專利名稱：一種粘紅酵母苯丙氨酸脫氨酶基因序列獲取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明在已知部分序列的基礎(chǔ)上，采用5' -RACE(快速獲取5'端序列)技術(shù)獲取粘紅酵母苯丙氨酸脫氨酶的全長基因，屬于基因克隆技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
苯丙氨酸脫氨酶(PAL)在pH 8. O時催化L-苯丙氨酸(L_phe)脫氨生成反式肉桂酸和氨，pH 11. O時能催化逆向反應(yīng)合成L-phe，工業(yè)上利用這一特性，生產(chǎn)人體必須氨基酸L-phe和甜味劑阿斯巴甜。PAL廣泛存在于植物、微生物中，微生物主要有霉菌和酵母菌， 尤其是紅酵母屬中。其中粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)可以在廉價的原料如玉米粉， 糖漿，糖蜜，豆柏，味精廢水等工業(yè)廢料上生長，容易實現(xiàn)大規(guī)模的培養(yǎng)，已經(jīng)成功應(yīng)用于食品、制藥等工業(yè)領(lǐng)域。但是由于該酶是誘導酶，在對數(shù)生長期酶活達到峰值后，酶活下降較快，穩(wěn)定性差。為進一步提高酶活和穩(wěn)定性，需要采用分子生物手段對酶進行分子改造，但到目前為止，僅僅獲得部分的cDNA。為進一步提升該酶的工業(yè)應(yīng)用價值，對粘紅酵母PAL 進行改造，首先需要獲得全長的基因序列，本專利的方法是根據(jù)已經(jīng)報道部分粘紅酵母PAL 的cDNA序列的基礎(chǔ)上(GenBank DQ013364.1)，成功獲得粘紅酵母PAL全長的基因序列。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種獲取粘紅酵母PAL全長基因序列的方法。
本發(fā)明的具體步驟如下
(I)提取粘紅酵母總RNA。
(2)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。
(3)獲得pal 5'端的序列
(4)構(gòu)建克隆載體pUCm-T-pal,測序,獲得全長的序列。
本發(fā)明的詳細的步驟為
I提取粘紅酵母總RNA
(I)從粘紅酵母平板上挑取單菌落至5mL的種子培養(yǎng)基中于30°C培養(yǎng)24h后，取 50 μ L的種子液至裝有50mL培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，30°C培養(yǎng)18_20h至OD6tltl = 1.0, 1500g離心5min收集菌體，用冷水將菌體洗滌2次，棄上清。
(2)用 400 μ L 的 TES (IOmM Tris-HCl, IOmM EDTA，0. 5% SDS, ρΗ7· 5)緩沖液重懸細胞，加入400 μ L酸性酚，劇烈震蕩10sec，65°C溫育lh，不時用渦旋振蕩器短暫震蕩。
(3)冰育 5min,于 4°C, 12000g 離心 5min。
(4)將水相移至另一 1. 5mL的離心管中，加入400 μ L酸性酚，劇烈震蕩lOsec，重復步驟(3)。
(5)將水相移至另一1. 5mL的離心管中，加入氯仿,劇烈震蕩IOsec,于4°C, 12000g 離心5min。
(6)將水相移到新的1. 5mL離心管中，加入40ul的3M NaAc及Iml冰冷的無水乙醇，于 4°C，12000g 離心 5min。
(7)加入lmL，75%乙醇快速震蕩洗滌RNA沉淀。
(8)沉淀于無菌操作臺上風吹15min至酒精揮發(fā)完全，加入經(jīng)DEPC處理的無菌水 50 μ L重懸，-80°c保藏備用，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質(zhì)量。
2反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA
(I)于 0.5mL 的離心管中加入 50ng總 RNA，lyL 5，-CDS (5，-(T)25VN (N = A，C，G， T ;V = A，G，C)-3，)和 IyL SMARTer II A Oligonucleotide (5' -AAGCAGTGGTATCAACGCA GAGTACGGGGG-3')，加水至 4. 75 μ L 混勻。
(2)72°C溫育 3min 后于 42。。溫育 2min, I5OOg 離心 IOsec0
(3)力口入 2yL 5Xbuffer(250Mm Tris-HCl, 375mM KCl,30mM MgCl2)，I μ L 的 DTT (20mM)，I μ L dNTP (IOmM)，0· 25 μ L RNase 抑制劑和 I μ L SMARTer 反轉(zhuǎn)錄酶，42。。溫育90min后于70°C變性lOmin，冷卻至室溫加入20 μ L無菌水，獲得cDNA。
3犾得pal 5'端的序列
(I)往 O. 25mL 的離心管力口入 IyL cDNA, 5 μ L Mix 引物(5 ' -CTAATACGACTCACTATAGGGCA AGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3 '； 5 ' -CTAATACGACTCACTATAGGGC-3 ' )，I μ L GSP 特異性引物(5 ' -GGTGATGCCG TGGTTG AGGAAGTT-3 ' ) ,5μ L 10 X buffer, 5 μ L dNTP (2mM)，O. 5 μ L pfu DNA 聚合酶，3 μ L MgSO4 (25mM)，加去離子水至50 μ L。
(2)進行PCR擴增，PC R擴增條件94°C預(yù)變性4min，94°C變性lmin，58°C退火 30sec,72°C延伸60sec,25個循環(huán),瓊脂糖凝膠電泳檢測。
(3)往 O. 25mL 的離心管中加入 5 μ L PCR 產(chǎn)物，I μ L IOXTaq buffer, I μ L dATP (2mM), I μ L Taq SI (5U/ μ L)加水至10 μ L，70°C反應(yīng)30min后酚仿抽提，乙醇沉淀，無菌操作臺風吹15min至酒精揮發(fā)完全，用10 μ L無菌水重懸。
(4)取上一步反應(yīng)液 5 μ L，加入 I μ L 連接 buffer，IyL 50% PEG, I μ L pUCm-T 載體，IyL T4連接酶，加去離子水至10 μ L，于16 °C過夜連接。
(5)取連接產(chǎn)物 10 μ L，10 μ L 5XKCM(O. 5Μ KC1，0.15M CaCl2,0. 25M MgCl2)，去離子水30 μ L，加至50 μ L的E. coli JM109感受態(tài)中，冰浴30min，42°C熱擊90sec，冰浴2min， 加入100 μ L的新鮮LB培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)30_60min，取100 μ L涂布含有氨芐青霉素(50ug/ mL)的LB平板，37°C培養(yǎng)10h，挑取單菌落，接入5mL含50ug/mL的氨芐青霉素LB培養(yǎng)基中 37°C培養(yǎng)10h，取2mL菌液提質(zhì)粒進行測序，獲得5'端的序列。
4構(gòu)建克隆載體pUCm-T-pal
(I)根據(jù)步驟3獲得的5 '端序列，設(shè)計一對特異性引物(primer F 5' -GGAATTCCATATGATGGCCCCC TCCGTCGACTCGATC-3' ；primer R 5/ -CGGAATTCCTAGTAT GGTCTACGTCCAAAGG-3 ' ),0. 25mL 的離心管加入 I μ L cDNA, primer F 和 R各 lyL，5yL 10Xbuffer,5y L dNTP(2mM),0. 5 μ L pfu DNA 聚合酶，加去離子水至 50 μ L。
(2)進行PCR擴增，PCR擴增條件94 °C預(yù)變性4min，94 °C變性lmin，58°C退火 30sec,72°C延伸2min,25個循環(huán),瓊脂糖凝膠電泳檢測。
(3)參照步驟3，將擴增到全長基因序列與pUCm-T連接，轉(zhuǎn)入E. coli JM109，涂布含有氨芐青霉素的LB平板，挑單菌落至LB培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)10h，取2mL菌液提質(zhì)粒進行測序，獲得全長的序列，采用PCR驗證構(gòu)建的pUCm-T-pal，分析閱讀框。


圖1獲取粘紅酵母苯丙氨酸脫氨酶基因序列流程圖
圖2.提取的粘紅酵母總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖
圖3. PCR擴增獲得pal的5'端DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖
圖4. PCR擴增獲得全長基因的瓊脂糖凝膠電泳圖
具體實施例方式
材料和檢測方法
(I)粘紅酵母(Rhodotorula glutinis JN-1) (CCTCC NO :M2011490)，江南大學工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室篩選。
(2)反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國clontech公司。
(3)pfu酶，Taq酶，和pUCm-T，引物，均購自上海生物工程有限公司。
(4)測序由上海生物工程有限公司完成。
(5)采用Invitrogen軟件拼接序列和分析閱讀框。
實施例1
挑取粘紅酵母單菌落至5mL的種子培養(yǎng)基中于30°C培養(yǎng)24h后，取50 μ L的種子液至裝有50mL培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，30°C培養(yǎng)至OD6tltl =1. 0，離心收集菌體，采用TES 裂解細胞，酸性酚和氯仿提取總RNA，-80°C保藏備用，采用瓊脂糖電泳檢測總RNA質(zhì)量。
實施例2
經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測,提取高質(zhì)量的RNA,加入反轉(zhuǎn)錄酶和反應(yīng)緩沖液，42°C反應(yīng) 90min，70°C 處理 lOmin，加入 20μ L 無菌水，獲得 cDNA。以 5' -CTAATACGACTCACTATAGGGC AAGCAGTGGTATCAAC GCAGAG T-3/ ；5/ -CTA ATACGACTCACTA TAGGGC-3' ；5/ -GGTGATGCCG TGGTTG AGGAAGTT-3 '為引物進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結(jié)果，切膠回收目的條帶，加入Taq酶，700C反應(yīng)30min后酚仿抽提，與pUCm_T連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E. coli JM109,提質(zhì)粒進行測序,獲得5'端的序列。
實施例3
根據(jù)基因的5 '端序列，以 5 ' -GGAATTCCATATGATGGCCCCCTCCGTCGACTCGATC-3 ' 和5 ' -CGGAATTCC TAGTATGGTCTACGTCCAAAGG-3 '弓I物進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物中加入Taq酶，70°C反應(yīng)30min后酚仿抽提，與pUCm_T 連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E. coli JM109,提質(zhì)粒進行PCR驗證，測序，構(gòu)建pUCm-T-pal，利用 Invitrogen軟件拼接序`列和分析閱讀框。
權(quán)利要求
1.一種粘紅酵母苯丙氨酸脫氨酶基因(pal)序列獲取方法；
2.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，苯丙氨酸脫氨酶基因(pal)來自粘紅酵母 (Rhodotorula glutinis JN-1)(保藏編號 CCTCC NO M2011490)；
3.按權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，采用酸性酚法提取粘紅酵母總RNA；
4.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，采用SMARTerIIA Oligonucleotide(5 ' -AAGCAGT GGTAT CAACGCAGAGTACGGGGG-3 ')和 CDS 引物 5’ -(T)25VN (N = A，C，G, T ；V = A, G，C)_3’ 進行反轉(zhuǎn)錄；
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，采用Mix引物(longprimer 5 ' -CTAATACGACTCACTATAGG GCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3 ' ;Short primer 5' -CTAATACGACTCACTATAG GGC-3')和特異性引物 GSP(IOyM) 5/ -GGTGATGCCGTGGTTGAG GAAGTT-3'，進行 PCR 擴增，獲取pal的5'端的一段基因序列；
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，PCR擴增條件是94°C預(yù)變性4min，94°C變性 lmin, 58°C退火 30sec, 72°C延伸 2min, 25 個循環(huán)；
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，構(gòu)建pUCm-T-pal克隆載體，轉(zhuǎn)入 E. coliJM109，含有氨芐青霉素(50ug/mL)的LB平板上挑取單菌落培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，測序，獲取全長的pal序列；
8.如權(quán)利要求2所述的方法，培養(yǎng)粘紅酵母的種子培養(yǎng)基為1%酵母提取物，1%蛋白胨，0.5%氯化鈉(pH6.0);誘導產(chǎn)苯丙氨酸脫氨酶培養(yǎng)基為在種子培養(yǎng)中加入O. 1%的 L-phe ；
9.權(quán)利要求7所述的方法，用于培養(yǎng)E.coliJM109的LB培養(yǎng)基為1%胰蛋白胨，O. 5% 酵母抽提物，I %氯化鈉(PH7. O)。
全文摘要
本發(fā)明公開一種獲取粘紅酵母苯丙氨酸脫氨酶基因的方法，經(jīng)過提取RNA，反轉(zhuǎn)錄，PCR擴增，構(gòu)建克隆載體pUCm-T-pal，測序，獲得全長的苯丙氨酸脫氨酶基因序列，屬于基因克隆技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明方法操作簡單，具有較高的效率和成功率。
文檔編號C12N15/60GK103060352SQ20121034515
公開日2013年4月24日 申請日期2012年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月18日
發(fā)明者周哲敏, 朱龍寶, 崔文璟, 周麗, 曲娟娟 申請人:江南大學