專利名稱：：使用源自Idiomarinaloihiensis的苯丙氨酸解氨酶從肉桂酸衍生物生產(chǎn)光學(xué)活性苯丙...的制作方法使用源自/Aoman'"fl/o//^"w\s的苯丙氨酸解氨酶從肉桂酸衍生物生產(chǎn)光學(xué)活性苯丙氨酸化合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及制備對(duì)映異構(gòu)體富集的(enantiomericallyenriched)苯丙氨酸化合物的方法，其中使相應(yīng)的肉桂酸在存在立體選擇性苯丙氨酸解氨酶時(shí)與氨基供體反應(yīng)。對(duì)映異構(gòu)體富集的苯丙氨酸化合物是例如藥物制品的重要中間體，尤其是在對(duì)血管緊張素I轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACE)的制備中，ACE被用于治療高血壓(highbloodpressure,也作hypertension)。例如，光學(xué)活性的(S)-吲哚啉-2-羧酸((S)陽(yáng)indoline-2-carboxylicacid)(可通過(guò)(S)畫(huà)2-氯苯丙氨酸閉環(huán)制備)可用于制備[2S-[1[I^(R",2a，3ab,7ab]]-l-[2-[[l-(乙氧羰基)丁基]氨基]-1-氧代丙基]八氫-lH-吲哚-2-羧酸，后者也作為商品名培哚普利(Perind叩ril)己知，其可用作抗高血壓藥(ACE抑制劑)或強(qiáng)心藥(cardiotonic)活性成分。其它有用的應(yīng)用為例如噴托普禾iJ(Pentopril)和吲哚普利(Indolapril)。從WO2006/069799Al可獲知制備對(duì)映異構(gòu)體富集的苯丙氨酸化合物的工藝，其中在一個(gè)特定的實(shí)施例中，通過(guò)在存在來(lái)自兄g/t^'m's的苯丙氨酸氨裂解酶(PAL)時(shí)將3-(2-氯-苯基)丙烯酸與水性NH3反應(yīng)，來(lái)制備(S)-2-氨基-3-(2-氯-苯基)-丙酸。來(lái)自Wotfotora/flg/w"m、的氨基酸序列可見(jiàn)WO01/11071A2和本文的SEQIDNO.9。WO2006/069799Al中所述工藝的缺點(diǎn)是發(fā)生底物抑制。因此，該工藝需要在低濃度下運(yùn)行。因此為了生產(chǎn)可接受量的產(chǎn)物，需要大體積或復(fù)雜的補(bǔ)料方案，使得從商業(yè)觀點(diǎn)來(lái)看該工藝較不吸引人。因此，提供下述工藝是本發(fā)明的一個(gè)目的，所述工藝用于制備苯丙氨酸化合物，其中底物抑制被降低。該目的已通過(guò)工藝方法達(dá)成，所述工藝用于制備對(duì)映異構(gòu)體富集的苯丙氨酸化合物，其使相應(yīng)的肉桂酸在存在立體選擇性苯丙氨酸解氨酶時(shí)與氨基供體反應(yīng)，所述苯丙氨酸解氨酶與SEQIDNO.4具有至少50%的序列同一性。因此，本發(fā)明的工藝提供了用于制備苯丙氨酸化合物的改進(jìn)的和/或有商業(yè)吸引力的工藝。通過(guò)使用與SEQIDNO.4具有至少50%的序列同一性的PAL，底物抑制得以降低(即隨著底物濃度的提高，酶最初活性的降低)。另外，在五.co/Z中容易地過(guò)表達(dá)了與SEQIDNO.4具有至少50%同一性的苯丙氨酸解氨酶(PAL)。與SEQIDNO.4具有至少50%同一性的PAL與來(lái)自/.g/z^>^的PAL相比的另一優(yōu)點(diǎn)是它們具有更高的活性。在使用CloneManager6(6.00版/alignPlus4,4.10版(Scientific&EducationalSoftware))的序列比對(duì)研究中，使用BLOSUM62作為評(píng)分矩陣來(lái)測(cè)定本文定義的％同一性。優(yōu)選地，在本發(fā)明的工藝中，使用的PAL與SEQIDNO.4具有至少50%，更優(yōu)選地至少53%，更優(yōu)選地至少55%，更優(yōu)選地至少57%，進(jìn)一步更優(yōu)選地至少60%，進(jìn)一步更優(yōu)選地至少62%，進(jìn)一步更優(yōu)選地至少65%，進(jìn)一步更優(yōu)選地至少70%，尤其是至少75%,更尤其是至少80%，更尤其是至少85%，更尤其是至少90%，進(jìn)一步更尤其是至少95%，進(jìn)一步更尤其是至少97%，進(jìn)一步更尤其是至少98%，進(jìn)一步更尤其是至少99%，最尤其是100%的序列同一性。本發(fā)明工藝中可使用的PAL序列可由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地鑒定，例如在數(shù)據(jù)庫(kù)(例如NCBI數(shù)據(jù)庫(kù))中使用BLAST搜索。編碼這些PAL序列的核酸序列可容易地被鑒定，例如使用可通過(guò)NCBI的BLAST獲得的程序來(lái)進(jìn)行?；蛘?，也可以按照針對(duì)期望的宿主細(xì)胞來(lái)說(shuō)優(yōu)選或優(yōu)化的密碼子選擇，例如由商業(yè)公司如GenScript或DNA2.0，從氨基酸序列開(kāi)始合成核酸序列。編碼本發(fā)明工藝中使用的PAL酶的氨基酸序列的核酸序列可以被克隆在合適的載體中，在引入合適的宿主后，可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)克隆和表達(dá)技術(shù)(例如如Sambrook，J.,Fritsh,E.F.，andManiatis,T.MolecularCloning:ALaboratoryManual.2nd，ed.,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989中所述)，來(lái)(過(guò))表達(dá)該序列，產(chǎn)生與SEQIDNO.4具有至少50%序列同一性的PAL酶。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，PAL(苯丙氨酸解氨酶)被定義為具有苯丙氨酸5解氨酶活性(即催化肉桂酸到苯丙氨酸的可逆非還原性氨基化的能力)的酶。HAL(組氨酸解氨酶)被定義為具有組氨酸解氨酶活性(即催化尿刊酸到組氨酸的可逆非還原性氨基化的能力)的酶。優(yōu)選地，在本發(fā)明的工藝中生產(chǎn)的苯丙氨酸化合物是式(l)的化合物或其鹽，其中Y表示羥基、具有1-10個(gè)碳原子的取代的或非取代的垸氧基、取代的或非取代的芳氧基、或胺基或胺殘基-NHR(其中R為包含1-10個(gè)碳原子和任選地一個(gè)或多個(gè)雜原子的垸芳基(akaryl)、垸基、芳垸基、芳基)，且其中Z代表芳基上的一個(gè)或多個(gè)取代基，其選自氫、羥基、具有1-10個(gè)碳原子的任選含有一個(gè)或多個(gè)雜原子的任選被取代的環(huán)狀或非環(huán)狀脂肪基、具有l(wèi)-10個(gè)碳原子的任選被取代的脂肪族雜環(huán)基、任選被取代的(雜)芳基、具有1-10個(gè)碳原子的任選被取代的烷氧基、鹵素原子、胺基、硝基、羧酸、羧酸酯、羧酸酰胺、腈或三氟甲基。在Z是環(huán)狀或非環(huán)狀的脂肪基、脂肪族雜環(huán)基、(雜)芳基或烷氧基的情況下，任選的取代為，在Y是烷氧基或芳氧基的情況下，任選的取代可例如選自三鹵化物，例如三氟甲基、三氯甲基；鹵素原子，例如氟化物、氯化物或碘化物；胺基，例如甲胺、二甲胺、芐胺、乙胺、丙胺、苯胺、4-氟苯胺；垸氧基或芳氧基，例如甲氧基、乙氧基、異丙氧基、芐氧基、苯氧基、4-氟苯氧基、3-氟苯氧基、2-氟苯氧基；硫醚，例如甲基硫醚、乙基硫醚、芐基硫醚；三鹵素垸基醚(trihaloalkylether)，例如三氟甲基醚；芳基或雜芳基，例如苯基、4-氟苯基、3-氟苯基、2-氟苯基、2-三氟甲基苯基、3-三氟甲基苯基、4-三氟甲基苯基、噻吩、呋喃、吡唑、吡咯(pyrole)、咪唑等等。優(yōu)選的是其中Z為氫、鹵素原子、三氟甲基、羥基、甲氧基或腈且Y為羥基的化合物。更優(yōu)選地，在本發(fā)明的工藝中生產(chǎn)的苯丙氨酸化合物是式(2)的化合物或其鹽，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>其中Y如上文針對(duì)式(l)所定義，且其中Z如上文針對(duì)式(l)所定義，且其中X代表離去基團(tuán)，例如選自氟化物、溴化物、氯化物或碘化物、甲磺酸基(mesylategroup)、間硝基苯磺酸基(nosylategroup)、甲苯磺酸基(tosylategroup)、三氟甲磺酸、硼酸、硝基等等的組的離去基團(tuán)。。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)"離去基團(tuán)"表示在制備下述化合物的工藝中適合用作離去基團(tuán)的基團(tuán)，所述化合物為對(duì)映異構(gòu)體富集的任選被取代的根據(jù)式(3)的吲哚啉-2-羧酸或其鹽，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>其中Y和Z如上文定義，其中在低于約140'C的溫度下對(duì)對(duì)映異構(gòu)體富集的手性鄰位-X-取代的根據(jù)式(2)的苯丙氨酸化合物進(jìn)行環(huán)化，形成對(duì)映異構(gòu)體富集的根據(jù)式(3)的噴哚啉-2-羧酸化合物?？纱嬖谟谑?3)中Y或Z中的任何取代基如下文定義。該環(huán)化反應(yīng)已在WO2006/069799Al中公開(kāi)，其通過(guò)參考并入本文。根據(jù)式(l)、(2)和(3)的化合物的鹽的合適例子為例如其HC1鹽、HBr鹽、銨鹽、乙酸鹽、甲磺酸鹽、苯磺酸鹽、對(duì)甲苯磺酸鹽、馬來(lái)酸鹽、酒石酸鹽、檸檬酸鹽或葡糖酸鹽。當(dāng)式(l)、(2)和(3)中的Z為含有一個(gè)或多個(gè)雜原子的具有1-10個(gè)碳原子的取代的環(huán)狀或非環(huán)狀脂肪基、具有l(wèi)-10個(gè)碳原子的取代的脂肪族雜環(huán)基、取代的(雜)芳基、具有l(wèi)-10個(gè)碳原子的取代的垸氧基時(shí)，這些雜原子通常各自獨(dú)立地選自P、N、O和S的組。當(dāng)Y含有一個(gè)或多個(gè)雜原子時(shí)，這些雜原子也通常各自獨(dú)立地選自P、N、O和S的組。優(yōu)選地，在上式(e)中，Y代表OH或OR1，其中Ri代表通常具有1-10個(gè)碳原子的烷基，優(yōu)選地為具有1-6個(gè)碳原子的烷基，最優(yōu)選地Y代表OH。優(yōu)選地，Z代表H或鹵素，例如氟化物、氯化物、溴化物或碘化物，最優(yōu)選地Z代表H。優(yōu)選地，式(2)中的X代表氟化物、溴化物、氯化物或碘，最優(yōu)選地代表氯化物或溴化物。由于其低成本和/或從環(huán)境的角度來(lái)看，氯化物是最優(yōu)選的。苯丙氨酸化合物的合適例子是例如2-溴-苯丙氨酸、2-氯苯丙氨酸、2-碘-苯丙氨酸、2-溴-苯丙氨酸甲酯、2-氯苯丙氨酸甲酯、2-碘-苯丙氨酸甲酯、2-溴苯丙氨酸乙酯、2-氯苯丙氨酸乙酯、2-碘-苯丙氨酸乙酯、2-溴苯丙氨酸芐酯、2-氯苯丙氨酸芐酯、2-碘-苯丙氨酸芐酯、2-溴苯丙氨酸酰胺、2-氯苯丙氨酸酰胺、2-碘-苯丙氨酸酰胺等等。優(yōu)選的是2-溴苯丙氨酸、2-氯苯丙氨酸、2-溴苯丙氨酸芐酯和2-氯苯丙氨酸芐酯。更優(yōu)選的是2-溴苯丙氨酸和2-氯苯丙氨酸。進(jìn)一步更優(yōu)選的是各自苯丙氨酸化合物例子的(S)-對(duì)映異構(gòu)體。最優(yōu)選的是(S)-2-氯苯丙氨酸和(S)-2-溴苯丙氨酸。本文中定義的"對(duì)映異構(gòu)體富集的"等價(jià)于術(shù)語(yǔ)"光學(xué)活性的"，并表示化合物的對(duì)映異構(gòu)體之一與另一對(duì)映異構(gòu)體相比過(guò)量存在。該過(guò)量在下文中會(huì)被稱作"對(duì)映異構(gòu)體過(guò)量"或e.e.(例如通過(guò)手性GLC或HPLC分析測(cè)定的)。對(duì)映異構(gòu)體過(guò)量e.e.等于對(duì)映異構(gòu)體數(shù)量之間的差除以對(duì)映異構(gòu)體的總量，所述商可在乘以100以后被表述為百分?jǐn)?shù)。在本發(fā)明的工藝中，苯丙氨酸化合物的光學(xué)純度優(yōu)選地為至少約50%，更優(yōu)選地至少約75%，進(jìn)一步更優(yōu)選地至少約90%，尤其是至少約95%，最尤其是至少約98%。式(1)或(2)的苯丙氨酸化合物的鹽的合適例子為例如其HC1鹽、HBr鹽、銨鹽、乙酸鹽、甲磺酸鹽、苯磺酸鹽、對(duì)甲苯磺酸鹽、馬來(lái)酸鹽、酒石酸鹽、檸檬酸鹽或葡糖酸鹽。合適的氨基供體包括例如NH3或NH4OH或B-NH2，其中B為-COR1基團(tuán)，其中W可選自具有1-10個(gè)碳原子的任選地被取代的環(huán)狀或非環(huán)狀脂肪基、具有l(wèi)-10個(gè)碳原子的任選地被取代的脂肪族雜環(huán)基、任選地被取代的(雜)芳基、具有1-10個(gè)碳原子的任選地被取代的垸氧基、任選地被取代的磺酰基等等。優(yōu)選的是NH3和NH4OH。當(dāng)然也可能使用多種氨基供體的組合。Ri上任選地存在的取代基可選自羥基、三鹵化物，例如三氟甲基、三氯甲基；鹵素原子，例如氟化物、氯化物或碘化物；胺基，例如甲胺、二甲胺、芐胺、乙胺、丙胺、苯胺、4-氟苯胺；烷氧基或芳氧基，例8如甲氧基、乙氧基、異丙氧基、芐氧基、苯氧基、4-氟苯氧基、3-氟苯氧基、2-氟苯氧基；硫醚，例如甲基硫醚、乙基硫醚、芐基硫醚；三鹵素垸基醚，例如三氟甲基醚；芳基或雜芳基，例如苯基、4-氟苯基、3-氟苯基、2-氟苯基、2-三氟甲基苯基、3-三氟甲基苯基、4-三氟甲基苯基、噻吩、呋喃、吡唑、吡咯、咪唑等等。PAL的"立體選擇性"表示PAL優(yōu)先催化化合物(2)的對(duì)映異構(gòu)體之一的形成。酶的立體選擇性可以根據(jù)E-比值表達(dá)，其為C-S.Chen,YFujimoto，G.Girdaukas,C.J.Sih.,J.Am.Chem.Soc.1982,104,7294-7299中所述的兩種對(duì)映異構(gòu)體特異性常數(shù)V,/Km的比值。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，使用下述VmaxfnKm測(cè)定PAL的E-比值，使用PAL在鄰-X-取代的苯丙氨酸化合物(=化合物(1))的非氧化性脫氨中測(cè)定所述Vm^和Km值。優(yōu)選地，PAL形成具有>80%的e.e.的產(chǎn)物，更優(yōu)選地，PAL形成具有>90%的e.e.的產(chǎn)物，進(jìn)一步更優(yōu)選地，PAL形成具有〉95%的e.e.的產(chǎn)物，最優(yōu)選地，PAL形成具有>99%的e.e.的產(chǎn)物。優(yōu)選地，PAL立體選擇性地催化苯丙氨酸化合物(S)-對(duì)映異構(gòu)體的形成，更優(yōu)選地，形成鄰-X-取代的(S)-苯丙氨酸化合物。本發(fā)明工藝中使用的PAL優(yōu)選地不受底物抑制，即優(yōu)選地不受肉桂酸或其衍生物造成的抑制。本發(fā)明的工藝不以任何方式受到與SEQIDNO.4具有至少50%的同一性的PAL使用形式的限制。PAL可例如以選自以下的方式存在粗酶溶液、純化的酶溶液、天然或通過(guò)遺傳修飾具有PAL活性的(可透過(guò)的和/或固定化的)細(xì)胞、具有這類活性的細(xì)胞裂解液、固定化的形式、化學(xué)修飾的形式或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它形式，或這些形式中兩種或更多的組合。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明白，該用途也可以由天然存在的(野生型)PAL酶的突變體來(lái)實(shí)現(xiàn)。例如，可能制造PAL-活性突變體(即對(duì)至少一種底物顯示比野生型PAL更高活性的突變體)、PAL-表達(dá)突變體(即比野生型PAL更好地表達(dá)的突變體)等等?？扇缦挛乃鰜?lái)制造野生型酶的PAL-活性突變體使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的誘變技術(shù)(隨機(jī)誘變、定點(diǎn)9誘變、定向進(jìn)化、基因改組等)修飾編碼野生型酶的DNA，從而使得該DNA編碼與野生型酶至少有一個(gè)氨基酸區(qū)別的酶，并在合適的(宿主)細(xì)胞中表達(dá)由此修飾的DNA?；蛘撸扇缦挛乃鰜?lái)制備PAL-表達(dá)突變體使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的誘變技術(shù)修飾編碼野生型PAL酶的DNA,從而如果該DNA在(宿主)細(xì)胞中被表達(dá)，則對(duì)突變的DNA而言，其PAL的表達(dá)水平比未突變的DNA更高。技術(shù)人員知道如何選擇這些PAL-表達(dá)突變體，例如通過(guò)測(cè)量針對(duì)至少三種不同底物的相對(duì)活性，并通過(guò)將活性比值與野生型酶比較來(lái)實(shí)現(xiàn)。表達(dá)突變體對(duì)所有不同的底物都具有更高的活性，而底物之間的活性比例等于野生型酶的活性比例。PAL酶的突變體關(guān)于(立體)選擇性和/或活性和/或穩(wěn)定性和/或溶劑抗性和/或pH譜和/或溫度譜和/或表達(dá)抑制和/或產(chǎn)物抑制和/或底物抑制具有改進(jìn)的特性，可基于任何這些改進(jìn)特性的單獨(dú)的或其與兩個(gè)或多個(gè)組合的存在，特異地選擇所述PAL突變體。向本發(fā)明的過(guò)程中添加還原劑，從而減少氧對(duì)PAL壽命的負(fù)作用可能是有利的。這類還原劑的例子包括硫化氫、巰基乙酸、硫代硫酸、亞硝酸、亞硫酸、上述的銨鹽和金屬鹽、二硫蘇糖醇、乙硫醇、乙二硫醇(ethylenemercaptan)、甲硫醇、2-巰基乙醇、氫、一氧化氮、鐵(II)化合物、錳(II)化合物、硫磺和鋅。優(yōu)選地，為了降低氧對(duì)PAL壽命的作用，可在缺氧條件下以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方式進(jìn)行本發(fā)明的方法，例如通過(guò)在氮?dú)夥障逻M(jìn)行本發(fā)明的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可進(jìn)行常規(guī)實(shí)驗(yàn)，以選擇最適反應(yīng)條件，所述條件尤其涉及溫度、pH、濃度和溶劑。優(yōu)選地，選擇PAL-步驟的溫度，使得所選擇的PAL活性最佳。例如，對(duì)/Aomahwafo!7n'eww、的PAL而言，優(yōu)選的反應(yīng)溫度在0到50°C，尤其是25到45"C，最尤其是27到37'C的范圍內(nèi)。優(yōu)選地，選擇PAL步驟的pH和氨基酸供體(優(yōu)選地為NH3)的濃度，使得所選擇的PAL活性和形成的苯丙氨酸化合物的穩(wěn)定性和獲得這些化合物的產(chǎn)率最佳。例如，對(duì)/^oman'"a/0^'e"Ws的PAL而言，pH優(yōu)選地處于pH8到pH14的范圍內(nèi)，尤其是pH10到12的范圍內(nèi)，更尤其是pH10.5到11.5的范圍內(nèi)。例如，對(duì)T^'omah"fl/oWm^的PAL而言，水中的氫氧化銨(NH40H)濃度優(yōu)選地選自約5至約25wt%之間，尤其是約10到15wt.%，最尤其是約12到14wt.%。本發(fā)明的工藝可例如在氨水中進(jìn)行，可向所述氨水中任選地添加共溶劑、增溶劑或添加劑，從而增強(qiáng)相應(yīng)肉桂酸化合物的溶解或增強(qiáng)PAL活性或穩(wěn)定性。共溶劑的例子包括二甲基酰胺、四氫呋喃乙腈、戊二醛、甘油、甲苯、乙醇、丙酮、醚和二甲基亞砜(DMSO)。增溶劑的例子包括TritonX100(由AldrichChemicalCompany,Inc.,Milwaukee,Wis審lj造)、Tween-80(由AldrichChemicalCompany,Inc.,Milwaukee,Wis制造)、聚乙二醇(PEG)。添加劑的例子包括谷氨酸、異亮氨酸、乙二醇和山梨糖醇。在本發(fā)明的工藝中獲得的苯丙氨酸化合物可直接在下一步驟中使用，或可先進(jìn)行純化。可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法，從本發(fā)明的工藝獲得的反應(yīng)混合物中純化苯丙氨酸化合物。例如，可將獲得的包含苯丙氨酸化合物的反應(yīng)混合物過(guò)濾或離心(以去除未溶解的顆粒，例如表達(dá)PAL的宿主細(xì)胞)。另外，可例如蒸發(fā)氨基供體，之后可優(yōu)選地通過(guò)沉淀分離苯丙氨酸化合物。使用本發(fā)明的工藝獲得的產(chǎn)率優(yōu)選地為至少30%，更優(yōu)選至少40%，進(jìn)一步更優(yōu)選至少50%，尤其優(yōu)選至少60%，更尤其優(yōu)選至少80%，最尤其是至少90%。在本發(fā)明工藝的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在存在來(lái)自Wenwze//"vw/m》cw的PAL時(shí)，通過(guò)將相應(yīng)的2-氯-取代的肉桂酸化合物在氫氧化銨的水性溶液中反應(yīng)，來(lái)制備鄰-氯-取代的(S)-苯丙氨酸化合物(式(2)，其中X代表C1且Z代表H)，所述水中的氫氧化銨濃度為約12到14wt.%，所述PAL的氨基酸序列分別在SEQIDNO.2(與SEQIDNO.4具有60%的序列同一性)、SEQIDNO.4、SEQIDNO.6(與SEQIDNO.4具有53%的序列同一性)和SEQIDNO.8(與SEQIDNO.4具有63%的序列同一性)中給出。驚人的是，盡管這四種酶在來(lái)自NCBi的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中被注解為組氨酸解氨酶，但是這四種酶都具有苯丙氨酸解氨酶活性。優(yōu)選地，在該實(shí)施方案中，溫度被選擇為25到45'C之間，pH范圍從pH10.5到11.5。本發(fā)明還涉及在存在立體選擇性苯丙氨酸解氨酶時(shí)制備本發(fā)明的對(duì)映異構(gòu)體富集的苯丙氨酸化合物的工藝，所述苯丙氨酸解氨酶與SEQIDNO.2、SEQIDN0.4、SEQIDNO.6或SEQIDNO.8具有至少80%、優(yōu)選地90%、最優(yōu)選地95%的序列同一性。如WO2006/069799Al中所公開(kāi)的，在本發(fā)明的工藝中形成的苯丙氨酸化合物可用于制備光學(xué)活性的(S)-吲哚啉-2-羧酸，其進(jìn)而是[2S-[1[R*(R*)，2a,3ab，7&13]]-1-[2-[[1-(乙氧羰基)丁基]氨基]-1-氧代丙基]八氫-1H』引哚-2-羧酸生產(chǎn)中的中間體。因此，本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明工藝的工藝，其中生產(chǎn)的苯丙氨酸化合物被進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為活性藥物成分，尤其是[2S-[1[R氣『)，2a,3ab,7ab]]-l-[2-[[H乙氧羰萄丁基廣基H-氧代丙基]八氫-lH-吲哚-2-羧酸。本發(fā)明將借助于以下的實(shí)施例闡述，但不受其限制。實(shí)施例在PAL活性的測(cè)試中使用以下克隆?？寺【幪?hào)酶/來(lái)源生物SEQIDNO氨基SEQIDNO酸序列核酸序列12124364875pUC57中的10(也見(jiàn)9比較實(shí)施例WO01/11071A2)通過(guò)PCR擴(kuò)增具有上文給定的核酸序列的基因，并使用Xi克隆方法將經(jīng)純化的PCR產(chǎn)物與載體pSE420(InvitrogenCorp.CAUSA)的iVcoI和12位點(diǎn)融合。通過(guò)使用該方法，在克隆基因后將位點(diǎn)破壞。形成的質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化至五.TOP10細(xì)胞(Invitrogen)，并通過(guò)限制性分析和瓊脂糖凝膠電泳檢查正確的插入，給出克隆上文給定的克隆編號(hào)(clonenumber)。g/w&'"^的PAL基因由GenscriptCorporation,ScotchPlains,USA根據(jù)AAo^wponWwmtorw/ozVfesATCC10788的PAL的蛋白質(zhì)序列合成，其序列在NCBI的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中在編號(hào)CAA31209下列出。針對(duì)在Eco//中的表達(dá)對(duì)合成的PAL基因的密碼子進(jìn)行最優(yōu)化。通過(guò)Genscript將合成的基因連接在pUC57的<Sm"I位點(diǎn)中，得到pUC57—PAL構(gòu)建體。將凍干的質(zhì)粒(5貼)(得自Genscript)溶于50MilliQ水中，并根據(jù)供應(yīng)商的方案使用1inl該溶液轉(zhuǎn)化五.co"DH5ce化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞(Invitrogen,Breda，荷蘭)的小份試樣。制備細(xì)胞和無(wú)細(xì)胞提取物培養(yǎng)含有PAL的Eco/z'在補(bǔ)充有羧芐青霉素(IOOAtg/ml)的各20ml2xTY培養(yǎng)基(16g/l胰蛋白胨；10g/l酵母提取物，7g/lNaCl)中接種含有相應(yīng)質(zhì)粒的五.co仏并在28"C孵育過(guò)夜。使用這些培養(yǎng)物接種更大體積的培養(yǎng)基(250pd預(yù)培養(yǎng)物用于250ml培養(yǎng)基)。將細(xì)胞在37。C培養(yǎng)直至OD達(dá)到~1。用IPTG(0-5mM終濃度)誘導(dǎo)幼ew朋e〃aowe^e朋^(克隆編號(hào)1)、T^omanTw/oz7n'e服、(克隆編號(hào)2)、i^rakzcte"wcc/wogewas(克隆編號(hào)3)、m"'ovw/m》cw(克隆編號(hào)4)的PAL克隆。用IPTG(lmM終濃度)誘導(dǎo)i/w^ton//ag/^m、的PAL克隆。孵育后將培養(yǎng)物在28'C下振動(dòng)過(guò)夜。通過(guò)離心(4'C下8000RPM)收獲細(xì)胞(2g/250ml培養(yǎng)基)，并將其重懸于pH8.8的0.1MTris/HCl緩沖液中(lml緩沖液/0.5g細(xì)胞)。將細(xì)胞懸浮液分為0.2ml的小份試樣，并離心。棄去上清液，將細(xì)胞沉淀物(每份約0.1克)儲(chǔ)存于-2(TC。蛋白質(zhì)測(cè)定，SDSPage，CFE的制備將O.lg細(xì)胞重懸于pH8.8的1ml0.1MTris/HC1緩沖液中，并通過(guò)超聲處理破碎細(xì)胞。對(duì)一部分經(jīng)超聲的細(xì)胞進(jìn)行離心，并傾析出無(wú)細(xì)胞的提取物(CFE)。通過(guò)Bradford所述的方法來(lái)測(cè)定不同級(jí)分中的蛋白質(zhì)濃度。為了測(cè)定表達(dá)水平，將25嗎無(wú)細(xì)胞提取物和總細(xì)胞提取物的蛋白質(zhì)應(yīng)用到NuPAGE凝膠上。菌株編號(hào)表達(dá)1++2+++++++4+++5++++++>50%的總蛋白質(zhì)；+++=30-50%的總蛋白質(zhì);++=10-30%的總蛋白質(zhì)。該分析顯示PAL基因在五.中良好表達(dá)。未形成包涵體?？寺?(_Mow"n'"fl/。,/n'e,.力顯不在co/z'中的最高表達(dá)水平。dH9.25下的初始活性通過(guò)在30。C下用硫酸將10wt。/。氨溶液調(diào)節(jié)至pH9.25制備反應(yīng)溶液。在氨溶液中制備10mM反式-2-溴-肉桂酸溶液。將4.8ml底物溶液加熱至30°C。將100mg細(xì)胞沉淀物懸浮于100ml相應(yīng)的氨溶液中，并添加至反應(yīng)混合物中。反應(yīng)即時(shí)進(jìn)行。通過(guò)HPLC分析測(cè)定形成的(L)-2-溴-苯丙氨酸。在反應(yīng)的最初30-60分鐘中，測(cè)量相對(duì)初始活性(與含有i.g/""m、PAL的五.co//細(xì)胞的活性比較)。PAL克隆相對(duì)初始活性(％)4.5*.owe跡服S1090012././oZ/n.e脂、143001140018.F!w/mycws840019.尺g/w"m、10014表l:與兄g/i/"7^的PAL相比，個(gè)體PAL克隆的相對(duì)初始活性。如表1中所示，在測(cè)試的條件下，較之從兄g/""V^克隆的基因，從S.owezV/e腦'5、/./oz力/ms^、i7.犯c"'wogew&s1禾口Kvw/myct^克隆的基因的活性均要高得多。測(cè)定底物抑制對(duì)pHll下的反應(yīng)將4.8ml100mM、50mM、20mM和lOmM反式-2-溴-肉桂酸在13wt。/。氨水中的溶液(在3(TC下用硫酸調(diào)節(jié)至pH11)加熱至30°C。對(duì)pH9.25下的反應(yīng)將固體反式-2-溴-肉桂酸懸浮于4.8ml8wt。/。氨水(在30。C下用硫酸調(diào)節(jié)至pH9.25)中，得到50mM、20mM和10mM的終濃度。將反應(yīng)混合物加熱至3CTC。為了起始反應(yīng)，添加100mg細(xì)胞沉淀物在100ml相應(yīng)氨溶液中的懸浮液。反應(yīng)即時(shí)進(jìn)行。通過(guò)HPLC分析測(cè)定形成的(L)-2-溴-苯丙氨酸。不同底物濃度下13%NH3pHll中的初始活性(相對(duì)于尺g/t/"""的PAL克隆而言)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>不同濃度下8%NH3pH9.27中的初始活性(相對(duì)于兄g/w^m、的PAL克隆而言)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>*nd:由于在這些條件下活性非常低，所以未檢測(cè)到活性。注意在高于20mM的濃度下，與8%氨水pH9.27的反應(yīng)是漿體(slurry)。從上述結(jié)果可以看出，所有的PAL都顯示比兄g/w"m、PAL更少的底物抑制。從/./w7n'ew^s克隆的PAL顯示對(duì)高底物濃度的異常耐受，甚至在底物溶解度高的高pH值下也是如此。權(quán)利要求1.制備對(duì)映異構(gòu)體富集的苯丙氨酸化合物的工藝，所述工藝通過(guò)用相應(yīng)的肉桂酸在存在立體選擇性苯丙氨酸解氨酶時(shí)與氨基供體反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述苯丙氨酸解氨酶與SEQIDNO.4具有至少50％的序列同一性。2.根據(jù)權(quán)利要求1的工藝，其中所述苯丙氨酸化合物是式(l)的化合物或其鹽，其中Y表示羥基、具有1-10個(gè)碳原子的取代的或非取代的垸氧基、取代的或非取代的芳氧基、或胺殘基，并且其中，Z代表芳基上的一個(gè)或多個(gè)取代基，其選自氫、羥基、具有l(wèi)-10個(gè)碳原子的任選地被取代的環(huán)狀或非環(huán)狀脂肪基、具有l(wèi)-10個(gè)碳原子的任選地被取代的脂肪族雜環(huán)基、任選地被取代的(雜)芳基、具有1-10個(gè)碳原子的任選地被取代的烷氧基、鹵素原子、胺基、硝基、羧酸、羧酸酯、羧酸酰胺、腈或三氟甲基。3.根據(jù)權(quán)利要求1的工藝，其中所述苯丙氨酸化合物是式(2)的化合物或其鹽，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>(2)其中Z代表芳基上的一個(gè)或多個(gè)取代基，其選自氫、羥基、具有1-10個(gè)碳原子的任選地被取代的環(huán)狀或非環(huán)狀脂肪基、具有l(wèi)-10個(gè)碳原子的任選地被取代的脂肪族雜環(huán)基、任選地被取代的(雜)芳基、具有i-io個(gè)碳原子的任選地被取代的烷氧基、鹵素原子、胺基、硝基、羧酸、羧酸酯、羧酸酰胺、腈或三氟甲基，且其中Y代表羥基、具有1-10個(gè)碳原子的取代的或非取代的垸氧基、取代的或非取代的芳氧基、或胺殘基，且其中X代表離去基團(tuán)，例如選自鹵素、甲磺酸、間硝基苯磺酸、甲苯磺酸、三氟甲磺酸、硼酸、硝基等等。4.根據(jù)權(quán)利要求3的工藝，其中X代表氯化物或溴化物，Y代表羥基，Z代表氫。5.根據(jù)權(quán)利要求4的工藝，其中式(l)的化合物是(S)-2-氯苯丙氨酸或(S)-2-溴苯丙氨酸。6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的工藝，其中所述氨基供體是NH3或NH4OH。7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的工藝，其中所述立體選擇性苯丙氨酸氨裂解酶具有如SEQIDNO.2、SEQIDNO.4、SEQIDNO.6或SEQIDN0.8所示的氨基酸序列。8.根據(jù)權(quán)利要求3-7中任一項(xiàng)的工藝，其還包括下述步驟在低于約14(TC的溫度下對(duì)對(duì)映異構(gòu)體富集的手性鄰位-X-取代的根據(jù)式(2)的苯丙氨酸化合物或其鹽進(jìn)行環(huán)化，其中Y和Z如上文定義且X為離去基團(tuán)，從而形成對(duì)映異構(gòu)體富集的根據(jù)式(3)的吲哚啉-2-羧酸化合物。9.用于生產(chǎn)活性藥物成分的工藝，所述工藝包括權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的工藝。全文摘要本發(fā)明涉及制備對(duì)映異構(gòu)體富集的苯丙氨酸化合物的工藝，所述工藝通過(guò)在存在立體選擇性苯丙氨酸解氨酶時(shí)用相應(yīng)的肉桂酸與氨基供體反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述苯丙氨酸解氨酶與SEQIDNo.4(來(lái)自Idiomarinaloihiensis的PAL的氨基酸序列)具有至少50％的序列同一性。文檔編號(hào)C12P13/22GK101517089SQ200780033815公開(kāi)日2009年8月26日申請(qǐng)日期2007年9月12日優(yōu)先權(quán)日2006年9月12日發(fā)明者弗里斯科·伯納德·簡(jiǎn)·范阿斯瑪,納特斯卡·斯里尼吉申請(qǐng)人:帝斯曼知識(shí)產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司