原核PAL制劑下文的實(shí)施例提供有關(guān)用來(lái)配制如下組合物的參數(shù)的指導(dǎo)：該組合物包括原核PAL或者其生物活性片段、突變體、變異體或類(lèi)似物，其可用于治療以升高的苯丙氨酸水平為特征的疾病和紊亂，例如HPA(包含PKU)以及其他疾病(包含癌癥)。用來(lái)配制原核PAL組合物的參數(shù)包括，但不僅限于，保持pH的緩沖劑、等滲調(diào)節(jié)劑、無(wú)或者有穩(wěn)定劑以及無(wú)或者有其他賦形劑、溶媒、稀釋液以及諸如此類(lèi)。在實(shí)施例11中，聚乙二醇化的AvPAL雙半胱氨酸突變體AvPAL_C565SC503S配制為約12-20mg/mL(約0.2-0.33mM)的濃度。一種原核PAL變異體配制為濃度范圍從約1至50mg/mL(約0.016至0.8mM)，例如從約5至20mg/mL(約0.08至0.33mM)或者從約5至15mg/mL(約0.08至0.25mM)。本文提供的原核PAL組合物的示例性制劑具有約10+/-5mg/mL(約0.16+/-0.08mM)的PAL酶濃度。在實(shí)施例11中，在pH值為7.0、7.5和8.0的10mMTris-HCl、140mMNaCl中配制聚乙二醇化的AvPAL雙半胱氨酸突變體AvPAL_C565SC503S。一種示例性的緩沖劑是濃度范圍從5至50mM(例如從5至20mM或者從5至15mM)的Tris-HCl或者其等價(jià)物。本文提供的原核PAL組合物的示例性制劑具有濃度為約10+/-5mM的Tris-HCl緩沖液。該藥物組合物的一種示例性pH值為約pH6.0-8.5，例如約pH7.0-8.0或者約pH7.0-7.6。本文提供的所述原核PAL組合物的示例性制劑具有為約pH7.3+/-0.3的pH值。一種示例性的等滲調(diào)節(jié)劑是NaCl或者其等價(jià)物，其濃度范圍從約100至200mM，例如從約130至170mM或者從約130至150mM。本文提供的所述原核PAL組合物的一種示例性制劑是濃度為約140+/-10mM的NaCl。如實(shí)施例11中所示，Phe及其某些結(jié)構(gòu)類(lèi)似物(包括，例如，t-CA和苯甲酸)的存在穩(wěn)定了所述聚乙二醇化的AvPAL雙半胱氨酸突變體AvPAL_C565SC503S；Tyr對(duì)PAL酶具有最小的穩(wěn)定效應(yīng)。一種示例性的穩(wěn)定劑是Phe或者其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，該穩(wěn)定劑的范圍從每摩爾原核PAL活性位點(diǎn)約0.1至20mol穩(wěn)定劑，例如每摩爾原核PAL活性位點(diǎn)從約0.5至10mol穩(wěn)定劑或者每摩爾原核PAL活性位點(diǎn)從約1至10mol的穩(wěn)定劑。本文提供的所述原核PAL組合物的示例性制劑具有的穩(wěn)定劑濃度是每摩爾原核PAL活性位點(diǎn)約5+/-4mol的穩(wěn)定劑。在pH<7或者pH>7.6時(shí)，或者存在EDTA、氨基胍或者吐溫80時(shí)，所述聚乙二醇化的AvPAL雙半胱氨酸突變體AvPAL_C565SC503S沒(méi)有顯著地變穩(wěn)定；抗氧化劑抗壞血酸和蛋氨酸使所述PAL酶變得不穩(wěn)定(實(shí)施例11，數(shù)據(jù)未提供)。然而，本文提供的所述組合物可以包括一種或者多種這些成分。原核PAL組合物可以制成液體制劑，但是也可以制備成固體(例如凍干)制劑。在這種情況下，可以添加賦形劑，例如填充劑(例如甘露醇和/或蔗糖)。在實(shí)施例12中，在沒(méi)有甘露醇或者蔗糖；存在25mg/mL甘露醇；或者存在20mg/mL甘露醇加5mg/mL蔗糖的條件下，于pH值為7.5的10mMTris-HCl、140mMNaCl中配制聚乙二醇化的AvPAL雙半胱氨酸突變體AvPAL_C565SC503S并凍干。一種示例性的凍干制劑包括濃度從約1至5％(w/v)或者10至50mg/mL，例如從約2至4％或者從約2至3％的甘露醇。另一種凍干制劑包括甘露醇和蔗糖，其中甘露醇的濃度從約1至5％(w/v)(或者10至50mg/mL)，例如從約1至3％或者從約1.5至2.5％；以及蔗糖的濃度從約0.1至2％(w/v)(或者0.1至2mg/mL)，例如從約0.2％至1％或者從約0.3％至0.7％。還有原核PAL組合物的另一種凍干制劑，其具有甘露醇濃度為約2.5+/-0.5％的甘露醇或者2.0+/-0.5％的甘露醇加0.5+/-0.2％的蔗糖。相應(yīng)地，本文提供的所述原核PAL組合物的示例性制劑如表9所示。表9：原核PAL變異體的示例性制劑*用于凍干的原核PAL制劑實(shí)施例17聚乙二醇化的AvPAL變異體的示例性制劑下文的實(shí)施例提供包括聚乙二醇化的AvPAL變異體(即雙半胱氨酸突變體AvPAL_C565SC503S)的組合物的示例性制劑，所述變異體可用于治療以升高的苯丙氨酸水平為特征的疾病和紊亂，例如HPA(包含PKU)以及其他疾病(包含癌癥)。用來(lái)配制原核PAL組合物的參數(shù)包括，但不僅限于，保持pH的緩沖劑、等滲調(diào)節(jié)劑、無(wú)或者有穩(wěn)定劑以及無(wú)或者有其他賦形劑、溶媒、稀釋液以及諸如此類(lèi)，例如防腐劑或者抗菌劑。理解的是，這些制劑適用于本文所述的其他聚乙二醇化的AvPAL變異體，例如其他AvPAL半胱氨酸突變體。在實(shí)施例13中，該聚乙二醇化的AvPAL雙半胱氨酸突變體AvPAL_C565SC503S配制為約8-20mg/mL(約0.13-0.33mM)的濃度。一種聚乙二醇化的AvPAL變異體配制為濃度范圍從約1至50mg/mL(約0.016至0.8mM)，例如從約5至20mg/mL(約0.08至0.33mM)或者從約5至15mg/mL(約0.08至0.25mM)。本文提供的所述聚乙二醇化的AvPAL變異體組合物的制劑具有約10+/-5mg/mL(約0.16+/-0.08mM)的酶濃度。在實(shí)施例13中，在pH值為7.3的10mMTris-HCl、135mMNaCl中配制聚乙二醇化的AvPAL雙半胱氨酸突變體AvPAL_C565SC503S。用于本文提供的制劑的一種示例性緩沖劑是Tris-HCl或者其等價(jià)物，其濃度范圍從5至50mM，例如從5至20mM或者從5至15mM。本文提供的所述AvPAL變異體組合物的一種制劑具有約10+/-5mM的Tris-HCl緩沖液濃度。所述藥物組合物的示例性pH為約pH6.0-8.0，例如約pH6.5-7.5或者約pH7.0-7.6。本文提供的所述AvPAL變異體組合物的一種制劑具有的pH值為約pH7.3+/-0.3。示例性的等滲調(diào)節(jié)劑是NaCl或者其等價(jià)物，其濃度范圍從約100至200mM，例如從約120至170mM或者從約120至150mM。本文提供的所述AvPAL變異體組合物的一種制劑具有約135+/-15mM的NaCl濃度。如實(shí)施例13中所示，存在防腐劑或抗菌劑(即間甲酚)和兩種穩(wěn)定劑(即Phe和Gly)的組合的情況下，所述聚乙二醇化的AvPAL雙半胱氨酸突變體AvPAL_C565SC503S變得穩(wěn)定。示例性的防腐劑是間甲酚或其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，所述防腐劑的范圍從約0.1％至1％(w/v)，例如從約0.1％至0.5％(w/v)或者從約0.3％至0.5％(w/v)。所述AvPAL變異體組合物的一種制劑具有約0.4％+/-0.1％(w/v)的防腐劑濃度。示例性的穩(wěn)定劑是Phe或者其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物和/或Gly或者其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，其中Phe或者結(jié)構(gòu)類(lèi)似物的范圍從約0.1至10mM，例如從約0.5至5mM或者從約0.5至1.5mM，以及Gly或者結(jié)構(gòu)類(lèi)似物的范圍從約0.1至100mM，例如從約1.0至100mM、從約1.0至20mM或者從約20至100mM。本文提供的所述AvPAL變異體組合物的一種制劑具有約1.0+/-0.5mM的Phe濃度和約50.5+/-49.5mM的Gly濃度。本文提供的所述AvPAL變異體組合物的另一種制劑具有約1.0+/-0.5mM的Phe濃度和約10.5+/-9.5mM的Gly濃度。本文提供的所述AvPAL變異體組合物的另一種制劑具有約1.0+/-0.5mM的Phe濃度和約60+/-40mM的Gly濃度。相應(yīng)地，本文提供的所述聚乙二醇化的AvPAL變異體組合物的一種示例性制劑如表10所示。應(yīng)理解的是，在這種示例性制劑中，防腐劑(即間甲酚)的存在是可選的。表10：聚乙二醇化的AvPAL半胱氨酸突變體的示例性制劑實(shí)施例18具有降低的聚集的AvPAL變異體的生產(chǎn)在基于蛋白質(zhì)的療法的生產(chǎn)和配制中，對(duì)聚集的控制是值得關(guān)注的，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)本身具有免疫原性的時(shí)候更是如此。開(kāi)發(fā)了一種生產(chǎn)方法，其將使得大規(guī)模生產(chǎn)具有最小聚集的聚乙二醇化的AvPAL多肽變異體(例如在位置503和565上具有半胱氨酸殘基的絲氨酸取代)成為可能。如本文所用，“最小聚集”指聚集的(即四聚物形式之前從SE-HPLC洗脫得到的形式)AvPAL變異體：未聚集的(即四聚物形式)AvPAL變異體的比率小于1％，例如小于0.5％、小于0.2％或者小于0.1％。在用于大規(guī)模生產(chǎn)聚乙二醇化的AvPAL多肽變異體的生產(chǎn)方法的進(jìn)行過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)所述酶容易沉淀和聚集。雖然沉淀物可以通過(guò)過(guò)濾去除，但是它們可以容易地再次形成。適當(dāng)?shù)厥褂眠^(guò)濾器和某些非離子去垢劑可以解決沉淀問(wèn)題。確認(rèn)了兩種可溶性聚集體：較大型的100nm聚集體，其通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射測(cè)得以及可以通過(guò)過(guò)濾去除；以及較小型的聚集體，其通過(guò)SE-HPLC測(cè)得以及不可以通過(guò)過(guò)濾去除。在所述生產(chǎn)方法中，采取適當(dāng)?shù)牟襟E以減少或者最小化沉淀物和聚集體的存在量。圖22顯示描述用于大規(guī)模生產(chǎn)AvPAL雙半胱氨酸突變體AvPAL_C565SC503S的示例性生產(chǎn)方法的流程圖。指向左側(cè)的箭頭表示這樣的生產(chǎn)步驟，其中實(shí)現(xiàn)了所述AvPAL雙半胱氨酸突變體AvPAL_C565SC503S的聚集的減少，從上到下包括：(a)酶純化過(guò)程中色譜法步驟的順序；(b)對(duì)純化的酶進(jìn)行冷凍-融化之前添加冷凍保護(hù)劑；(c)各種賦形劑的使用和過(guò)濾步驟；以及(d)對(duì)純化的酶進(jìn)行預(yù)聚乙二醇化處理的過(guò)程中，緩沖條件的選擇和賦形劑的使用。然而，將理解的是，這些生產(chǎn)步驟的任何一步或者多步可以單獨(dú)或者以任何組合的形式使用，以獲得與通過(guò)不含所述生產(chǎn)步驟的一步或者多步的方法制備的AvPAL變異體或者聚乙二醇化的AvPAL相比，具有降低的聚集(例如最小聚集)的AvPAL變異體或者聚乙二醇化的AvPAL變異體。對(duì)用于AvPAL雙半胱氨酸突變體AvPAL_C565SC503S的示例性生產(chǎn)方法中的每個(gè)步驟總結(jié)如下。發(fā)酵.將表達(dá)AvPAL變異體多肽AvPAL_C565SC503S(見(jiàn)實(shí)施例7)的BLR(DE3)/pLysS(Novagen)細(xì)胞的種瓶融化，轉(zhuǎn)移入包含大約500mL培養(yǎng)基的2.8L瓶中，以及37℃攪動(dòng)孵育直至細(xì)胞密度達(dá)到2至4OD600。將所述種瓶轉(zhuǎn)移入第一生物反應(yīng)器(4L發(fā)酵罐)，并進(jìn)行37℃發(fā)酵直至培養(yǎng)物的細(xì)胞密度達(dá)到10至20OD600。將所述第一生物反應(yīng)器(4L發(fā)酵)培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移入第二生物反應(yīng)器(100L發(fā)酵罐)，并進(jìn)行37℃發(fā)酵直至培養(yǎng)物的細(xì)胞密度達(dá)到至少200OD600。將培養(yǎng)肉湯冷卻至15℃，以及通過(guò)利用CEPAZ61離心機(jī)或者WestfaliaCSC-6連續(xù)光盤(pán)堆棧離心機(jī)的離心作用從培養(yǎng)基中分離細(xì)胞。將細(xì)胞團(tuán)(cellpaste)-80℃冷凍。上述過(guò)程可擴(kuò)大到第三生物反應(yīng)器(例如500L甚或更大的生產(chǎn)發(fā)酵罐)的規(guī)模。細(xì)胞裂解.將冷凍過(guò)的細(xì)胞團(tuán)融化并再懸浮于室溫pH值為8.0的20mMTris-HCl、100mMNaCl的緩沖液中，以生成密度為約120至140OD600的細(xì)胞漿料。將細(xì)胞兩次通過(guò)700-800Bar的NiroNS30006均質(zhì)機(jī)(其中溫度控制在30℃以下)以通過(guò)均化作用裂解細(xì)胞。監(jiān)測(cè)裂解物的溫度，以確保均化過(guò)程中溫度保持在50℃以下。加熱步驟.均化作用之后，將細(xì)胞裂解物的溫度調(diào)整為20℃，以及通過(guò)添加1NNaOH將pH值調(diào)整為約8.0。將細(xì)胞裂解物漸漸加熱到65℃，保持65℃30至120min，然后冷卻至15℃。離心和過(guò)濾.通過(guò)利用CEPAZ61離心機(jī)或者WestfaliaCSC-6連續(xù)光盤(pán)堆棧離心機(jī)的離心作用澄清加熱處理過(guò)的細(xì)胞裂解物。保留包含可溶性AvPAL變異體多肽的上清液，以及丟棄不能溶解的沉淀裂解物。來(lái)自Westfalia離心機(jī)的已澄清的加熱處理的裂解物具有污染下游過(guò)濾器的懸浮顆粒。對(duì)多種過(guò)濾器進(jìn)行檢測(cè)之后，確定了適于處理250L已澄清的加熱處理的裂解物的過(guò)濾方案：150LMH流速的已澄清的加熱處理的裂解物連續(xù)通過(guò)(a)1.3m2CunoR55SPZetacarbon深層過(guò)濾器，0.5-1.0μm；(b)7.5m2PallKS50P基于單層纖維素的深層過(guò)濾器，0.4-0.8μm；(c)7.5m2PAllEKMP基于單層纖維素的深層過(guò)濾器，0.2-0.5μm；以及(d)6.6m2PAllEDF雙層PES/PVDF消毒級(jí)別過(guò)濾器，0.2μm。AIEX色譜法和HIC色譜法.如實(shí)施例2中所述，通過(guò)使已澄清的加熱處理的裂解物依次穿過(guò)疏水作用(HIC)柱和陰離子交換(AIEX)柱從中純化得到所述AvPAL變異體多肽AvPAL_C565SC503S，但如下情況除外：當(dāng)AIEX柱樹(shù)脂從MacroPrepHighQ更換為T(mén)oyopearlGigaCapQ650M(TPGQ，TosohBiosciences)時(shí)，則將柱順序顛倒以便先穿過(guò)TPGQAIEX柱，再穿過(guò)Toyopearl丁基650M(TPB，TosohBiosciences)HIC柱。應(yīng)當(dāng)理解的是，可以使用其他AIEX和HIC柱樹(shù)脂，以及所述HIC柱可以替換為體積排阻色譜法。在pH值為7.8的25mMTris-HCl中將已澄清的加熱處理的裂解物稀釋2倍，并裝入在pH值為7.8的25mMTris-HCl中平衡的TPGQAIEX柱。該柱用pH值為7.8的25mMTris-HCl、130mMNaCl清洗，以及利用含于pH值為7.8的25mMTris-HCl中的130至1000mMNaCl的梯度洗脫AvPAL_C565SC503S。將包含AvPAL_C565SC503S的組分池存并利用pH值為6.5的25mMTris-HCl、1.2M(NH4)2SO4稀釋2倍，以及裝入在pH值為6.5的25mMTris-HCl、0.64M(NH4)2SO4中平衡的TPBHIC柱。該柱用pH值為6.5的25mMTris-HCl、0.58M(NH4)2SO4清洗，以及利用含于pH值為6.5的25mMTris-HCl中的0.58至0M(NH4)2SO4的梯度洗脫AvPAL_C565SC503S。將包含AvPAL_C565SC503S的組分池存。在所述生產(chǎn)方法的這個(gè)階段，通過(guò)抗大腸桿菌宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)(ECP)ELISA，通過(guò)SDS-PAGE接著通過(guò)考馬斯染色、銀染色、抗AvPALWesternblot法和抗ECPWesternblot法以及通過(guò)SE-HPLC確定純化的AvPAL_C565SC503S顯示了高水平純度。通過(guò)SE-HPLC確定，顛倒柱順序使得先HIC柱然后AIEX柱導(dǎo)致純化的AvPAL_C565SC503S的聚集減少。在三次運(yùn)行中，該HIC柱之后純化的AvPAL_C565SC503S中測(cè)得0.07％+/-0.03％的聚集體(聚集比未聚集的(即四聚物)酶的百分比率)，而與此比較的是該AIEX柱之后7.58％+/-1.68％。AvPAL塊(冷凍儲(chǔ)存).從該HIC柱洗脫之后，純化的AvPAL_C565SC503S通常冷凍儲(chǔ)存。對(duì)于大規(guī)模生產(chǎn)，純化的AvPAL_C565SC503S塊利用離散溫度步驟在液體氮中冷凍，然后以約-30℃或者以更低的溫度(例如以約-70℃或者約-80℃)儲(chǔ)存。與沒(méi)有控制的冷凍相比，控制的冷凍使得酶聚集減少。在冷凍之前，向純化的AvPAL_C565SC503S塊添加糖或者多元醇(包含5％、10％或者15％甘油；10％蔗糖或者10％山梨醇)使得融化后的聚集減少。應(yīng)當(dāng)理解的是，在冷凍之前向純化的AvPAL_C565SC503S塊添加濃度范圍從5％至20％(對(duì)于液體v/v和對(duì)于粉末w/v)不等的一種或者多種糖或者多元醇，例如，作為舉例但不僅限于，甘油、蔗糖、海藻糖、丙三醇、山梨醇、甘露醇以及諸如此類(lèi)使得融化后的聚集減少。為了確定在冷凍之前純化的AvPAL_C565SC503S塊是否可以濃縮而不會(huì)對(duì)酶的完整性或者比活或者聚集量產(chǎn)生不利的影響，進(jìn)行了小規(guī)模的研究。將含于pH值為6.5的25mMTris-HCl、～0.24M(NH4)2SO4的純化AvPAL_C565SC503S的制劑調(diào)整至10％(v/v)甘油的最終濃度，做成等分試樣裝瓶，在干冰上冷凍并以-80℃儲(chǔ)存。冷凍的AvPAL_C565SC503S塊在30℃水浴中融化，通過(guò)0.2μmPES真空過(guò)濾器過(guò)濾以及通過(guò)利用Hydrosart30kDa分子量截留膜(Sartorius)進(jìn)行超濾而濃縮。AvPAL_C565SC503S通過(guò)超濾濃縮。當(dāng)酶濃縮2倍、4倍、8倍和16倍時(shí)去除等分試樣，導(dǎo)致酶濃度從2.5mg/mL到約35mg/mL。取出用于分析的樣本通過(guò)0.2μmAcrodiskSupor注射器式濾器過(guò)濾，-80℃冷凍，儲(chǔ)存三天以及在30℃水浴中融化。通過(guò)冷凍-融化之后的蛋白質(zhì)回收率、比活回收率、蛋白質(zhì)完整性和聚集水平判斷，AvPAL_C565SC503S塊的濃度沒(méi)有對(duì)酶產(chǎn)生任何有害的影響。AvPAL塊(融化).對(duì)于大規(guī)模生產(chǎn)，純化的AvPAL_C565SC503S冷凍塊以離散可控步驟融化。與沒(méi)有控制的融化相比，控制的融化導(dǎo)致酶聚集減少。超濾/滲濾.實(shí)施了一系列的過(guò)濾步驟，以便在聚乙二醇化之前濃縮得到具有最小聚集的純化的AvPAL_C565SC503S塊。融化的純化的AvPAL_C565SC503S塊通過(guò)玻璃纖維過(guò)濾器，然后通過(guò)尼龍過(guò)濾器過(guò)濾以去除大的聚集體。將過(guò)濾的純化的AvPAL_C565SC503S塊進(jìn)行超濾/滲濾，以將酶濃縮至約75mg/mL。原滲濾緩沖液是pH值為8.5的200mM磷酸鉀(KPi)，但被更換為pH值為8.5的50mM磷酸鉀(KPi)、10mM反式肉桂酸(t-CA)、5％甘油。SE-HPLC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)KPi濃度的降低以及t-CA和甘油的添加導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集減少?？梢允褂闷渌彌_液(例如碳酸鹽和硼酸鹽緩沖液)以及其他磷酸鹽(例如磷酸鈉(NaPi))，只要將緩沖液濃度保持低到可以與后續(xù)的聚乙二醇化過(guò)程相容的濃度。超濾/滲濾之后，純化的AvPAL_C565SC503S塊通過(guò)玻璃纖維過(guò)濾器，然后通過(guò)尼龍過(guò)濾器再過(guò)濾。超濾/滲濾的AvPAL_C565SC503S在pH值為8的200mMKpi、8mMt-CA、4％甘油、0.02％聚山梨醇酯80(PS80)中調(diào)整至約60mg/mL，然后通過(guò)PVDF過(guò)濾器過(guò)濾。發(fā)現(xiàn)PS80的添加阻止蛋白質(zhì)沉淀物的形成。其他非離子去垢劑可用于預(yù)防沉淀，例如聚山梨醇酯20(PS20)、Brij35等等。添加NHS-PEG.除了上文由于酶濃度提高而進(jìn)行濃度調(diào)整之外，基本上如實(shí)施例6中所述將純化的AvPAL_C565SC503S聚乙二醇化。最終的聚乙二醇化反應(yīng)混合物是15mg/mLAvPAL_C565SC503S、13.1mM20kDaNHS-活化的PEG(NOF)、1.5mMt-CA和0.005％PS80。環(huán)境溫度下3h之后，將該反應(yīng)混合物稀釋至酶濃度為約2.3mg/mL，以及通過(guò)添加Tris/NaCl緩沖液淬滅。游離PEG的去除和最終的配制.基本上如實(shí)施例6中所述通過(guò)超濾/滲濾從聚乙二醇化的AvPAL_C565SC503S中去除游離PEG，然后基本上如實(shí)施例11和13中所述進(jìn)行配制。聚乙二醇化的AvPAL_C565SC503S配制的大體積制劑(PEG-PALFBDS)(冷凍儲(chǔ)存).將配制的聚乙二醇化的AvPAL_C565SC503S-70℃冷凍儲(chǔ)存。最終配制的藥物產(chǎn)品其酶濃度為10mg/mL，具有最小聚集。實(shí)施例19對(duì)原核PAL組合物的臨床評(píng)估下文的實(shí)施例提供有關(guān)用來(lái)對(duì)本文提供的治療方法中的如下組合物進(jìn)行臨床評(píng)估的參數(shù)的指導(dǎo)：該組合物包括原核PAL或其生物活性變異體、突變體和片段(“原核PAL”)。如其他部分所討論的，原核PAL可以用于治療HPA、輕度PKU和典型PKU。將進(jìn)行臨床試驗(yàn)，這將提供對(duì)原核PAL的口服或者皮下劑量在如下方面的評(píng)估：安全性；藥物動(dòng)力學(xué)；以及替代和限定的臨床終點(diǎn)的初始應(yīng)答。試驗(yàn)將進(jìn)行最少，但不一定限于，24周，以采集針對(duì)100名可評(píng)估患者的足夠的安全性信息。用于試驗(yàn)的初始劑量將從約0.001至約1.0mg/kg/周不等。倘若這種劑量沒(méi)有導(dǎo)致患者體內(nèi)過(guò)量的血漿Phe水平降低或者沒(méi)有產(chǎn)生顯著直接的臨床益處(測(cè)量為增加每日口服Phe攝入量而不會(huì)提高血漿Phe水平的能力)，必要時(shí)可以增加劑量以及可以保持另外的最小時(shí)間段(但一定限于24周)以證實(shí)安全性并進(jìn)一步評(píng)估療效。安全性測(cè)量將包括不良事件、過(guò)敏反應(yīng)、完整的臨床化學(xué)檢查(腎和肝功能檢查)、驗(yàn)?zāi)蚝腿?xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)。此外，還將監(jiān)測(cè)其他包含血液Phe水平的降幅、神經(jīng)心理學(xué)和認(rèn)知檢測(cè)以及全面性評(píng)估的參數(shù)。本實(shí)施例還涉及確定循環(huán)中藥品的藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)以及血液中原核PAL的總體分布和半衰期。據(jù)預(yù)計(jì)，這些測(cè)量將有助于將劑量與臨床應(yīng)答聯(lián)系起來(lái)。方法血漿Phe水平升高的患者將進(jìn)行如下檢查：基本病史和體檢、神經(jīng)心理學(xué)和認(rèn)知檢測(cè)、一套標(biāo)準(zhǔn)的臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)(全血細(xì)胞計(jì)數(shù)、Panel20、CH50、UA)、尿喋呤水平、二氫蝶啶還原酶(DHPR)水平以及血清氨基酸空腹血液(血漿)檢查?；颊邔⒚恐艿皆\所，得以實(shí)現(xiàn)對(duì)病情的緊密追蹤。完成治療期之后一周，患者將再到診所接受整體評(píng)估。若需要逐步加大劑量，患者仍將遵循與上文所列相同的安排。整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中，將進(jìn)行安全性監(jiān)測(cè)。診斷和納入/排除標(biāo)準(zhǔn)患者可以是女性或者男性，持有通過(guò)基因檢測(cè)確定患有HPA或者輕度PKU的診斷記錄以及有關(guān)血液中Phe水平升高的證據(jù)。該項(xiàng)研究將包括沒(méi)有嚴(yán)格遵循飲食控制的HPA或者PKU患者。只是，有生育能力的女性患者在每次給藥之前必須進(jìn)行妊娠檢測(cè)證明未孕(尿β-hCG)以及必須接受建議在這項(xiàng)研究進(jìn)行的整個(gè)期間采取醫(yī)學(xué)上可接受的避孕方法。有如下情況的患者將不被納入該項(xiàng)研究中：患者處于妊娠期或者哺乳期；在該項(xiàng)研究招募之前30天之內(nèi)服用過(guò)試驗(yàn)藥；或者患有醫(yī)學(xué)疾病、嚴(yán)重的并發(fā)疾病或具有其他可以顯著地降低研究依從性從而使效果減輕的情況。飲食干預(yù)最初進(jìn)行隨機(jī)化和兩周的治療期后，所有的研究參與者將接受飲食建議并將遵循標(biāo)準(zhǔn)的飲食和/或補(bǔ)充有Phe特異性醫(yī)療食品的標(biāo)準(zhǔn)的Phe受限飲食，時(shí)間總共四至六周。飲食管控將居家進(jìn)行以及飲食攝入情況將記錄在日志中。將在治療組之間進(jìn)行關(guān)于營(yíng)養(yǎng)素和醫(yī)療食品的攝入量的分析以及推薦飲食攝入量(RDI)的百分?jǐn)?shù)的比較。原核PAL安全性如果該項(xiàng)研究進(jìn)行的過(guò)程中沒(méi)有發(fā)生顯著的急性或者慢性藥物反應(yīng)，則確定原核PAL療法具有安全性。如果在臨床檢查、臨床實(shí)驗(yàn)室或其他適當(dāng)?shù)难芯恐袥](méi)有觀察到顯著的異常情況，則確定所述藥物更長(zhǎng)時(shí)間的給藥具有安全性。實(shí)施例20對(duì)聚乙二醇化的AvPAL變異體的臨床評(píng)估所述聚乙二醇化的雙半胱氨酸突變體AvPALAvPAL_C565SC503S將以人類(lèi)為對(duì)象進(jìn)行臨床評(píng)估。該臨床評(píng)估的目的是為了確定PKU患者的安全性、耐受性、藥物動(dòng)力學(xué)(PK)和療效。血液Phe水平將用作臨床終點(diǎn)。階段1階段1是以16到50歲年齡之間的35名PKU患者為對(duì)象進(jìn)行的公開(kāi)標(biāo)記單劑量遞增研究。主要目標(biāo)是評(píng)估聚乙二醇化的雙半胱氨酸突變體AvPALAvPAL_C565SC503S的安全性和耐受性以及次要目標(biāo)是評(píng)估聚乙二醇化的酶的PK和Phe降低效果。每組5名對(duì)象，共7組，按遞增劑量0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3和1mg/kg序貫給藥聚乙二醇化的AvPAL_C565SC503S。每組中的對(duì)象接受單劑量，然后追蹤總共6周。納入標(biāo)準(zhǔn)是篩選時(shí)的血液Phe水平和過(guò)去3年的平均血液Phe水平≥600μM。階段2階段2的研究被分為沒(méi)有中斷的兩個(gè)部分:第1部分–16周–8周給藥，然后是劑量?jī)?yōu)化第2部分–40周–延長(zhǎng)階段2是以35名PKU患者為對(duì)象進(jìn)行的由兩部分組成的公開(kāi)標(biāo)記劑量?jī)?yōu)化研究。進(jìn)行時(shí)間段超過(guò)16周的第1部分涉及聚乙二醇化的AvPAL_C565SC503S每周給藥一次，達(dá)8周，然后是劑量?jī)?yōu)化期。對(duì)每個(gè)對(duì)象的劑量進(jìn)行調(diào)整，以達(dá)到低于600μM的血液Phe濃度。主要目標(biāo)是評(píng)估聚乙二醇化的AvPAL_C565SC503S多次給藥的安全性和耐受性，以及次要目標(biāo)是評(píng)估聚乙二醇化的酶對(duì)血液Phe濃度、免疫應(yīng)答(例如抗AvPAL抗體滴度)以及穩(wěn)態(tài)PK的影響。在第2部分中，以個(gè)性化的優(yōu)化劑量和給藥頻率對(duì)所述對(duì)象施用聚乙二醇化的AvPAL_C565SC503S達(dá)40周。階段3一旦階段1和階段2的研究完成，進(jìn)一步的研究可能包括針對(duì)更多對(duì)象的階段3六個(gè)月雙盲研究，以及針對(duì)特殊群體(例如，作為舉例但不僅限于，非PKUHPA患者、對(duì)BH4做出響應(yīng)的PKU患者和不對(duì)BH4做出響應(yīng)的PHU患者)的進(jìn)一步研究。序列表本說(shuō)明書(shū)與序列表的計(jì)算機(jī)可讀形式(CRF)的拷貝件一起提交。命名為11808-101_SEQLIST.txt，創(chuàng)建時(shí)間是2010年1月29日以及大小為53,623字節(jié)的CRF與紙件的序列表相同以及以引用方式整體并入本文。*****上文說(shuō)明性的例子中陳述的本發(fā)明的許多修改和變化是那些本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以預(yù)料到的。因此，應(yīng)當(dāng)只用所附的權(quán)利要求中限定的范圍來(lái)限定本發(fā)明。序列表<110>生物馬林藥物股份有限公司<120>原核苯丙氨酸解氨酶變異體的組合物以及利用其組合物的方法<130>11808-101-888<160>33<170>PatentInversion3.4<210>1<211>1710<212>DNA<213>點(diǎn)形念珠藻<400>1atgaatataacatctctacaacagaacataacgcgttcttggcaaatacctttcactaat60agttcagattcaatcgtaactgtaggcgatcgcaatctgacaatcgacgaggttgtaaat120gttgctcgtcatggaacacaggtgcgcttaactgataatgcagatgtcattcggggtgtt180caagcatcttgtgattacattaacaatgcagtcgaaacagcacagccaatttacggggtg240acatctggctttggcggtatggcagatgttgtcatctctcgcgaacaagcagcggaactt300cagactaatttaatttggtttctgaaatccggcgcaggaaacaaattatcgttagcagac360gtgcgtgcagctatgctcttacgtgcaaattcacatttgtatggtgcgtctggtatacga420ctcgaacttattcagcggattgaaactttcctcaacgctggcgtgacaccccatgtctat480gagtttggctctatcggtgctagcggcgatttggtgccattatcctacattactggggca540ctaatcggtctagatcctagctttacagttgacttcgacggtaaagaaatggatgccgtt600acagccttgtctcgtttgggtttgccaaagttgcaattgcaaccgaaagaaggtttagca660atgatgaatggcacctcagtcatgacaggtattgcagctaactgtgtgtacgatgcgaaa720gttttgctcgctctgacaatgggtgtacacgccttagccatccaaggtttatacggaacg780aatcaatctttccacccgtttattcatcagtgcaagccacatcccggtcaactatggaca840gcagatcaaatgttttctctgctgaaagattcatctttagttcgtgaagagttggatggt900aaacacgaataccgtggtaaagatctgatacaggatcgttattctctccgctgtctggca960cagttcatagggccaatcgttgatggggtatcagagattaccaagcaaatcgaggtagaa1020atgaactcagtcaccgataacccattgattgatgtcgagaaccaagttagttatcacggc1080ggcaattttctcggacagtatgtgggtgtgacaatggatcgcctacgttattacataggg1140ctattggccaaacacatcgatgtgcagattgcacttcttgtctcgccagagtttagcaac1200ggcttaccaccctctttagttggtaatagcgatcgcaaagttaatatgggactcaaaggt1260ttgcaaatcagtggaaactcgattatgccactgttgagcttctatggaaattccctagcc1320gatcgctttcctacccacgccgagcaatttaatcaaaatattaacagccaaggctatatt1380tccgcaaatttgacacgtcgttccgtagacatatttcagaattatatggcgatcgcgttg1440atgtttggagttcaagctgttgacctccgcacatataagatgaaaggtcattatgatgca1500cgtacatgcctctcacccaatactgtgcagttatacacagcagtctgcgaggtagttgga1560aagccactaacgtctgtgcgtccatacatttggaacgacaacgagcaatgtttagatgag1620catattgcccggatttcagctgatatcgctggtggtggtttaattgtgcaagcagttgag1680catattttttcgagcttaaagtcaacgtaa1710<210>2<211>569<212>PRT<213>點(diǎn)形念珠藻<400>2MetAsnIleThrSerLeuGlnGlnAsnIleThrArgSerTrpGlnIle151015ProPheThrAsnSerSerAspSerIleValThrValGlyAspArgAsn202530LeuThrIleAspGluValValAsnValAlaArgHisGlyThrGlnVal354045ArgLeuThrAspAsnAlaAspValIleArgGlyValGlnAlaSerCys505560AspTyrIleAsnAsnAlaValGluThrAlaGlnProIleTyrGlyVal65707580ThrSerGlyPheGlyGlyMetAlaAspValValIleSerArgGluGln859095AlaAlaGluLeuGlnThrAsnLeuIleTrpPheLeuLysSerGlyAla100105110GlyAsnLysLeuSerLeuAlaAspValArgAlaAlaMetLeuLeuArg115120125AlaAsnSerHisLeuTyrGlyAlaSerGlyIleArgLeuGluLeuIle130135140GlnArgIleGluThrPheLeuAsnAlaGlyValThrProHisValTyr145150155160GluPheGlySerIleGlyAlaSerGlyAspLeuValProLeuSerTyr165170175IleThrGlyAlaLeuIleGlyLeuAspProSerPheThrValAspPhe180185190AspGlyLysGluMetAspAlaValThrAlaLeuSerArgLeuGlyLeu195200205ProLysLeuGlnLeuGlnProLysGluGlyLeuAlaMetMetAsnGly210215220ThrSerValMetThrGlyIleAlaAlaAsnCysValTyrAspAlaLys225230235240ValLeuLeuAlaLeuThrMetGlyValHisAlaLeuAlaIleGlnGly245250255LeuTyrGlyThrAsnGlnSerPheHisProPheIleHisGlnCysLys260265270ProHisProGlyGlnLeuTrpThrAlaAspGlnMetPheSerLeuLeu275280285LysAspSerSerLeuValArgGluGluLeuAspGlyLysHisGluTyr290295300ArgGlyLysAspLeuIleGlnAspArgTyrSerLeuArgCysLeuAla305310315320GlnPheIleGlyProIleValAspGlyValSerGluIleThrLysGln325330335IleGluValGluMetAsnSerValThrAspAsnProLeuIleAspVal340345350GluAsnGlnValSerTyrHisGlyGlyAsnPheLeuGlyGlnTyrVal355360365GlyValThrMetAspArgLeuArgTyrTyrIleGlyLeuLeuAlaLys370375380HisIleAspValGlnIleAlaLeuLeuValSerProGluPheSerAsn385390395400GlyLeuProProSerLeuValGlyAsnSerAspArgLysValAsnMet405410415GlyLeuLysGlyLeuGlnIleSerGlyAsnSerIleMetProLeuLeu420425430SerPheTyrGlyAsnSerLeuAlaAspArgPheProThrHisAlaGlu435440445GlnPheAsnGlnAsnIleAsnSerGlnGlyTyrIleSerAlaAsnLeu450455460ThrArgArgSerValAspIlePheGlnAsnTyrMetAlaIleAlaLeu465470475480MetPheGlyValGlnAlaValAspLeuArgThrTyrLysMetLysGly485490495HisTyrAspAlaArgThrCysLeuSerProAsnThrValGlnLeuTyr500505510ThrAlaValCysGluValValGlyLysProLeuThrSerValArgPro515520525TyrIleTrpAsnAspAsnGluGlnCysLeuAspGluHisIleAlaArg530535540IleSerAlaAspIleAlaGlyGlyGlyLeuIleValGlnAlaValGlu545550555560HisIlePheSerSerLeuLysSerThr565<210>3<211>1704<212>DNA<213>多變魚(yú)腥藻<400>3atgaagacactatctcaagcacaaagcaaaacctcatctcaacaattttcttttactgga60aattcttctgccaatgtaattattggtaatcagaaactcacaatcaatgatgttgcaagg120gtagcgcgtaatggcaccttagtgtctttaaccaataacactgatattttgcagggtatt180caggcatcttgtgattacattaataatgctgttgaatctggggaaccaatttatggagtg240acatctggttttggcggtatggccaatgttgccatatcccgtgaacaagcatctgaactc300caaaccaacttagtttggttcctgaaaacaggtgcagggaacaaattacccttggcggat360gtgcgcgcagctatgctcttgcgtgcaaactctcatatgcgcggtgcatctggcatcaga420ttagaacttatcaagcgtatggagattttccttaacgctggtgtcacaccatatgtgtat480gagtttggttcaattggtgcaagtggtgatttagtgccactatcctacattactggttca540ctgataggcttagatcccagttttaaggttgacttcaacggtaaagaaatggatgcgcca600acagctctacgtcaactgaatttgtcacccttgacattgttgccgaaggaaggcttggcg660atgatgaacggcacttcagtcatgacaggtattgcagcaaactgcgtctacgatactcaa720attttaactgcgatcgctatgggcgttcacgctctagatatccaagctttaaacggaacc780aatcaatcattccatccatttatccataattccaaaccacatcctggtcaattatgggca840gcagatcagatgatttctttgttagccaattcccagttagttcgtgatgagttagatggt900aaacacgattatcgtgatcacgagttgattcaagatcgttactcactccgatgccttccc960cagtatttggggccaatcgttgatggaatttcccagattgccaaacaaattgaaatcgaa1020atcaactcagtcaccgataacccactaattgatgttgataaccaagctagctatcatgga1080ggaaatttcctcggacagtacgtgggtatgggaatggatcacctgcgttactatattggg1140ttattggctaaacacctagatgtgcagattgccctcctcgcctcaccagagtttagcaat1200ggactaccaccatctttattaggcaaccgagaacgtaaagtcaatatgggactcaaaggt1260ctgcaaatatgcggtaactcaattatgccactgttgaccttctatggaaattccatcgcc1320gatcgctttcctacccatgcagaacaatttaatcagaacatcaacagtcaaggatacact1380tcagcgactctagcccgccgttctgtggatatcttccagaattatgtggcgatcgctctg1440atgtttggagtccaagctgttgacctccgcacatataaaaagactggtcattacgatgca1500cgcgcctgtctatcacctgcaactgagcgcttatattcagcagtccgccacgtagttgga1560caaaaaccaacttcagatcgcccatatatttggaatgataatgagcaaggactggatgag1620catattgcccggatttctgctgatatcgctgctggtggtgtgattgtgcaagcagttcaa1680gatatcttaccctgcttgcattaa1704<210>4<211>567<212>PRT<213>多變魚(yú)腥藻<400>4MetLysThrLeuSerGlnAlaGlnSerLysThrSerSerGlnGlnPhe151015SerPheThrGlyAsnSerSerAlaAsnValIleIleGlyAsnGlnLys202530LeuThrIleAsnAspValAlaArgValAlaArgAsnGlyThrLeuVal354045SerLeuThrAsnAsnThrAspIleLeuGlnGlyIleGlnAlaSerCys505560AspTyrIleAsnAsnAlaValGluSerGlyGluProIleTyrGlyVal65707580ThrSerGlyPheGlyGlyMetAlaAsnValAlaIleSerArgGluGln859095AlaSerGluLeuGlnThrAsnLeuValTrpPheLeuLysThrGlyAla100105110GlyAsnLysLeuProLeuAlaAspValArgAlaAlaMetLeuLeuArg115120125AlaAsnSerHisMetArgGlyAlaSerGlyIleArgLeuGluLeuIle130135140LysArgMetGluIlePheLeuAsnAlaGlyValThrProTyrValTyr145150155160GluPheGlySerIleGlyAlaSerGlyAspLeuValProLeuSerTyr165170175IleThrGlySerLeuIleGlyLeuAspProSerPheLysValAspPhe180185190AsnGlyLysGluMetAspAlaProThrAlaLeuArgGlnLeuAsnLeu195200205SerProLeuThrLeuLeuProLysGluGlyLeuAlaMetMetAsnGly210215220ThrSerValMetThrGlyIleAlaAlaAsnCysValTyrAspThrGln225230235240IleLeuThrAlaIleAlaMetGlyValHisAlaLeuAspIleGlnAla245250255LeuAsnGlyThrAsnGlnSerPheHisProPheIleHisAsnSerLys260265270ProHisProGlyGlnLeuTrpAlaAlaAspGlnMetIleSerLeuLeu275280285AlaAsnSerGlnLeuValArgAspGluLeuAspGlyLysHisAspTyr290295300ArgAspHisGluLeuIleGlnAspArgTyrSerLeuArgCysLeuPro305310315320GlnTyrLeuGlyProIleValAspGlyIleSerGlnIleAlaLysGln325330335IleGluIleGluIleAsnSerValThrAspAsnProLeuIleAspVal340345350AspAsnGlnAlaSerTyrHisGlyGlyAsnPheLeuGlyGlnTyrVal355360365GlyMetGlyMetAspHisLeuArgTyrTyrIleGlyLeuLeuAlaLys370375380HisLeuAspValGlnIleAlaLeuLeuAlaSerProGluPheSerAsn385390395400GlyLeuProProSerLeuLeuGlyAsnArgGluArgLysValAsnMet405410415GlyLeuLysGlyLeuGlnIleCysGlyAsnSerIleMetProLeuLeu420425430ThrPheTyrGlyAsnSerIleAlaAspArgPheProThrHisAlaGlu435440445GlnPheAsnGlnAsnIleAsnSerGlnGlyTyrThrSerAlaThrLeu450455460AlaArgArgSerValAspIlePheGlnAsnTyrValAlaIleAlaLeu465470475480MetPheGlyValGlnAlaValAspLeuArgThrTyrLysLysThrGly485490495HisTyrAspAlaArgAlaCysLeuSerProAlaThrGluArgLeuTyr500505510SerAlaValArgHisValValGlyGlnLysProThrSerAspArgPro515520525TyrIleTrpAsnAspAsnGluGlnGlyLeuAspGluHisIleAlaArg530535540IleSerAlaAspIleAlaAlaGlyGlyValIleValGlnAlaValGln545550555560AspIleLeuProCysLeuHis565<210>5<211>523<212>PRT<213>海洋鏈霉菌<400>5MetThrPheValIleGluLeuAspMetAsnValThrLeuAspGlnLeu151015GluAspAlaAlaArgGlnArgThrProValGluLeuSerAlaProVal202530ArgSerArgValArgAlaSerArgAspValLeuValLysPheValGln354045AspGluArgValIleTyrGlyValAsnThrSerMetGlyGlyPheVal505560AspHisLeuValProValSerGlnAlaArgGlnLeuGlnGluAsnLeu65707580IleAsnAlaValAlaThrAsnValGlyAlaTyrLeuAspAspThrThr859095AlaArgThrIleMetLeuSerArgIleValSerLeuAlaArgGlyAsn100105110SerAlaIleThrProAlaAsnLeuAspLysLeuValAlaValLeuAsn115120125AlaGlyIleValProCysIleProGluLysGlySerLeuGlyThrSer130135140GlyAspLeuGlyProLeuAlaAlaIleAlaLeuValCysAlaGlyGln145150155160TrpLysAlaArgTyrAsnGlyGlnIleMetProGlyArgGlnAlaLeu165170175SerGluAlaGlyValGluProMetGluLeuSerTyrLysAspGlyLeu180185190AlaLeuIleAsnGlyThrSerGlyMetValGlyLeuGlyThrMetVal195200205LeuGlnAlaAlaArgArgLeuValAspArgTyrLeuGlnValSerAla210215220LeuSerValGluGlyLeuAlaGlyMetThrLysProPheAspProArg225230235240ValHisGlyValLysProHisArgGlyGlnArgGlnValAlaSerArg245250255LeuTrpGluGlyLeuAlaAspSerHisLeuAlaValAsnGluLeuAsp260265270ThrGluGlnThrLeuAlaGlyGluMetGlyThrValAlaLysAlaGly275280285SerLeuAlaIleGluAspAlaTyrSerIleArgCysThrProGlnIle290295300LeuGlyProValValAspValLeuAspArgIleGlyAlaThrLeuGln305310315320AspGluLeuAsnSerSerAsnAspAsnProIleValLeuProGluGlu325330335AlaGluValPheHisAsnGlyHisPheHisGlyGlnTyrValAlaMet340345350AlaMetAspHisLeuAsnMetAlaLeuAlaThrValThrAsnLeuAla355360365AsnArgArgValAspArgPheLeuAspLysSerAsnSerAsnGlyLeu370375380ProAlaPheLeuCysArgGluAspProGlyLeuArgLeuGlyLeuMet385390395400GlyGlyGlnPheMetThrAlaSerIleThrAlaGluThrArgThrLeu405410415ThrIleProMetSerValGlnSerLeuThrSerThrAlaAspPheGln420425430AspIleValSerPheGlyPheValAlaAlaArgArgAlaArgGluVal435440445LeuThrAsnAlaAlaTyrValValAlaPheGluLeuLeuCysAlaCys450455460GlnAlaValAspIleArgGlyAlaAspLysLeuSerSerPheThrArg465470475480ProLeuTyrGluArgThrArgLysIleValProPhePheAspArgAsp485490495GluThrIleThrAspTyrValGluLysLeuAlaAlaAspLeuIleAla500505510GlyGluProValAspAlaAlaValAlaAlaHis515520<210>6<211>510<212>PRT<213>惡臭假單胞菌<400>6MetThrGluLeuThrLeuLysProGlyThrLeuThrLeuAlaGlnLeu151015ArgAlaIleHisAlaAlaProValArgLeuGlnLeuAspAlaSerAla202530AlaProAlaIleAspAlaSerValAlaCysValGluGlnIleIleAla354045GluAspArgThrAlaTyrGlyIleAsnThrGlyPheGlyLeuLeuAla505560SerThrArgIleAlaSerHisAspLeuGluAsnLeuGlnArgSerLeu65707580ValLeuSerHisAlaAlaGlyIleGlyAlaProLeuAspAspAspLeu859095ValArgLeuIleMetValLeuLysIleAsnSerLeuSerArgGlyPhe100105110SerGlyIleArgArgLysValIleAspAlaLeuIleAlaLeuValAsn115120125AlaGluValTyrProHisIleProLeuLysGlySerValGlyAlaSer130135140GlyAspLeuAlaProLeuAlaThrMetSerLeuValLeuLeuGlyGlu145150155160GlyLysAlaArgTyrLysGlyGlnTrpLeuSerAlaThrGluAlaLeu165170175AlaValAlaGlyLeuGluProLeuThrLeuAlaAlaLysGluGlyLeu180185190AlaLeuLeuAsnGlyThrGlnAlaSerThrAlaTyrAlaLeuArgGly195200205LeuPheTyrAlaGluAspLeuTyrAlaAlaAlaIleAlaCysGlyGly210215220LeuSerValGluAlaValLeuGlySerArgSerProPheAs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GlyValThrProTyrValTyr145150155160GluPheGlySerIleGlyAlaSerGlyAspLeuValProLeuSerTyr165170175IleThrGlySerLeuIleGlyLeuAspProSerPheLysValAspPhe180185190AsnGlyLysGluMetAspAlaProThrAlaLeuArgGlnLeuAsnLeu195200205SerProLeuThrLeuLeuProLysGluGlyLeuAlaMetMetAsnGly210215220ThrSerValMetThrGlyIleAlaAlaAsnCysValTyrAspThrGln225230235240IleLeuThrAlaIleAlaMetGlyValHisAlaLeuAspIleGlnAla245250255LeuAsnGlyThrAsnGlnSerPheHisProPheIleHisAsnSerLys260265270ProHisProGlyGlnLeuTrpAlaAlaAspGlnMetIleSerLeuLeu275280285AlaAsnSerGlnLeuValArgAspGluLeuAspGlyLysHisAspTyr290295300ArgAspHisGluLeuIleGlnAspArgTyrSerLeuArgCysLeuPro305310315320GlnTyrLeuGlyProIleValAspGlyIleSerGlnIleAlaLysGln325330335IleGluIleGluIleAsnSerValThrAspAsnProLeuIleAspVal340345350AspAsnGlnAlaSerTyrHisGlyGlyAsnPheLeuGlyGlnTyrVal355360365GlyMetGlyMetAspHisLeuArgTyrTyrIleGlyLeuLeuAlaLys370375380HisLeuAspValGlnIleAlaLeuLeuAlaSerProGluPheSerAsn385390395400GlyLeuProProSerLeuLeuGlyAsnArgGluArgLysValAsnMet405410415GlyLeuLysGlyLeuGlnIleCysGlyAsnSerIleMetProLeuLeu420425430ThrPheTyrGlyAsnSerIleAlaAspArgPheProThrHisAlaGlu435440445GlnPheAsnGlnAsnIleAsnSerGlnGlyTyrThrSerAlaThrLeu450455460AlaArgArgSerValAspIlePheGlnAsnTyrValAlaIleAlaLeu465470475480MetPheGlyValGlnAlaValAspLeuArgThrTyrLysLysThrGly485490495HisTyrAspAlaArgAlaSerLeuSerProAlaThrGluArgLeuTyr500505510SerAlaValArgHisValValGlyGlnLysProThrSerAspArgPro515520525TyrIleTrpAsnAspAsnGluGlnGlyLeuAspGluHisIleAlaArg530535540IleSerAlaAspIleAlaAlaGlyGlyValIleValGlnAlaValGln545550555560AspIleLeuProSerLeuHis565<210>12<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>點(diǎn)形念珠藻PAL引物1(正向)<400>12cactgtcatatgaatataacatctctacaacagaacat38<210>13<211>45<212>DNA<213>人工序列<220><223>點(diǎn)形念珠藻PAL引物2(反向)<400>13gacagtggcggccgctcacgttgactttaagctcgaaaaaatatg45<210>14<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>多變魚(yú)腥藻PAL引物1(正向,N-末端片段)<400>14cactgtgctagcatgaagacactatctcaagcacaaag38<210>15<211>49<212>DNA<213>人工序列<220><223>多變魚(yú)腥藻PAL引物2(反向,N-末端片段)<400>15ggaaatttcctccatgatagctggcttggttatcaacatcaattagtgg49<210>16<211>49<212>DNA<213>人工序列<220><223>多變魚(yú)腥藻PAL引物3(正向,C-末端片段)<400>16ccactaattgatgttgataaccaagccagctatcatggaggaaatttcc49<210>17<211>41<212>DNA<213>人工序列<220><223>多變魚(yú)腥藻PAL引物4(反向,C-末端片段)<400>17cactgtgcggccgcttaatgcaagcagggtaagatatcttg41<210>18<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>多變魚(yú)腥藻PAL正向引物<400>18cactgtcatatgaagacactatctcaagcacaaag35<210>19<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>多變魚(yú)腥藻PAL反向引物<400>19cactgtctcgagatgcaagcagggtaagatatcttg36<210>20<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>多變魚(yú)腥藻PAL引物以添加5'NheI位點(diǎn)并去除內(nèi)部NheI位點(diǎn)(正向,N-末端)<400>20cactgtgctagcatgaagacactatctcaagcacaaag38<210>21<211>49<212>DNA<213>人工序列<220><223>多變魚(yú)腥藻PAL引物以添加5'NheI位點(diǎn)并去除內(nèi)部NheI位點(diǎn)(反向,N-末端)<400>21ggaaatttcctccatgatagctggcttggttatcaacatcaattagtgg49<210>22<211>49<212>DNA<213>人工序列<220><223>多變魚(yú)腥藻PAL引物以添加5'NheI位點(diǎn)并去除內(nèi)部NheI位點(diǎn)(正向,C-末端片段)<400>22ccactaattgatgttgataaccaagccagctatcatggaggaaatttcc49<210>23<211>41<212>DNA<213>人工序列<220><223>多變魚(yú)腥藻PAL引物以添加5'NheI位點(diǎn)并去除內(nèi)部NheI位點(diǎn)(反向,C-末端片段)<400>23acagtggcggccgcttaatgcaagcagggtaagatatcttg41<210>24<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>多變魚(yú)腥藻PAL引物以添加5'NheI位點(diǎn)和3'SmaI位點(diǎn)(正向)<400>24cactgtgaattcatgaagacactatctcaagcacaaag38<210>25<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>多變魚(yú)腥藻PAL引物以添加5'NheI位點(diǎn)和3'SmaI位點(diǎn)(反向)<400>25cactgtcccgggttaatgcaagcagggtaagatatct37<210>26<211>41<212>DNA<213>人工序列<220><223>多變魚(yú)腥藻PAL引物在位置503上形成半胱氨酸至絲氨酸的取代(正向)<400>26gtcattacgatgcacgcgcctctctatcacctgcaactgag41<210>27<211>41<212>DNA<213>人工序列<220><223>多變魚(yú)腥藻PAL引物在位置503上形成半胱氨酸至絲氨酸的取代(反向)<400>27ctcagttgcaggtgatagagaggcgcgtgcatcgtaatgac41<210>28<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>多變魚(yú)腥藻PAL引物在位置565上形成半胱氨酸至絲氨酸的取代(正向)<400>28cagttcaagatatcttaccctccttgcattaacccgggctgc42<210>29<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>多變魚(yú)腥藻PAL引物在位置565上形成半胱氨酸至絲氨酸的取代(反向)<400>29gcagcccgggttaatgcaaggagggtaagatatcttgaactg42<210>30<211>44<212>DNA<213>人工序列<220><223>多變魚(yú)腥藻PAL引物在位置64上形成半胱氨酸至絲氨酸的取代(正向)<400>30gcagggtattcaggcatcttctgattacattaataatgctgttg44<210>31<211>44<212>DNA<213>人工序列<220><223>多變魚(yú)腥藻PAL引物在位置64上形成半胱氨酸至絲氨酸的取代(反向)<400>31caacagcattattaatgtaatcagaagatgcctgaataccctgc44<210>32<211>43<212>DNA<213>人工序列<220><223>多變魚(yú)腥藻PAL引物在位置318上形成半胱氨酸至絲氨酸的取代(正向)<400>32caagatcgttactcactccgatcccttccccagtatttggggc43<210>33<211>43<212>DNA<213>人工序列<220><223>多變魚(yú)腥藻PAL引物在位置318上形成半胱氨酸至絲氨酸的取代(反向)<400>33gccccaaatactggggaagggatcggagtgagtaacgatcttg43當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3