專利名稱：一種表達(dá)苯丙氨酸解氨酶的乳酸乳球菌制品的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般的涉及乳酸乳球菌制品的制 備方法，特別的涉及表達(dá)苯丙氨酸解氨酶的乳酸乳球菌制品的制備方法。
背景技術(shù)：
苯丙氨酸(Phenylalanine，Phe)是人體必需的一種氨基酸，正常人從飲食中攝入及體內(nèi)再循環(huán)的苯丙氨酸，除少部分被直接利用外，大部分在肝臟的苯丙氨酸羥化酶 (Phenylalanine hydroxylase,PAH)的作用下轉(zhuǎn)化成為酪氨酸后被利用。患有常染色體隱性遺傳病——苯丙酮尿癥(Phenylketonuria，PKU)的患者，由于苯丙氨酸羥化酶基因缺陷， 導(dǎo)致肝臟的PAH酶活性降低或缺失，無法將苯丙氨酸轉(zhuǎn)化成為酪氨酸，致使苯丙氨酸通過其他途徑轉(zhuǎn)化為苯丙酮酸、苯乙酸、苯乳酸等。這些非正常代謝產(chǎn)物在血、腦脊液和其他組織中大量積累，對(duì)各種組織特別是腦組織造成不可逆損傷。PKU患者的主要臨床表現(xiàn)是智力低下，癲癇發(fā)作和黑色素減少。目前國(guó)際上通用的治療PKU方法是低苯丙氨酸飲食控制療法。該方法需從患者一出生起即給予低苯丙氨酸含量的特制的或人工合成的奶粉或食物，同時(shí)嚴(yán)格限制正常食物的攝入，并且根據(jù)各生長(zhǎng)發(fā)育階段和個(gè)體的差異隨時(shí)調(diào)整飲食控制量，直至智力發(fā)育基本成熟的年齡，即17-18歲。由于苯丙氨酸在日常飲食中普遍、大量存在，飲食控制難度極大且控制過程容易造成患兒其它必需氨基酸的攝入不足，從而引起患兒體質(zhì)下降、生長(zhǎng)發(fā)育遲滯等副作用。而特制的人工合成的低苯丙氨酸食品品種少、口感差、價(jià)格昂貴，實(shí)際應(yīng)用中更使患者由于常年無法食用正常飲食而極其痛苦，因此少有患者能堅(jiān)持此種飲食從而控制苯丙氨酸攝入量達(dá)十幾年者，因此極大地影響了治療效果。國(guó)際上于上世紀(jì)80年代初開始研究酶法治療PKU，主要是采用逆轉(zhuǎn)錄病毒和重組腺病毒載體介導(dǎo)的方法，來實(shí)現(xiàn)PAH 在PKU模型小鼠的肝細(xì)胞中的表達(dá)。但這一方法的主要問題是轉(zhuǎn)移效率低，轉(zhuǎn)移物免疫原性強(qiáng)，外源基因在細(xì)胞中只能短期表達(dá)，同時(shí)存在安全性隱患，因此至今未見用于臨床的報(bào)道。苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia-lyase，PAL)廣泛存在于各種綠色植物和少數(shù)微生物中，它可以催化苯丙氨酸脫氨生成肉桂酸，因此有希望口服該酶治療PKU。由于植物和酵母等生產(chǎn)的天然PAL量極少，提取成本很高，因此通過基因工程方法獲取大量 PAL成為研究的重點(diǎn)。《中國(guó)病理生理雜志》2000年16卷第1期第12頁(yè)公開了一種水稻PAL基因在大腸桿菌BL21DE3中的表達(dá)方法，PAL主要以包涵體形式存在，誘導(dǎo)7小時(shí)后其表達(dá)量達(dá)到峰值，占菌體總蛋白量的35. 43%。但該菌超聲破碎后提取的粗酶比活力很低，僅為0. 46U/g， 原因是PAL在生物體外極不穩(wěn)定。利用該文獻(xiàn)報(bào)道的方法，一方面無法提取得到體外穩(wěn)定存在的PAL純品，另一方面表達(dá)PAL所用的大腸桿菌為人體致病菌，不能直接口服應(yīng)用，因此利用該方法表達(dá)的PAL無法在臨床治療PKU中使用。中國(guó)專利02117216. 1公開了一種治療PKU的藥物的制備及使用方法，該方法將PAL基因轉(zhuǎn)入腸道正常菌中，通過口服該菌，利用其表達(dá)的PAL酶在消化道內(nèi)將苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為肉桂酸，從而降低食物來源中的苯丙氨酸進(jìn)入血液的量，以達(dá)到治療PKU的同時(shí)保持較正常飲食的目的。《生物工程學(xué)報(bào)》2002年18卷第6期第713頁(yè)公布了利用上述專利方法在乳酸乳球菌(L. lactis)NICE系統(tǒng)中表達(dá)歐芹PAL的方法，其使用翻譯融合型載體ρ (NZ8048-PAL)工和轉(zhuǎn)錄融合型載體P (NZ8048-PAL) 2在乳酸乳球菌中表達(dá)歐芹PAL，表達(dá)量分別占總蛋白的 5. 16%和2. 76%。該方法的明顯缺陷在于乳酸乳球菌的發(fā)酵量和乳酸乳球菌中表達(dá)產(chǎn)物的含量均很低，造成最終發(fā)酵獲得的PAL總水平低，因此成本極高，限制了其實(shí)際臨床應(yīng)用。 本申請(qǐng)人在之前的中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)200810098008. 0中公開了一種治療PAL的乳酸乳球菌制品的制備方法。該方法在生物工程學(xué)報(bào)公開方法的基礎(chǔ)上進(jìn)一步對(duì)乳酸乳球菌的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，在選擇表達(dá)PAL的乳酸乳球菌發(fā)酵培養(yǎng)的ρΗ值時(shí)兼顧菌體生長(zhǎng)需要和培養(yǎng)表達(dá)產(chǎn)物PAL的穩(wěn)定性和酶活力的需要，選擇了本領(lǐng)域技術(shù)人員在培養(yǎng)乳酸乳球菌時(shí)一般不會(huì)采用的6. 5-7. 5的偏離正常培養(yǎng)條件的ρΗ值。采用這樣的發(fā)酵培養(yǎng)ρΗ值使在采用常規(guī)Μ17培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)菌體密度提高了 33倍，PAL比活力提高了 2. 74倍，兩者的乘積也即發(fā)酵獲得PAL的總活性提高了 90. 32倍；而在采用優(yōu)化的培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)菌體密度提高了 39. 8倍，PAL比活力提高了 1. 95倍，兩者的乘積也即發(fā)酵獲得PAL的總活性提高了 77. 79 倍。但是上述優(yōu)化ρΗ培養(yǎng)表達(dá)PAL的乳酸乳球菌的方法還有進(jìn)一步改進(jìn)的余地，以進(jìn)一步提高乳酸乳球菌的發(fā)酵量和乳酸乳球菌中表達(dá)產(chǎn)物的含量，從而進(jìn)一步降低患者臨床使用的成本，有利于該活性乳酸乳球菌制品的推廣應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種表達(dá)PAL的活性乳酸乳球菌制品的高效低成本的制備方法。在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上可進(jìn)一步提高乳酸乳球菌的發(fā)酵量和乳酸乳球菌中表達(dá)產(chǎn)物的含量，從而進(jìn)一步降低患者臨床使用該活性乳酸乳球菌制品的成本，有利于該活性乳酸乳球菌制品的推廣應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下1)獲得表達(dá)PAL的基因；2)構(gòu)建重組表達(dá)載體將表達(dá)PAL的基因與適于轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌的表達(dá)載體相連接形成重組表達(dá)載體；3)構(gòu)建工程菌將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)的乳酸乳球菌；4)篩選獲得高效表達(dá)PAL的乳酸乳球菌菌株；5)發(fā)酵乳酸乳球菌并誘導(dǎo)表達(dá)PAL ；6)干燥發(fā)酵收獲的菌體，其中在5)的發(fā)酵的誘導(dǎo)前調(diào)節(jié)發(fā)酵液的ρΗ為6. 0-6. 5進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)后將ρΗ調(diào)節(jié)到6. 5-7. 5繼續(xù)培養(yǎng)直至發(fā)酵結(jié)束。在上述技術(shù)方案的獲得表達(dá)PAL的基因過程中，可以人工合成編碼PAL的基因，也可以從其它表達(dá)PAL的動(dòng)植物或微生物中提取總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到編碼PAL的cDNA。其中在人工合成編碼PAL的基因時(shí)優(yōu)選用乳酸乳球菌翻譯偏愛密碼子合成編碼PAL的基因，在提取反轉(zhuǎn)錄得到編碼PAL的cDNA時(shí)優(yōu)選從植物或紅酵母中提取總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到編碼 PAL的cDNA，并更優(yōu)選從歐芹中提取總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到編碼PAL的cDNA。在上述技術(shù)方案的構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，所述的適于轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌的表達(dá)載體包括但不局限于pET23b、pMG36e、pNZ8048、pNZ8149等。連接可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法，選擇相同的限制性內(nèi)切酶對(duì)上述表達(dá)載體與儲(chǔ)存表達(dá)PAL基因的載體分別進(jìn)行酶切后將分別得到的酶切表達(dá)載體與表達(dá)PAL的基因在T4DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接。

在上述技術(shù)方案的構(gòu)建工程菌時(shí)，應(yīng)首先制備感受態(tài)的乳酸乳球菌，優(yōu)選用電穿孔法制備感受態(tài)乳酸乳球菌，具體方法可參見文獻(xiàn)的報(bào)道。之后用將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入感受態(tài)乳酸乳球菌。在上述技術(shù)方案的篩選獲得高效表達(dá)PAL的乳酸乳球菌菌株時(shí)，可選擇本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的菌落PCR鑒定法、酶切圖譜法或PAL酶活性檢測(cè)法。其中菌落PCR鑒定法的原理是特異性PCR引物分別位于插入PAL基因的兩端，直接將少量菌體加入到PCR反應(yīng)液中，可判斷是否有PAL基因的插入。酶切圖譜法的原理是根據(jù)質(zhì)粒酶切電泳圖譜上條帶的數(shù)目和位置判斷有無插入片段及其大小。PAL酶活性檢測(cè)法的原理是將適量菌液、苯丙氨酸與高氯酸混合反應(yīng)過夜，過濾離心后進(jìn)行高效液相色譜(HPLC)分析，根據(jù)有無特異性的 PAL催化產(chǎn)物肉桂酸可判斷重組工程菌有無PAL表達(dá)活性。在上述技術(shù)方案的發(fā)酵乳酸乳球菌并誘導(dǎo)表達(dá)PAL時(shí)，改變pH進(jìn)行培養(yǎng)是出于兼顧乳酸乳球菌生長(zhǎng)與PAL活性保留的考慮。乳酸乳球菌最適生長(zhǎng)pH值為6. 0-6. 5，PAL酶最適保存PH值為7. 5-9. 5，考慮到發(fā)酵培養(yǎng)初期，也即發(fā)酵的前1/3時(shí)段PAL還沒有表達(dá)， 在此階段只要考慮乳酸乳球菌的生長(zhǎng)，因此在此階段用乳酸乳球菌最適生長(zhǎng)的6. 0-6. 5的 PH進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；之后隨著PAL產(chǎn)物的不斷表達(dá)，為了兼顧表達(dá)獲得的PAL酶的活性，需要將發(fā)酵培養(yǎng)的PH調(diào)整到6. 5-7. 5之間。上述發(fā)酵過程可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)使用的M17培養(yǎng)基，如M17肉湯 (M17Broth)培養(yǎng)基，按微生物學(xué)相關(guān)教科書上給出的配制方法配制，也可從商業(yè)途徑獲得，例如從BD公司購(gòu)買；還可以使用本申請(qǐng)人之前的申請(qǐng)200810098008. 0中優(yōu)化的培養(yǎng)基，該優(yōu)化培養(yǎng)基IL中含有蛋白胨5-30g，酵母提取物2. 5-15g，乳糖或葡萄糖5_30g， MgSO4. 7H20 0. 2-0. 5g, MnSO4. H2OO. 05-0. lg, NaAc. 3H20 3. 3g, KH2P042g, Tween-800. 5_5ml， PH值6. 5-7. 5。其它主要發(fā)酵條件方面，發(fā)酵溫度應(yīng)維持在25-40°C，發(fā)酵時(shí)間控制在6_30 小時(shí)。為減少外源基因PAL過早表達(dá)對(duì)乳酸乳球菌生長(zhǎng)的不利影響，優(yōu)選當(dāng)發(fā)酵液光密度OD值達(dá)到0. 3-0. 6時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)劑優(yōu)選乳鏈菌素(Nisin)，誘導(dǎo)劑優(yōu)選終濃度為 3. 75_50ng/mlo在上述技術(shù)方案的干燥發(fā)酵收獲的菌體時(shí)，為保持乳酸乳球菌的活菌率并同時(shí)有利于PAL酶活的保存，優(yōu)選將收獲的菌體高速離心脫水并用適當(dāng)?shù)木彌_液洗滌后再進(jìn)行烘干處理。所述的適當(dāng)?shù)木彌_液優(yōu)選PH值為7. 5-8. 8的緩沖液，并更優(yōu)選磷酸鹽或硼酸鹽緩沖液；為在保證洗滌效果的基礎(chǔ)上減少洗滌所造成的收獲菌體的損失，所述的洗滌次數(shù)優(yōu)選2-3次；所述的干燥溫度優(yōu)選25-60°C，時(shí)間優(yōu)選6-72小時(shí)。通過實(shí)施上述的技術(shù)方案可使獲得的乳酸乳球菌活菌數(shù)和其中PAL的比活力大幅提高，其中前者可達(dá)到1012CFU/ml以上，后者可達(dá)到80U/g以上。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 利用乳酸乳球菌偏愛密碼子人合成PAL基因構(gòu)建表達(dá)PAL的乳酸乳球菌工程菌人工合成文獻(xiàn)“人工合成苯丙氨酸脫氨酶基因在乳酸乳球菌中的食品級(jí)表達(dá)”(賈興元，陳星，蘇暢等，中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志2006年1月第26卷第1期23-26頁(yè))中

圖1所示的采用乳酸乳球菌偏愛密 碼子的PAL基因序列，標(biāo)記為PALart,連接到T載體后DNA 測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。該P(yáng)ALart在5，端和3，端分別有XbaI和NcoI酶切位點(diǎn)。NcoI和XbaI雙酶切含PALart片段的T載體后得到完整的PALart基因片段，然后在T4DNA連接酶的作用下與由NcoI和XbaI雙酶切pNZ8149所得的線性質(zhì)粒連接。連接體用電穿孔法轉(zhuǎn)化感受態(tài)乳酸乳球菌NZ3900，具體條件為在EquiBio Easyject細(xì)胞打孔儀上進(jìn)行，參數(shù)設(shè)定為2. 5kv，25 μ F，400 Ω。其中ρΝΖ8149與ΝΖ3900均購(gòu)自荷蘭NIZO food research。 實(shí)施例2 =PALart重組表達(dá)質(zhì)粒的篩選和鑒定分別采用酶切圖譜法和PAL酶活性檢測(cè)法進(jìn)行篩選和鑒定。酶切圖譜法采用NcoI和XbaI雙酶切，電泳結(jié)果顯示重組質(zhì)粒被切成2. 8kb和 1. 9kb的兩條帶，而質(zhì)粒pNZ8149則被切為約1. 9kb和650bp的兩條帶，與預(yù)期的條帶數(shù)目和大小位置相符，可確定重組質(zhì)粒有2. 2kb的PALart片段插入。PAL酶活性檢測(cè)法取400μ 1菌液加等量5%高氯酸與lOmmol/L苯丙氨酸， 0. lmol/L硼酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH為8. 8，30°C反應(yīng)1小時(shí)，12000rpm離心后取上清用0. 22 μ m 針頭濾膜過濾，HPLC自動(dòng)進(jìn)樣20μ 1進(jìn)行分析。流動(dòng)相為含體積濃度為0. 的乙酸的甲醇/水(50/50)溶液，流速為1. Oml/min,分離柱為4. 6mmX 25cm的C18反相柱，檢測(cè)波長(zhǎng)為 290nm。同樣色譜條件下上肉桂酸標(biāo)準(zhǔn)品，記錄肉桂酸的保留時(shí)間。兩次HPLC保留時(shí)間比對(duì)結(jié)果顯示特異性的PAL催化反應(yīng)產(chǎn)物肉桂酸的峰，表明該重組質(zhì)粒有PALart表達(dá)活性。實(shí)施例3 利用歐芹PAL基因構(gòu)建表達(dá)PAL的乳酸乳球菌工程菌從受機(jī)械損傷的歐芹莖葉中用常規(guī)方法提取總RNA，用RT-PCR技術(shù)制備PAL的 cDNA，其中所用的特異性引物為上游引物T1 5 ‘ -TACGATATCAGGAACTTGGTAACAAT-3 ‘，下游引物T2 5 ‘ -CTAAGATCTCATGCATFTCAGTTAACA-3 ‘。用EcoRV和BglII酶切得到的cDNA片段，得到具有粘性末端的PAL cDNA片段。然后用EcoRV和BglII酶切表達(dá)載體pNZ8149，并將酶切得到片段在T4DNA連接酶的作用下與PAL cDNA片段連接得到重組質(zhì)粒pNZ8149-PAL。參照實(shí)施例1的電轉(zhuǎn)化條件將重組質(zhì)粒 PNZ8149-PAL轉(zhuǎn)化到感受態(tài)乳酸乳球菌NZ3900中。pNZ8149_PAL重組表達(dá)質(zhì)粒的篩選和鑒定方法同實(shí)施例2。實(shí)施例4 表達(dá)PAL的基因工程乳酸乳球菌發(fā)酵培養(yǎng)分別配制M17肉湯培養(yǎng)基與表達(dá)PAL的乳酸乳球菌的優(yōu)選培養(yǎng)基，其中后者的配制方法為蛋白胨5g，酵母提取物2. 5g，乳糖5g，MgSO4. 7H20 0. 25g，MnSO4. H2O 0. 05g, NaAc. 3H20 3. 3g, KH2P042g, Tween-800. 5ml，加水至 1000ml 并調(diào)節(jié) pH 值為 7. O。將實(shí)施例1獲得的表達(dá)PAL的乳酸乳球菌菌種按常規(guī)方法進(jìn)行活化后按1 50比例接種上述配制的M17肉湯培養(yǎng)基或優(yōu)選培養(yǎng)基，于30°C進(jìn)行半?yún)捬醢l(fā)酵培養(yǎng)(靜置不攪拌但也不封發(fā)酵容器口)，發(fā)酵時(shí)間為18小時(shí)。當(dāng)發(fā)酵液光密度OD值達(dá)到0. 4時(shí)用乳鏈菌素進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)劑終濃度為7. 5ng/ml。發(fā)酵培養(yǎng)過程中分別采用固定pH與改變pH的培養(yǎng)方法，具體方案如表1所示。發(fā)酵結(jié)束后將發(fā)酵液經(jīng)高速離心(SOOOrpm/分，離心20分鐘)脫水并用pH8. 0的 0. lmol/L磷酸鹽緩沖液洗滌3次，收集菌體，60°C烘干，4°C密封避光保存。實(shí)施例5 干燥菌 體中PAL酶比活力與菌體存活情況檢測(cè)1)干燥菌體中PAL酶活力的檢測(cè)取400 μ 1菌液加等量5 %高氯酸與lOmmol/L苯丙氨酸，0. lmol/L硼酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)PH為8. 8，30°C反應(yīng)1小時(shí)，12000rpm離心后取上清用0. 22 μ m針頭濾膜過濾，HPLC 自動(dòng)進(jìn)樣20μ1進(jìn)行分析。流動(dòng)相為含體積濃度為0.1%的乙酸的甲醇/水(50/50)溶液，流速為1. 0ml/min,分離柱為4. 6mmX 25cm的C18反相柱，檢測(cè)波長(zhǎng)為290nm。同樣色譜條件下上不同濃度的肉桂酸標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)分別測(cè)定得到的峰面積對(duì)肉桂酸濃度繪制工作曲線，將菌液酶解苯丙氨酸樣品測(cè)定得到的肉桂酸峰的峰面積值代入工作曲線計(jì)算可得到樣品中肉桂酸的含量。根據(jù)國(guó)際酶學(xué)生化學(xué)會(huì)委員會(huì)規(guī)定1個(gè)酶活力(U)，是指在特定條件下，1分鐘內(nèi)能將1 μ mol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量，或是轉(zhuǎn)化底物中1 μ mol的有關(guān)基團(tuán)的酶量；酶的比活力可用活力單位/毫克蛋白(U/mg)表示，也可用單位/克(U/g)或單位/ml(U/ml)制劑表示。由上述肉桂酸含量測(cè)定結(jié)果與國(guó)際酶學(xué)生化學(xué)會(huì)委員會(huì)的規(guī)定可得到干燥菌體中PAL比酶活力。2)干燥菌體存活情況檢測(cè)將干燥處理后的菌體在瓊脂肉湯M17固體培養(yǎng)基(LM17)中劃線，30°C恒溫培養(yǎng)72 小時(shí)后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。實(shí)施例6 改變或不改變pH發(fā)酵培養(yǎng)的方法及結(jié)果改變或不改變pH發(fā)酵培養(yǎng)的方法及結(jié)果如下表1和表2所示，其他發(fā)酵培養(yǎng)條件如實(shí)施例4。表1不同改變pH發(fā)酵培養(yǎng)的方法及結(jié)果(實(shí)施例4優(yōu)選培養(yǎng)基)I發(fā)酵PH調(diào)節(jié)方案I 發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵收獲菌體密度發(fā)酵收獲PAL比
權(quán)利要求
1.一種表達(dá)苯丙氨酸解氨酶的乳酸乳球菌制品的制備方法，按順序包括如下步驟1)獲得表達(dá)苯丙氨酸解氨酶的基因；2)構(gòu)建重組表達(dá)載體將表達(dá)苯丙氨酸解氨酶的基因與適于轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌的表達(dá)載體相連接形成重組表達(dá)載體；3)構(gòu)建工程菌將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)的乳酸乳球菌；4)篩選獲得高效表達(dá)苯丙氨酸解氨酶的乳酸乳球菌菌株；5)發(fā)酵乳酸乳球菌并誘導(dǎo)表達(dá)苯丙氨酸解氨酶；6)干燥發(fā)酵收獲的菌體，其特征是在5)的發(fā)酵的誘導(dǎo)前調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH為6. 0-6. 5進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)后將pH調(diào)節(jié)到6. 5-7. 5繼續(xù)培養(yǎng)直至發(fā)酵結(jié)束。
2.如權(quán)利要求1的制備方法，其特征是利用乳酸乳球菌偏愛密碼子人合成所述的表達(dá)苯丙氨酸解氨酶的基因。
3.如權(quán)利要求1的制備方法，其特征是所述表達(dá)苯丙氨酸解氨酶的基因提取自歐芹。
4.如權(quán)利要求1的制備方法，其特征是所述的適于轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌的表達(dá)載體是 PNZ8149。
5.如權(quán)利要求1的制備方法，其特征是所述的感受態(tài)的乳酸乳球菌是NZ3900。
6.如權(quán)利要求1的制備方法，其特征是發(fā)酵選用的培養(yǎng)基每IL中含有蛋白胨5-30g， 酵母提取物 2. 5-15g，乳糖或葡萄糖 5-30 g, MgSO4. 7H20 0. 2-0. 5g，MnSO4. H2O 0. 05-0. lg， NaAc. 3H20 3. 3g, KH2PO4 2g, Tween-80 0. 5_5ml，pH 值 6. 5-7. 5。
7.如權(quán)利要求1的制備方法，其特征是當(dāng)發(fā)酵液光密度OD值達(dá)到0.3-0. 6時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)劑為乳鏈菌素，終濃度為3. 75-50ng/mL·
8.如權(quán)利要求1的制備方法，其特征是所述發(fā)酵溫度為25-30°C，發(fā)酵時(shí)間為6-30小時(shí)。
9.如權(quán)利要求1的制備方法，其特征是在所述干燥發(fā)酵收獲的菌體前采用高速離心脫水收集菌體并用PH在7. 5-8. 8之間的緩沖液洗滌2-3次收集菌體。
10.如權(quán)利要求1的制備方法，其特征是所述干燥發(fā)酵收獲的菌體采用25-60°C的干燥溫度與6-72小時(shí)的干燥時(shí)間。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及表達(dá)苯丙氨酸解氨酶的乳酸乳球菌制品的制備方法，按順序包括如下步驟1)獲得表達(dá)苯丙氨酸解氨酶的基因；2)將表達(dá)苯丙氨酸解氨酶的基因與適于轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌的表達(dá)載體相連接形成重組表達(dá)載體；3)將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)的乳酸乳球菌；4)篩選獲得高效表達(dá)苯丙氨酸解氨酶的乳酸乳球菌菌株；5)發(fā)酵乳酸乳球菌并誘導(dǎo)表達(dá)苯丙氨酸解氨酶；6)干燥發(fā)酵收獲的菌體，其中在步驟5)的發(fā)酵的誘導(dǎo)前調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH為6.0-6.5進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)后將pH調(diào)節(jié)到6.5-7.5繼續(xù)培養(yǎng)直至發(fā)酵結(jié)束。采用本發(fā)明的技術(shù)方案可使獲得的乳酸乳球菌活菌數(shù)和其中苯丙氨酸解氨酶的比活力大幅提高，其中前者可達(dá)到1012CFU/ml以上，后者可達(dá)到80U/g以上。
文檔編號(hào)C12N15/74GK102358889SQ20111033960
公開日2012年2月22日 申請(qǐng)日期2011年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月1日
發(fā)明者劉金毅, 周敏毅, 牛春, 程永慶 申請(qǐng)人:北京三元基因工程有限公司, 北京畢艾歐科技發(fā)展有限責(zé)任公司