一種玉米苯丙氨酸解氨酶及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種玉米苯丙氨酸解氨酶，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示，其編碼的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。本發(fā)明還公開了上述玉米苯丙氨酸解氨酶在生物法合成肉桂酸中的應(yīng)用。將本發(fā)明提供的玉米苯丙氨酸解氨酶ZmPAL基因構(gòu)建到大腸桿菌表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌細(xì)胞進(jìn)行原核表達(dá)，可用于高比活植物苯丙氨酸解氨酶的生產(chǎn)。獲得的重組玉米苯丙氨酸解氨酶能夠催化L-苯丙氨酸去氨基生產(chǎn)肉桂酸，為全生物合成制備肉桂酸提供了可能，具有很高的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。
【專利說明】一種玉米苯丙氨酸解氨酶及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程和微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及玉米苯丙氨酸解氨酶(ZmPAL)基因及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]苯丙氨酸解氨酶于1961年由J.Koukol, E.Conn在大麥中發(fā)現(xiàn),主要存在于高等植物、酵母、菌類的可溶性部分。一般分子量為30萬，是一個(gè)可把苯丙氨酸用于酚類化合物合成的胞內(nèi)誘導(dǎo)酶，在組織中的活性可隨外界因素而發(fā)生顯著變化。近年來苯丙氨酸解氨酶的研究主要集中在植物生理代謝調(diào)控和醫(yī)用領(lǐng)域。在植物的代謝過程中，苯丙氨酸解氨酶是催化苯丙烷類代謝途經(jīng)第一步反應(yīng)的酶，也是這個(gè)途徑的關(guān)鍵酶和限速酶，所參與的苯丙烷類代謝途徑的次生代謝產(chǎn)物在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、抗病、抗逆反應(yīng)中起著重要的作用；在醫(yī)用領(lǐng)域，苯丙氨酸解氨酶可以用于治療某些腫瘤，監(jiān)控苯丙酮尿患者血漿中的苯丙氨酸含量，治療苯丙酮尿患者，其主要作用是催化肉桂酸轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-苯丙氨酸。苯丙氨酸解氨酶用于工業(yè)生產(chǎn)并不多見，目前研究大多局限于酶法制備L-苯丙氨酸。L-苯丙氨酸是人體八種必須氨基酸之一，用于制備多重氨基酸輸液，綜合氨基酸制劑以及營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑，也是功能性食品甜味劑阿斯巴甜(AMP)生產(chǎn)的主要原料。苯丙氨酸解氨酶(PAL)轉(zhuǎn)化肉桂酸制備L-苯丙氨酸工藝不需輔助因子、工藝路線簡(jiǎn)單、成本低，所以極具競(jìng)爭(zhēng)力。該工藝所用的苯丙氨酸解氨酶主要來自紅酵母屬，目前主要問題是生產(chǎn)過程中由于紅酵母的PAL產(chǎn)量低，酶活下降迅速，導(dǎo)致肉桂酸轉(zhuǎn)化率低，限制了 L-苯丙氨酸的生產(chǎn)。
[0003]肉桂酸，分子量為148.17,微微有桂皮香氣,是從肉桂皮或安息香分離出的有機(jī)酸。在植物中的代謝途徑是由苯丙氨酸脫氨降解產(chǎn)生的苯丙烯酸，其可作為芳香混合物，用于香皂、香波、洗衣粉和日用化妝品中，以增加香味。還可用在葡萄酒中，使其色澤光鮮，在飲用進(jìn)人體之后，還能增強(qiáng)人體的免疫功能，防止氧化作用進(jìn)程和自由基的釋放。作為一種重要的精細(xì)化工品目前在香精香料、食品添加劑、醫(yī)藥工業(yè)、美容、農(nóng)藥、有機(jī)合成等多個(gè)方面均有重要用途。肉桂酸按照烯鍵上氫原子空間位置不同，可分為順式和反式兩種，順式肉桂酸來自于天然提取，而化學(xué)合成生產(chǎn)獲得的肉桂酸均為反式結(jié)構(gòu)。Perkin反應(yīng)制備反式肉桂酸是將苯甲醛、醋酸酐和無水醋酸鈉混合反應(yīng)獲得，該工藝主要缺點(diǎn)在于收率低、成本相對(duì)較高，且原料相對(duì)有毒，生產(chǎn)的肉桂酸在食品、美容等行業(yè)應(yīng)用受限。因此，尋求能夠高效轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸合成肉桂酸的苯丙氨酸解氨酶，不僅對(duì)于提供肉桂酸生產(chǎn)新工藝具有一定的新穎性，更重要的意義在于酶法制備肉桂酸是一種全生物合成路線(苯丙氨酸來自于發(fā)酵法)，生產(chǎn)獲得肉桂酸更接近天然肉桂酸，對(duì)肉桂酸在食品、美容等與人體健康密切相關(guān)的領(lǐng)域應(yīng)用有重大貢獻(xiàn)。
[0004]迄今為止，適用于L-苯丙氨酸合成肉桂酸的苯丙氨酸解氨酶制備與開發(fā)的報(bào)道很少，目前尚未發(fā)現(xiàn)對(duì)玉米苯丙氨酸解氨酶基因體外表達(dá)的研究。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]為解決上述問題，本發(fā)明的目的在于提供一種適于苯丙氨酸合成肉桂酸的玉米苯丙氨酸解氨酶ZmPAL、編碼基因及其應(yīng)用。
[0006]一種玉米苯丙氨酸解氨酶ZmPAL，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0007]上述玉米苯丙氨酸解氨酶的編碼基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，長(zhǎng)度為2223bp。
[0008]一種重組質(zhì)粒，它含有玉米苯丙氨酸解氨酶基因，具體為pETDuet-1-ZmPAL。
[0009]一種重組菌,它是包含了重組質(zhì)粒pETDuet-1-ZmPAL的大腸桿菌。
[0010]上述重組菌的構(gòu)建方法，將玉米苯丙氨酸解氨酶基因連接到表達(dá)質(zhì)粒載體上，將含有玉米苯丙氨酸解氨酶基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。
[0011]上述玉米苯丙氨酸解氨酶在生物法合成肉桂酸中的應(yīng)用。
[0012]本發(fā)明是利用生物信息學(xué)手段分析玉米全基因組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行基因探礦，對(duì)來源于玉米的苯丙氨酸解氨酶進(jìn)行密碼子優(yōu)化和序列設(shè)計(jì)，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:I所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，利用化學(xué)法合成該基因并通過DNA重組技術(shù)將本發(fā)明制備的玉米苯丙氨酸解氨酶基因在原核細(xì)胞中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，獲得的重組玉米苯丙氨酸解氨酶共741個(gè)氨基酸，分子量為80KDa，在40°C、pH值為8.5-9.0的條件下具有較高的酶活。
[0013]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有實(shí)質(zhì)性的特點(diǎn)和顯著性的進(jìn)步是:
[0014]與玉米基因組數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)的苯丙氨酸解氨酶相比，在N端添加了 Met、Gly、Ser、Ser、His、His、His、His、His、His、Ser、Gin、Asp、Pro、Asn、Ser、Ser、Ser、Ala、Arg、Leu、Gin、Val、Asp、Lys、Leu共26個(gè)氨基酸，本發(fā)明中蛋白理論大小為741個(gè)氨基酸。
[0015]通過Blast軟件在線比較分析，發(fā)現(xiàn)ZmPAL編碼的氨基酸序列與其它植物的已知PAL 具有較高的同源性，與高梁(sorghum bicolor)、苦竹(Pleioblastus maculosoides)、毛竹(phyllostachys edulis)、水稻(oryza sativa)、大麥(hordeum vulgare)的一致性分別為 77%、76%、75%、75% 和 74%。
[0016]本發(fā)明中，術(shù)語“玉米苯丙氨酸解氨酶”還包括能編碼具有與玉米苯丙氨酸解氨酶相同功能的蛋白的SEQ ID N0.1序列的變異形式。這些變異形式包括:若干個(gè)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和3’端添加數(shù)個(gè)核苷酸。
[0017]在本發(fā)明實(shí)例中，所述的基因全長(zhǎng)2223bp。通過化學(xué)合成法合成該基因并將其連接在表達(dá)載體上，形成重組質(zhì)粒pETDuet-1-ZmPAL,進(jìn)一步將可誘導(dǎo)表達(dá)苯丙氨酸解氨酶基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞E.coli BL21 (DE3)中，將轉(zhuǎn)化好的細(xì)胞轉(zhuǎn)接到含有AMP的LB培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。待OD6tltl為0.6-0.8時(shí)，加入終濃度為I μ g/mL的IPTG誘導(dǎo)目的基因的表達(dá)，誘導(dǎo)之后采用超聲波破碎細(xì)胞，獲得具有活性的苯丙氨酸解氨酶，對(duì)該酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定，在37°C下，在12.1mM的L-苯丙氨酸、50mM的Tris-HCl的底物中加入適量的粗酶液，反應(yīng)30min，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定肉桂酸的生成，證明誘導(dǎo)表達(dá)出的苯丙氨酸解氨酶具有活性。
[0018]本發(fā)明的有益效果:
[0019]本發(fā)明提供了一種在體外合成的玉米苯丙氨酸解氨酶，該酶可以應(yīng)用于以L-苯丙氨酸為底物生物制備肉桂酸方面。本發(fā)明不僅解決了從植物中提取苯丙氨酸解氨酶的困難，而且可以實(shí)現(xiàn)生物制備肉桂酸的途徑，保證了肉桂酸的安全性，具有很高的應(yīng)用價(jià)值?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0020]圖1是含有玉米苯丙氨酸解氨酶基因的質(zhì)粒pETDuet-1-ZmPAL結(jié)構(gòu)圖。
[0021]圖2是對(duì)含有ZmPAL基因的重組質(zhì)粒pETDuet-l_ZmPAL雙酶切電泳結(jié)果。其中，M:Marker DL5, 000 ;1，2為雙酶切的兩段基因。
[0022]圖3是誘導(dǎo)表達(dá)后粗酶液和純酶液的SDS-PAGE電泳結(jié)果圖。其中，I為空的pETDuet上清液；2為重組蛋白粗酶液；M為Marker ;3~8分別為0%、20%、40%、60%、80%、100%洗脫結(jié)果。
[0023]圖4是L-苯丙氨酸生成肉桂酸的轉(zhuǎn)化反應(yīng)Oh的HPLC圖。其中，1:L_苯丙氨酸。
[0024]圖5是L-苯丙氨酸生成肉桂酸的轉(zhuǎn)化反應(yīng)Ih的HPLC圖。其中，1:L_苯丙氨酸；2:肉桂酸。
【具體實(shí)施方式】
[0025]下面結(jié)合實(shí)驗(yàn)室具體的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。在下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件操作，例如《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》。
[0026]實(shí)施例1:含有玉米苯丙氨酸解氨酶基因序列的重組菌的構(gòu)建。
[0027]通過化學(xué)合成法合成編碼本發(fā)明中玉米的苯丙氨酸解氨酶基因(SEQ ID No:
I所示)片段，并將其連接到pETDuet-Ι載體上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過藍(lán)白斑篩選，提取陽性克隆質(zhì)粒并酶切圖譜分析，驗(yàn)證得到載有ZmPAL基因的重組質(zhì)粒pETDuet-1-ZmPAL,重組表達(dá)載體pETDuet-1-ZmPAL圖如圖1所示。把重組載體重組質(zhì)粒pETDuet-1-ZmPAL轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞涂布于含有1% Amp的LB平板上37°C進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)平板上生長(zhǎng)出來的單菌落提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切電泳驗(yàn)證，電泳結(jié)果(圖2)表明，單克隆菌落含有目的基因片段，可用于苯丙氨酸解氨酶蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)實(shí)驗(yàn)。
[0028]實(shí)施例2:玉米苯丙氨酸解氨酶基因的原核表達(dá)與純化。
[0029]將實(shí)施例1中鑒定正確的克隆進(jìn)行過夜培養(yǎng)，再轉(zhuǎn)接到含I μ g/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，待菌液0D_為0.6-0.8時(shí)，加入終濃度為ImM的IPTG于16°C下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)8h之后，收集菌液，8000rpm，5min，倒掉上清培養(yǎng)基，用PBS等體積洗滌兩次，加入適量PBS，使得重懸菌液0D_=20，加入15% (v/v)甘油，ImM的苯甲基磺酰氟(PMSF)，并在渦旋機(jī)上混勻；用超聲波破碎儀破碎，超聲波破碎條件:工作時(shí)間設(shè)為20min，每次工作5s，休息4s，功率設(shè)為25%，破碎后獲得苯丙氨酸解氨酶粗酶液，4°C下IOOOOrpm離心IOmin,取上清,將收集的蛋白與樣品溶解液1:1體積比于100°C水浴加熱5min失活后用SDS-PAGE進(jìn)行蛋白驗(yàn)證，用含不載有目的基因ZmPAL的空質(zhì)粒的E.coli BL21 (DE3)誘導(dǎo)表達(dá)出的蛋白做空白對(duì)照，驗(yàn)證結(jié)果如圖3所示。對(duì)獲得的苯丙氨酸解氨酶粗酶液用
0.22 μ m膜過濾除去雜質(zhì)，采用親和介質(zhì)填充層析柱鎳柱對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化，上樣前預(yù)先5倍柱體積的緩沖液平衡親和柱，上樣后先以100%的Binding Buffer洗脫雜蛋白，再用不同百分比的Elution Buffer洗脫重組蛋白以獲得純化的蛋白溶液,409i)Elution Buffer的洗脫液中含有目的蛋白。[0030]實(shí)施例3:苯丙氨酸解氨酶酶學(xué)性質(zhì)的研究。
[0031]將實(shí)施例2獲得的粗酶液和純酶液進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)的研究，包括酶活、比活性、最適溫度和最適PH等。酶活采用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定。
[0032]苯丙氨酸解氨酶酶活測(cè)定，按照表1中所示的反應(yīng)體系加入各組分，對(duì)照管用失活的酶液，37°C溫育，反應(yīng)30min，然后分別用6N的HCl終止反應(yīng)，用紫外分光光度計(jì)在A29tl下測(cè)定反應(yīng)前后肉桂酸的生成量，以二者差值計(jì)算細(xì)胞粗酶液PAL的酶活(酶活力單位采用國(guó)際單位IU,即以每分鐘生成I μ mo I肉桂酸為1IU)。
[0033]表1ZmPAL活性檢測(cè)
[0034]
【權(quán)利要求】
1.一種玉米苯丙氨酸解氨酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
2.—種玉米苯丙氨酸解氨酶的編碼基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
3.—種重組質(zhì)粒，其特征在于，它含有權(quán)利要求2所述的玉米苯丙氨酸解氨酶基因。
4.一種重組菌，其特征在于，它是包含了權(quán)利要求3所述的重組質(zhì)粒的大腸桿菌。
5.權(quán)利要求4所述的重組菌的構(gòu)建方法，其特征在于，將玉米苯丙氨酸解氨酶基因連接到表達(dá)質(zhì)粒載體上，將含有玉米苯丙氨酸解氨酶基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。
6.權(quán)利要求1所述的玉米苯丙氨酸解氨酶在生物法合成肉桂酸中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/60GK103468665SQ201310464644
【公開日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2013年10月8日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月8日
【發(fā)明者】歐陽嘉, 臧穎, 鄭兆娟, 李鑫, 朱均均, 徐勇, 勇強(qiáng) 申請(qǐng)人:南京林業(yè)大學(xué)