1.一種用于純化具有最小聚集的多變魚腥藻苯丙氨酸解氨酶(AvPAL)變異體的方法,該方法包括:
(a)通過均化作用對包含該AvPAL變異體的細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行裂解,以生成細(xì)胞裂解物;
(b)加熱該細(xì)胞裂解物至65℃達(dá)30至120min;
(c)將加熱的細(xì)胞裂解物離心,其中保留包括該AvPAL變異體的上清液;
(d)將該上清液過濾,以去除沉淀物;和
(e)通過在陰離子交換(AIEX)柱,然后在疏水作用(HIC)柱上進(jìn)行的依序色譜法從污染蛋白質(zhì)中分離該AvPAL變異體,
其中來自該HIC柱的洗出液包括該AvPAL變異體;
其中所述AvPAL變異體的位置503和565上的半胱氨酸殘基已被絲氨酸殘基取代(SEQ ID NO:11)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中所述方法是一種用于純化具有最小聚集的聚乙二醇化的多變魚腥藻苯丙氨酸解氨酶(AvPAL)變異體的方法,該方法進(jìn)一步包括:
(f)對所述來自該HIC柱的包括該AvPAL變異體的洗出液進(jìn)行超濾或者超濾/滲濾;
(g)通過將聚乙二醇與該AvPAL變異體混合對該AvPAL變異體進(jìn)行聚乙二醇化;
(h)通過超濾/滲濾從該聚乙二醇化的AvPAL變異體中去除游離的聚乙二醇;以及
(i)配制該聚乙二醇化的AvPAL變異體,
其中所述AvPAL變異體包括聚乙二醇。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法,其中AvPAL變異體和聚乙二醇的比率為約1:3。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法,其進(jìn)一步包括冷凍和融化步驟(e)中獲得的所述來自該HIC柱的包括該AvPAL變異體的洗出液,其中在冷凍之前向該HIC柱洗出液添加一種或者多種選自如下的多元醇或者糖:甘油、蔗糖、葡萄糖、海藻糖、甘露醇和山梨醇。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法,其中所述多元醇是甘油,優(yōu)選地所述甘油的濃度是10%(v/v)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法,其中所述糖是蔗糖,優(yōu)選地所述蔗糖的濃度是10%(v/v)。
7.根據(jù)權(quán)利要求4至6任何一項所述的方法,其中以離散溫度步驟來冷凍或融化所述來自該HIC柱的包括該AvPAL變異體的洗出液。
8.根據(jù)權(quán)利要求4至7任何一項所述的方法,其中以離散溫度步驟來冷凍和融化所述來自該HIC柱的包括該AvPAL變異體的洗出液。
9.根據(jù)權(quán)利要求2至8任何一項所述的方法,其中步驟(f)中的滲濾緩沖液包括磷酸鉀(KPi)以及一種或者多種由反式肉桂酸(t-CA)和甘油組成的藥劑,優(yōu)選地該滲濾緩沖液包括50mM Kpi、10mM t-CA、5%甘油,pH值為8.5。
10.根據(jù)權(quán)利要求2至9任何一項所述的方法,其中向步驟(f)中獲得的超濾或者超濾/滲濾的來自該HIC柱的包括該AvPAL變異體的洗出液添加非離子去垢劑。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法,其中該非離子去垢劑是聚山梨醇酯80(PS80),優(yōu)選地該PS80的濃度是0.02%。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11任何一項所述的方法,其中該AIEX柱是Toyopearl Giga Cap Q 650M柱。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至12任何一項所述的方法,其中該HIC柱是Toyopearl丁基650M柱。