專利名稱：能表達活性苯丙氨酸脫氨酶的基因工程菌口服制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種采用基因重組等分子生物學(xué)技術(shù)，構(gòu)建能表達有活力的苯丙氨酸脫氨酶的基因工程菌，進而制成口服制劑的方法。
經(jīng)典型苯丙酮尿癥(Phenylketonuria)是在我國及世界各國均常見的導(dǎo)致患兒智力低下、呆傻的遺傳病?，F(xiàn)行的治療方法主要是，對在新生兒篩查中發(fā)現(xiàn)的患兒立即給予特制低苯丙氨酸(Phenylalanine，簡phe)含量的奶粉，而不能吃母乳及牛奶等一切富含phe的正常食品，直至其智力發(fā)育基本正常，有的需要十幾年時間。這種特殊飲食療法不但價格昂貴，而且時間長，難以持久。有少數(shù)用苯丙氨酸脫氨酶(PhenylalanineAmmonia-lyase，簡稱PAL)進行試驗性治療的研究報告，但該酶不穩(wěn)定，價格貴，尚無臨床應(yīng)用價值。另外，現(xiàn)行的基因治療方法一般是設(shè)法使正常的苯丙氨酸羥化酶(PAH)基因在患兒肝臟表達，以替代其有缺陷的PAH基因發(fā)揮功能。該方法存在著載體選擇、給藥方式、長期服用安全性及倫理學(xué)上等一系列困難，尚有待解決。
本發(fā)明的目的在于利用基因工程技術(shù)，提供一種能表達活性苯丙氨酸脫氨酶的基因工程菌口服制劑，該制劑進入人體小腸后，使來自食物消化的phe在其被吸收之前被PAL脫氨變成對人體無害的肉桂酸，從而能夠達到與低phe飲食療法相同的療效，安全可靠，價格低廉，易于為患兒接受。
本發(fā)明提供的能表達活性苯丙氨酸脫氨酶的基因工程菌口服制劑，通過以下方法得到1、從植物中抽提總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)RT-PCR技術(shù)，制備完整PAL的cDNA，并使其兩端帶上適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶識別序列，用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶酶切該cDNA，克隆到pBluescript載體上，獲得pBS PAL1(參見圖2-4)；2、將原核表達載體PET23b、pMG36e等，用適當(dāng)限制性內(nèi)切酶酶解，純化出經(jīng)酶切具適當(dāng)末端的載體DNA片段；3、將上述制備好的PAL cDNA片段與原核表達載體片段在T4DNA連接酶催化下進行連接；
4、用上述連接混合物轉(zhuǎn)化感受態(tài)宿主菌細(xì)胞，所說的宿主菌為人類腸道正常菌群；5、用特異引物的PcR篩選含完整PAL cDNA的陽性克隆，并用限制性內(nèi)切酶圖譜鑒定其正確性；6、用高壓液相層析HPLC檢測到所得的陽性克隆工程菌，PET23b-PAL、pMG36e-PAL、pMG36e-s-PAL等能將外加苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為肉桂酸，用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，可見到一條分子量約為70KD的蛋白產(chǎn)物帶，即苯丙氨酸脫氨酶；7、將上述能表達活性苯丙氨酸脫氨酶的基因工程菌制成口服制劑。
下面結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明作進一步說明。
實施例1、從受機械損傷的歐芹莖葉中抽提總RNA，用RT-PCR技術(shù)制備PAL的cDNA，用SnaBI和XbaI消化PAL cDNA，得到2.4Kb的具有XbaI粘性末端和平末端的PAL cDNA片段；用EcocRI和XbaI酶解穿梭質(zhì)粒pMG36e DNA，得到具XbaI粘性末端和平末端的載體DNA；將二者重組連接。轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.Coli，得到PALcDNA插入方向正確的大腸桿菌表達株pMG36e-PAL；用PCR法及XbaI，/HindIII酶切分析均證實其正確性。如圖2所示，每ml該大腸桿菌工程菌培養(yǎng)液(NZCYM)中加入phel.25mg，37℃保溫不同時間后，用HPLC分析培養(yǎng)液中肉桂酸，發(fā)現(xiàn)其濃度逐漸增大，說明pMG36e-PAL確實能將phe脫氨而生成肉桂酸(見

圖1)。
用電穿孔技術(shù)(Electroporation)將重組質(zhì)粒pMG36e-PAL轉(zhuǎn)導(dǎo)進乳酸桿菌(Lactobacillus)、乳球菌(Lactococcus)及雙歧桿菌(Bafitobacterium)，分別得到能表達活性PAL的乳酸桿菌工程菌pMG36e-PAL-L、乳球菌工程菌pMG36e-PAL-LC、雙歧桿菌工程菌pMG36e-PAL-B，將它們送入高苯丙氨酸血癥大鼠腸道，均檢測到大鼠外周血中phe濃度顯著下降(見圖2所示)。
2、制備2.4Kb具有平末端及XbaI粘性末端的完整PALcDNA。用SacI和XbaI雙酶解pMG36e質(zhì)粒DNA，用DNA合成及遞歸PCR技術(shù)，制備長180bp，具SacI末端和平末端的含有能引導(dǎo)融合PAL蛋白從細(xì)菌細(xì)胞分泌到胞外的信號肽基因片段。這三種DNA在T4DNA連接酶作用下，便重組成含完整PAL cDNA，并在pp其上游區(qū)有一編碼27個氨基酸的信號肽的基因片段。這一重組表達質(zhì)粒，定名pMG36e-s-PAL。將其分別轉(zhuǎn)化E.Coli，乳酸桿菌等宿主菌，篩選到其在大腸桿菌的工程菌pMG36e-s-PAL-E.Coli，在乳酸桿菌中的工程菌(pMG36e-s-PAL-L)，在乳球菌中的工程菌pMG36e-s-PAL-LC，在雙歧桿菌中的工程菌pMG36e-s-PAL-B，上述工程菌均能使phe脫氨而變成肉桂酸(見圖3所示)。
3、用NdeI和Bgl II酶解PAL-cDNA，制得具NdeI和Bgl II粘性末端的PAL cDNA。用NdeI和Bgl II處理原核表達載體pET23b，將二者在T4DNA連接酶作用下連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.Coli，用pCR技術(shù)和酶切圖譜法鑒定陽性克隆，即工程菌pET23b-PAL。PET23b-PAL工程菌裂解液經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，考馬斯亮蘭染色，可見工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后出現(xiàn)一條長約70kd的新的蛋白產(chǎn)物，與PAL理論分子量一致。說明該工程菌可誘導(dǎo)表達PAL。后者能將phe轉(zhuǎn)化為肉桂酸(見圖4所示)。
本發(fā)明的優(yōu)點體現(xiàn)在以下幾方面1、安全，有效。用本發(fā)明基因工程菌口服制劑治療苯丙酮尿癥，外源基因及載體DNA不進入人體組織細(xì)胞內(nèi)，絕無與人基因組DNA整合或激活諸如癌基因等的可能性。加之乳酸桿菌、雙歧桿菌等本來就是人類腸道內(nèi)有益的正常菌群，phe經(jīng)PAL轉(zhuǎn)化后的產(chǎn)物肉桂酸對人體亦無毒害。
2、提高了患兒生活質(zhì)量。苯丙酮尿癥患兒及孕婦在服用本制劑期間，可與常人一樣正常飲食。與食用十幾年特制異味低phe奶粉的治療方法相比較，本發(fā)明易于為苯丙酮尿癥患兒、孕婦及家長所接受，患兒可吃到美味食品是其極大的幸福。
3、用藥方式簡便易行，且可通過控制服藥次數(shù)、劑量來調(diào)節(jié)腸內(nèi)PAL活力，達到最佳療效。
4、市場大，用量大，經(jīng)濟效益可觀。苯丙酮尿癥雖發(fā)病率有限(約1/1.6萬)，但全世界各國、各人種均有此病發(fā)生，且每個患者用藥時間長達十幾年，為本發(fā)明提供了廣闊的應(yīng)用前景。
總之，本發(fā)明巧妙地避開了現(xiàn)行基因治療所遇到的一系列難題，利用PAL這一本來與phe體內(nèi)正常代謝無關(guān)的酶及人類腸道正常菌群，直接在小腸內(nèi)設(shè)一小“藥廠”，就地生產(chǎn)PAL，就地發(fā)揮藥效，同時避開了現(xiàn)行基因工程藥物的分離、純化等后處理的難題。
本發(fā)明中的圖式說明圖1工程菌PAL酶活性檢測結(jié)果。
圖2組成性表達PAL示意圖。
圖3分泌表達PAL示意圖。
圖4誘導(dǎo)表達PAL示意圖。
權(quán)利要求
1.一種能表達活性苯丙氨酸脫氨酶的基因工程菌口服制劑，其特征在于通過以下方法得到(1)從植物中抽提總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)RT-PCR技術(shù)，制備完整PAL的cDNA，并使其兩端帶上適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶識別序列，用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶酶切該cDNA，得到具有適當(dāng)末端的PAL cDNA片段；(2)將原核表達載體，用適當(dāng)限制性內(nèi)切酶酶解，純化出經(jīng)酶切具適當(dāng)末端的載體DNA片段；(3)將上述制備好的PAL CDNA片段與原核表達載體片段在T4DNA連接酶催化下進行連接；(4)用上述連接混合物轉(zhuǎn)化感受態(tài)宿主菌細(xì)胞；所說的宿主菌為人類腸道正常菌群；(5)用特異引物的PCR篩選含完整PAL cDNA的陽性克隆，并用限制性內(nèi)切酶圖譜鑒定其正確性；(6)用高壓液相層析HPLC檢測到所得的陽性克隆工程菌，pET23b-PAL、pMG36e-PAL、pMG36e-s-PAL等能將外加苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為肉桂酸，用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，可見到一條分子量約為70KD的蛋白產(chǎn)物帶，即苯丙氨酸脫氨酶；(7)將上述能表達活性苯丙氨酸脫氨酶的基因工程菌制成口服制劑。
全文摘要
本發(fā)明為一種能表達活性苯丙氨酸酶的基因工程菌口服制劑，該制劑經(jīng)過以下步驟制成從植物中抽提總RNA，構(gòu)建能表達有活力的苯丙氨酸脫氨酶的cDNA的工程菌，宿主菌選用人小腸正常菌群，包括乳酸桿菌、乳球菌及雙歧桿菌等，進而制成口服制劑。該制劑進入人體小腸后，使來自食物消化的phe在其被吸收之前被PAL脫氨，變成對人體無害的肉桂酸，對經(jīng)典型苯丙酮尿癥能夠達到與低phe飲食療法相同的療效，服用方便，安全可靠。
文檔編號A61K35/74GK1154845SQ9611215
公開日1997年7月23日 申請日期1996年9月9日 優(yōu)先權(quán)日1996年9月9日
發(fā)明者劉敬忠 申請人:首都醫(yī)學(xué)院附屬北京紅十字朝陽醫(yī)院