專利名稱：一種用于檢測(cè)鮑肌肉萎縮癥病毒的引物組、快速診斷試劑盒及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)鮑肌肉萎縮癥病毒的引物組，本發(fā)明還涉及了用于檢測(cè)鮑肌肉萎縮癥病毒的快速診斷試劑盒以及鮑肌肉萎縮癥病毒的檢測(cè)方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
鮑是中國(guó)傳統(tǒng)的名貴食材，其肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，是世界各地廣泛的養(yǎng)殖的海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)貝類。1999至2005年期間，福建、廣東等地鮑養(yǎng)殖場(chǎng)普遍爆發(fā)大規(guī)模病害，癥狀主要表現(xiàn)為肌肉和外套膜萎縮，體色發(fā)黑，各階段鮑均可發(fā)病，對(duì)我國(guó)南方鮑養(yǎng)殖業(yè)造成毀滅性打擊。后經(jīng)鑒定該病病原為鮑肌肉萎縮癥病毒(Abalone Shriveling syndrome associated Virus, AbSV) ο到目前為止，對(duì)于鮑肌肉萎縮癥病毒病還沒有有效的治療方法，防止病毒的傳染和流行是能夠采取的主要措施，早期快速診斷該病毒是減少損失的有效途徑，因此，簡(jiǎn)便快速、特異性好、靈敏度高的診斷試劑盒及其檢測(cè)方法對(duì)于疾病的預(yù)防意義非常重大。目前，常用的檢測(cè)技術(shù)是以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)為代表的病原核酸檢測(cè)技術(shù)，但是這些檢測(cè)技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中存在一些問題，如普通聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)需要專門的儀器，而且存在容易交叉污染和操作過程煩瑣的缺點(diǎn)。熒光實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)雖然較好地解決了交叉污染的問題，并簡(jiǎn)化了操作過程，但卻需要更復(fù)雜的定量測(cè)定儀器，不適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，而且實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR技術(shù)中熒光探針的成本較高，加大了推廣應(yīng)用的難度。免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)快速簡(jiǎn)便成本低廉，但要求使用高質(zhì)量高穩(wěn)定性的單克隆抗體，否則準(zhǔn)確性不夠，目前只能是輔助檢測(cè)手段。因此及時(shí)運(yùn)用生物技術(shù)發(fā)展的最新成果對(duì)滿足病原微生物檢測(cè)要求的不斷提高具有重要意義。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediatedisothermal amplification，簡(jiǎn)稱 LAMP 技術(shù))，是近年來新出現(xiàn)的一種體外擴(kuò)增特異DNA片段的技術(shù)，具有快速、敏感、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)。LAMP主要是利用4種不同的特異性引物識(shí)別靶基因的6個(gè)特定區(qū)段，在聚合酶和等溫條件下高效、快速、高特異地?cái)U(kuò)增靶序列，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，通常是采用染色劑對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分析。LAMP中所用到的聚合酶通常都選用具有鏈置換特性的DNA聚合酶，如Bst DNA 聚合酶。
對(duì)LAMP來說，4種特異性引物的設(shè)計(jì)是其關(guān)鍵所在，對(duì)于引物設(shè)計(jì)有許多的要求，如各個(gè)引物之間的距離、Tm值以及引物末端穩(wěn)定性等，因此從20(Γ300個(gè)堿基的靶序列中設(shè)計(jì)四條符合要求的引物存在很大的難度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供一種用于檢測(cè)鮑肌肉萎縮癥病毒的引物組，該引物組在很大程度上減少了擴(kuò)增反應(yīng)的背景影響，大大改善了鮑肌肉萎縮癥病毒檢測(cè)的特異性。
本發(fā)明的目的之二在于提供包含上述引物組的用于檢測(cè)鮑肌肉萎縮癥病毒的快速診斷試劑盒，該試劑盒檢測(cè)靈敏度高、擴(kuò)增時(shí)間短，產(chǎn)率高。本發(fā)明的目的之三在于提供檢測(cè)鮑肌肉萎縮癥病毒的方法，該方法具有快速、高效和高特異性等特點(diǎn)。本發(fā)明的第一個(gè)目的通過以下技術(shù)措施來實(shí)現(xiàn)，一種用于檢測(cè)鮑肌肉萎縮癥病毒的引物組，所述的引物組由下述外側(cè)弓I物對(duì)和內(nèi)側(cè)引物對(duì)組成
所述的外側(cè)引物對(duì)為 上游引物(F3) TGCCTAAAATTCACACAAACT, 下游引物(Β； ) :ACAGACAAAATGTTTTTCATCG ； 所述的內(nèi)側(cè)引物對(duì)為 上游引物(FIP)
CCTTGTGGATCCAAGGCATACTGAACTACATGGTAACACCCA, 下游引物(BIP)
GCCTTTATTTGACTGGCAATTGGCTGTTTTTCCGGAAAAATTTAGC。本發(fā)明的第二個(gè)目的通過以下技術(shù)措施來實(shí)現(xiàn)，一種用于檢測(cè)鮑肌肉萎縮癥病毒的快速診斷試劑盒，它包括用于檢測(cè)鮑肌肉萎縮癥病毒的引物組，該引物組由下述外側(cè)引物對(duì)和內(nèi)側(cè)引物對(duì)組成外側(cè)引物對(duì)
上游引物(F3) TGCCTAAAATTCACACAAACT, 下游引物(Β； ) :ACAGACAAAATGTTTTTCATCG ； 內(nèi)側(cè)引物對(duì) 上游引物(FIP)
CCTTGTGGATCCAAGGCATACTGAACTACATGGTAACACCCA, 下游引物(BIP)
GCCTTTATTTGACTGGCAATTGGCTGTTTTTCCGGAAAAATTTAGC。本發(fā)明所述的快速診斷試劑盒還包括LAMP反應(yīng)液、Bst DNA聚合酶。本發(fā)明所述LAMP反應(yīng)液含有IX反應(yīng)緩沖液、0. 5 2. 0mmol/LdNTPs、0. 2 1. Omol/L 甜菜堿和 0. 5 2. Ommol/L MgS04。作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，所述的IX反應(yīng)緩沖液含有20mM pH為8. 8的 Tris-HClU0mmol/L KClUOmmol/L (NH4) 2S04、2mmol/L MgSO4 和占反應(yīng)緩沖液體積百分含量為 0. 1% Triton X-IOO0本發(fā)明所述的快速診斷試劑盒還包括陽(yáng)性對(duì)照品和顯色液。本發(fā)明所述的顯色液為含熒光染料，所述的熒光染料為STOR Green I或 EvaGreen0本發(fā)明所述的陽(yáng)性對(duì)照品為含有鮑肌肉萎縮癥病毒的鮑基因組DNA。作為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例所述的陽(yáng)性對(duì)照品為含有0.廣O.ang/ml鮑肌肉萎縮癥病毒的鮑基因組DNA。本發(fā)明的第三個(gè)目的通過以下技術(shù)措施來實(shí)現(xiàn)，一種檢測(cè)鮑肌肉萎縮癥病毒的方法，包括以下步驟
(1)采用所述的引物組或所述的用于檢測(cè)鮑肌肉萎縮癥病毒的快速診斷試劑盒對(duì)陽(yáng)性對(duì)照品進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，得到陽(yáng)性對(duì)照品反應(yīng)液；
(2)采用所述的引物組或所述的用于檢測(cè)鮑肌肉萎縮癥病毒的快速診斷試劑盒對(duì)待測(cè)鮑樣品基因組的DNA進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，得到待測(cè)樣品反應(yīng)液；
(3)采用瓊脂糖凝膠電泳分析陽(yáng)性對(duì)照品反應(yīng)液和待測(cè)樣品反應(yīng)液中的擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物，陽(yáng)性對(duì)照品反應(yīng)液可見清晰的階梯狀擴(kuò)增條帶，若待測(cè)樣品反應(yīng)液同樣為階梯狀擴(kuò)增條帶，則待測(cè)樣品含有鮑肌肉萎縮癥病毒，即為陽(yáng)性，若待測(cè)鮑樣品無階梯狀條帶，則為陰性。應(yīng)用本發(fā)明提供的引物組或者試劑盒檢測(cè)鮑肌肉萎縮癥病毒，還可以通過直接檢視判斷鮑樣品中是否含有鮑肌肉萎縮癥病毒，則本發(fā)明步驟C3)采用直接檢視法
分別向陽(yáng)性對(duì)照品反應(yīng)液和待測(cè)樣品反應(yīng)液中加入顯色液，陽(yáng)性對(duì)照品反應(yīng)液中有亮綠色可見熒光，如果待測(cè)樣品反應(yīng)液有亮綠色可見熒光，則待測(cè)鮑樣品中有鮑肌肉萎縮癥病毒，即為陽(yáng)性，反之則為陰性。本發(fā)明步驟C3)還可以是直接觀察待測(cè)樣品反應(yīng)液中是否有沉淀物，如果有沉淀物，則待測(cè)鮑樣品中有鮑肌肉萎縮癥病毒，即為陽(yáng)性，反之則為陰性。本發(fā)明的檢測(cè)鮑肌肉萎縮癥病毒的方法還可以是，采用所述的引物組或所述的用于檢測(cè)鮑肌肉萎縮癥病毒的快速診斷試劑盒對(duì)待測(cè)鮑樣品基因組的DNA進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，確定鮑中是否含有鮑肌肉萎縮癥病毒。本發(fā)明添加的所述引物組中外側(cè)引物對(duì)和內(nèi)側(cè)引物之間的摩爾比例為1 廣10。所述的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的條件為反應(yīng)溫度56飛6°C，優(yōu)選60 65°C。反應(yīng)時(shí)間為4(T70min，優(yōu)選50 70min。本發(fā)明還包括以下步驟在進(jìn)行完環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)后進(jìn)行滅活，滅活的溫度為75 85°C，滅活時(shí)間為5 15min。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果
(1)本發(fā)明根據(jù)鮑肌肉萎縮癥病毒的靶基因序列設(shè)計(jì)了鮑肌肉萎縮癥病毒檢測(cè)用引物組，能特異性識(shí)別鮑肌肉萎縮癥病毒靶序列上的六個(gè)獨(dú)立區(qū)域，在Bst DNA聚合酶的作用下啟動(dòng)循環(huán)鏈置換反應(yīng)，在靶標(biāo)DNA區(qū)啟動(dòng)互補(bǔ)鏈合成，在同一鏈上互補(bǔ)序列周而復(fù)始形成有很多環(huán)的花椰菜結(jié)構(gòu)的莖-環(huán)DNA混合物，而且LAMP技術(shù)只有在四條引物完全識(shí)別靶序列六個(gè)結(jié)合區(qū)的情況下才能順利進(jìn)行，所以本發(fā)明的引物組在很大程度上減少了擴(kuò)增反應(yīng)的背景影響，大大改善了鮑肌肉萎縮癥病毒檢測(cè)的特異性。(2)采用本發(fā)明的引物組對(duì)鮑肌肉萎縮癥病毒進(jìn)行檢測(cè)，因具有高特異性，所以可以根據(jù)是否擴(kuò)增就能判斷目標(biāo)基因的存在與否；操作非?？旖莘奖闱腋咝?。(3)本發(fā)明的快速診斷試劑盒是利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)鮑肌肉萎縮癥病毒，檢測(cè)靈敏度高，擴(kuò)增模板僅需10拷貝或更少。(4)本發(fā)明的快速診斷試劑盒不但反應(yīng)條件溫和，而且所需儀器簡(jiǎn)單，也不需要特殊試劑，在Ih作用即可完成擴(kuò)增，且產(chǎn)率高，克服了傳統(tǒng)PCR固有的檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、容易污染及檢測(cè)成本高等缺點(diǎn)。(5)本發(fā)明的快速診斷試劑盒鑒定簡(jiǎn)便，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg2+結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀，可通過肉眼觀察鑒定，并且加入顯色液后，顯色差異顯著，驗(yàn)證率高，更加明顯可靠地得到陰陽(yáng)性結(jié)果。
(6)本發(fā)明的快速診斷試劑盒操作簡(jiǎn)單，對(duì)檢測(cè)人員的技術(shù)素質(zhì)要求較低，可建立成本低廉的快速篩選體系，實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)高通量快速檢測(cè)。(7)本發(fā)明的快速診斷試劑盒建立了一套經(jīng)過優(yōu)化的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng) (LAMP)體系，不但使得鮑肌肉萎縮癥病毒定性檢測(cè)更加簡(jiǎn)便快速、特異性高、靈敏度高，而且可用于鮑養(yǎng)殖過程中各時(shí)期的鮑肌肉萎縮癥病毒跟蹤檢測(cè)，避免該病原傳播流行，提高科學(xué)管理效率，具有很高的實(shí)用價(jià)值。


圖1是采用本發(fā)明引物組或試劑盒進(jìn)行LAMP檢測(cè)鮑肌肉萎縮癥病毒結(jié)果的電泳圖。圖2是采用本發(fā)明的引物組或試劑盒進(jìn)行LAMP檢測(cè)鮑肌肉萎縮癥病毒靈敏度的試驗(yàn)結(jié)果的電泳其中，1 :660ng ；2 :66ng ；3 :6. 6ng ；4 :660fg ；5 :66fg ；6 :6. 6fg ；7 和 8 陰性對(duì)照。圖3是采用本發(fā)明的引物組或試劑盒進(jìn)行LAMP檢測(cè)鮑肌肉萎縮癥病毒的特異性試驗(yàn)結(jié)果的電泳其中，WSSV為對(duì)蝦白斑綜合癥病毒(White Spot Syndrome Virus) ;RGNNV為赤點(diǎn)石斑魚神經(jīng)壞死病毒(Red spotted Grouper Nervous Necrosis Virus);LMBV 為大 Π 黑售盧病毒 (Large Mouth Bass Virus)； MCRV為鋸緣青蟹呼腸孤病毒(Mud Crab Reo_Virus);MCDV為鋸緣青蟹雙順反子病毒(Mud Crab Dicistro-Virus) ;AbSV為鮑肌肉萎縮癥病毒(Abalone Shriveling syndrome associated Virus)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 利用LAMP檢測(cè)鮑肌肉萎縮癥病毒的引物組的制備
鮑肌肉萎縮癥病毒(AbSV)是一種新型病毒，其基因組序列(GenBank Accession Number EU350361)與已知基因序列幾乎沒有相似性。鮑肌肉萎縮癥病毒與NCBI中現(xiàn)有的核酸序列進(jìn)行比對(duì)，選擇EU350361序列中與現(xiàn)有核酸序列沒有相似性的區(qū)段設(shè)計(jì)引物，以保證引物的特異性。在http://primerexplorer. jp/e/的系統(tǒng)中輸入EU350361序列，選擇默認(rèn)參數(shù)，生成得到引物。其中F3引物位于EU350361序列的469-489位；B3引物位于 EU350361 序列的 660-639 位；FIP 引物位于 EU350361 序列的 487-509 和 551-530 位；BIP 引物位于EU350361序列的576-598和616-639位。它們具體序列如下 外側(cè)引物對(duì)為
上游引物(F3) TGCCTAAAATTCACACAAACT, 下游引物(Β； ) :ACAGACAAAATGTTTTTCATCG ； 內(nèi)側(cè)引物對(duì)為 上游引物(FIP)
CCTTGTGGATCCAAGGCATACTGAACTACATGGTAACACCCA, 下游引物(BIP)
GCCTTTATTTGACTGGCAATTGGCTGTTTTTCCGGAAAAATTTAGC。實(shí)施例2用于檢測(cè)鮑肌肉萎縮癥病毒的試劑盒，包括以下試劑
a)含有實(shí)施例1所述的引物組，該引物組包括外側(cè)引物對(duì)和內(nèi)側(cè)引物。其中，10umol/L外側(cè)引物對(duì) F3 TGCCTAAAATTCACACAAACT,
B3 :ACAGACAAAATGTTTTTCATCG ； IOumol/L內(nèi)側(cè)引物對(duì)
FIP CCTTGTGGATCCAAGGCATACTGAACTACATGGTAACACCCA, BIP :GCCTTTATTTGACTGGCAATTGGCTGTTTTTCCGGAAAAATTTAGC 。b)陽(yáng)性對(duì)照品含有0. 2mg/mL鮑肌肉萎縮癥病毒的鮑基因組DNA。c) LAMP反應(yīng)液含有1 X反應(yīng)緩沖液、1. Ommol/LdNTPsU. Omol/L甜菜堿和 lmmol/L MgSO4,其中的 1 X 反應(yīng)緩沖液含有 20mM pH 為 8. 8 的 Tris-HClUOmmol/L KC1、 10mmol/L (NH4) 2S04、2mmol/L MgSO4 和占反應(yīng)緩沖液體積百分含量為 0· 1% Triton X-IOO0d) Bst DNA 聚合酶。e) 顯色液含有常規(guī)熒光染料，該熒光染料為STOR Green I或EvaGreen。本發(fā)明的試劑盒里還可以包括一個(gè)泡沫板，泡沫板的設(shè)計(jì)可以為其大小與本發(fā)明試劑盒的底面相同，泡沫板上有不少于試劑盒中所裝試劑小管數(shù)量的小孔，這樣試劑盒中所用試劑分裝成的小管可以分別對(duì)應(yīng)放置于這些小孔中，從而使得試劑都能處于小管的下部，方便取用和吸取，也可以使取用時(shí)殘留在管壁上的液體自動(dòng)回到管底，節(jié)約試劑。實(shí)施例3
與實(shí)施例2不同的是
b)陽(yáng)性對(duì)照品含有0.lmg/mL鮑肌肉萎縮癥病毒的鮑基因組DNA。c) LAMP反應(yīng)液含有1 X反應(yīng)緩沖液、0. 5mmol/LdNTPs、0. 5mol/L甜菜堿和 2mmol/L MgSO4。實(shí)施例4
與實(shí)施例2不同的是
b)陽(yáng)性對(duì)照品含有0. 12mg/mL鮑肌肉萎縮癥病毒的鮑基因組DNA。c) LAMP反應(yīng)液含有1 X反應(yīng)緩沖液、1. 2mmol/LdNTPs、0. 8mol/L甜菜堿和 0. 5mmol/L MgSO40實(shí)施例5
本實(shí)施例提供的利用LAMP檢測(cè)鮑肌肉萎縮癥病毒的方法，所采用的快速診斷試劑盒參見實(shí)施例2。該LAMP檢測(cè)鮑肌肉萎縮癥病毒的方法為
(1)分別使用 Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega, Cat. #A1120, Lot#312150)從2只待測(cè)鮑樣品中提取得到待測(cè)鮑樣品基因組的DNA，分別標(biāo)記為Sl和S2。 待測(cè)基因組DNA樣品Sl和S2各取IuL置于不同的試管中，然后分別加入試劑盒中的外側(cè)弓丨物對(duì)和內(nèi)側(cè)引物對(duì)、LAMP反應(yīng)液、Bst DNA聚合酶混勻，構(gòu)成待測(cè)鮑樣品LAMP反應(yīng)體系。(2)取0. 2mg/mL的陽(yáng)性對(duì)照品luL，加入試劑盒中的外側(cè)引物對(duì)和內(nèi)側(cè)引物對(duì)、 LAMP反應(yīng)液、Bst DNA聚合酶混勻，構(gòu)成陽(yáng)性對(duì)照品LAMP反應(yīng)體系。步驟(1)和(2)中的LAMP反應(yīng)體系各為25μ ，反應(yīng)體系中，外側(cè)引物對(duì)F3和Β3加入終濃度為160nmol/L，而外側(cè)引物對(duì)和內(nèi)側(cè)引物對(duì)的添加比例為1 8(摩爾比)，MgS04 的濃度lmmol/L，甜菜堿的濃度1. Omol/L,dNTPs的濃度1. Ommol/L,內(nèi)側(cè)引物對(duì)FIP和BIP 濃度 1280nmol/LoIX 反應(yīng)緩沖液包括20mM pH 為 8. 8 的 Tris-HCl、10mmol/L KClUOmmol/L (MM)2SO4、2mmol/L MgSO4和占反應(yīng)緩沖液體積百分含量為0. 1% Triton X-IOO0其中外引物對(duì)為
F3 TGCCTAAAATTCACACAAACT, B3 :ACAGACAAAATGTTTTTCATCG ； 內(nèi)引物對(duì)為
FIP CCTTGTGGATCCAAGGCATACTGAACTACATGGTAACACCCA, BIP :GCCTTTATTTGACTGGCAATTGGCTGTTTTTCCGGAAAAATTTAGC。(3)待測(cè)鮑樣品LAMP反應(yīng)體系和陽(yáng)性對(duì)照品LAMP反應(yīng)體系分別進(jìn)行LAMP反應(yīng)， 反應(yīng)的溫度范圍為65°C，反應(yīng)時(shí)間為70min，85°C滅活5min，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析 (條件8V/cm，lOmin)，對(duì)待測(cè)樣品中是否含有鮑肌肉萎縮癥病毒進(jìn)行檢測(cè)，如圖1所示其中，陽(yáng)性對(duì)照品(CK+)可見清晰的階梯狀擴(kuò)增條帶，待測(cè)樣品S2同樣為階梯狀擴(kuò)增條帶，因此待測(cè)樣品S2為陽(yáng)性，而待測(cè)樣品Sl無階梯狀條帶，因此為陰性。或者是在反應(yīng)后的各LAMP反應(yīng)體系中加入顯色液，混勻，陽(yáng)性對(duì)照品LAMP反應(yīng)體系中有亮綠色可見熒光，如果待測(cè)鮑樣品環(huán)介導(dǎo)LAMP體系有亮綠色可見熒光，則待測(cè)鮑樣品中有鮑肌肉萎縮癥病毒，即為陽(yáng)性，反之則為陰性。實(shí)施例6
本實(shí)施例提供的利用LAMP檢測(cè)鮑肌肉萎縮癥病毒的方法，所采用的快速診斷試劑盒參見實(shí)施例3。該LAMP檢測(cè)鮑肌肉萎縮癥病毒的方法為
(1) ^ M Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega, Cat. #A1120， Lot#312150)從待測(cè)鮑樣品中提取得到待測(cè)鮑樣品基因組的DNA，取待測(cè)基因組DNA樣品 luL，然后加入試劑盒中的外側(cè)引物對(duì)和內(nèi)側(cè)引物對(duì)、LAMP反應(yīng)液、Bst DNA聚合酶混勻，構(gòu)成待測(cè)鮑樣品LAMP反應(yīng)體系。(2)取0. lmg/mL的陽(yáng)性對(duì)照品luL，加入試劑盒中的外側(cè)引物對(duì)和內(nèi)側(cè)引物對(duì)、 LAMP反應(yīng)液、Bst DNA聚合酶混勻，構(gòu)成陽(yáng)性對(duì)照品LAMP反應(yīng)體系。步驟(1)和⑵中的LAMP反應(yīng)體系各為25PL，反應(yīng)體系中，外側(cè)引物對(duì)F3和B3加入終濃度為160nmol/L，而外側(cè)引物對(duì)和內(nèi)側(cè)引物對(duì)的添加比例為1 10 (摩爾比)，MgSO4 的濃度2mmol/L，甜菜堿的濃度0. 5mol/L,dNTPs的濃度0. 5mmol/L,內(nèi)側(cè)引物對(duì)FIP和BIP 濃度 1600nmol/L。IX 反應(yīng)緩沖液包括20mM pH 為 8. 8 的 Tris-HCl、10mmol/L KClU0mmol/L (MM)2SO4、2mmol/L MgSO4和占反應(yīng)緩沖液體積百分含量為0. 1% Triton X-IOO0其中外側(cè)引物對(duì)為
F3 TGCCTAAAATTCACACAAACT, B3 :ACAGACAAAATGTTTTTCATCG ； 內(nèi)側(cè)引物對(duì)為FIP CCTTGTGGATCCAAGGCATACTGAACTACATGGTAACACCCA, BIP :GCCTTTATTTGACTGGCAATTGGCTGTTTTTCCGGAAAAATTTAGC。(3)待測(cè)鮑樣品LAMP反應(yīng)體系和陽(yáng)性對(duì)照品LAMP反應(yīng)體系分別進(jìn)行LAMP反應(yīng)， 反應(yīng)的溫度范圍為60°C，反應(yīng)時(shí)間為60min，75°C滅活15min，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析(條件7V/cm，12min)，對(duì)待測(cè)樣品中是否含有鮑肌肉萎縮癥病毒進(jìn)行檢測(cè)，其中，陽(yáng)性對(duì)照品可見清晰的階梯狀擴(kuò)增條帶，若待測(cè)樣品同樣為階梯狀擴(kuò)增條帶，則待測(cè)樣品為陽(yáng)性， 若待測(cè)樣品無階梯狀條帶，則為陰性。或者是在反應(yīng)后的各LAMP反應(yīng)體系中加入顯色液，混勻，陽(yáng)性對(duì)照品LAMP反應(yīng)體系中有亮綠色可見熒光，如果待測(cè)鮑樣品環(huán)介導(dǎo)LAMP體系有亮綠色可見熒光，則待測(cè)鮑樣品中有鮑肌肉萎縮癥病毒，即為陽(yáng)性，反之則為陰性。實(shí)施例7
本實(shí)施例提供的利用LAMP檢測(cè)鮑肌肉萎縮癥病毒的方法，所采用的快速診斷試劑盒參見實(shí)施例4。該LAMP檢測(cè)鮑肌肉萎縮癥病毒的方法為
(1) ^ M Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega, Cat. #A1120， Lot#312150)從待測(cè)鮑樣品中提取得到待測(cè)鮑樣品基因組的DNA，取待測(cè)基因組DNA樣品 luL，然后加入試劑盒中的外側(cè)引物對(duì)和內(nèi)側(cè)引物對(duì)、LAMP反應(yīng)液、Bst DNA聚合酶混勻，構(gòu)成待測(cè)鮑樣品LAMP反應(yīng)體系。(2)取0. 12mg/mL的陽(yáng)性對(duì)照品luL，加入試劑盒中的外側(cè)引物對(duì)和內(nèi)側(cè)引物對(duì)、 LAMP反應(yīng)液、Bst DNA聚合酶混勻，構(gòu)成陽(yáng)性對(duì)照品LAMP反應(yīng)體系。步驟(1)和(2)中的LAMP反應(yīng)體系各為25μ ，反應(yīng)體系中，外側(cè)引物對(duì)F3和Β3 加入終濃度為160nmol/L，而外側(cè)引物對(duì)和內(nèi)側(cè)引物對(duì)的添加比例為1 1(摩爾比)，MgS04 的濃度0. 5mmol/L，甜菜堿的濃度0. 8mol/L, dNTPs的濃度1. 2mmol/L,內(nèi)側(cè)引物對(duì)FIP和 BIP 濃度 160nmol/L。IX 反應(yīng)緩沖液包括20mM pH 為 8. 8 的 Tris-HCl、10mmol/L KClUOmmol/L (MM)2SO4、2mmol/L MgSO4和占反應(yīng)緩沖液體積百分含量為0. 1% Triton X-IOO0其中外側(cè)引物對(duì)為
F3 TGCCTAAAATTCACACAAACT, B3 :ACAGACAAAATGTTTTTCATCG ； 內(nèi)側(cè)引物對(duì)為
FIP CCTTGTGGATCCAAGGCATACTGAACTACATGGTAACACCCA, BIP :GCCTTTATTTGACTGGCAATTGGCTGTTTTTCCGGAAAAATTTAGC。(3)待測(cè)鮑樣品LAMP反應(yīng)體系和陽(yáng)性對(duì)照品LAMP反應(yīng)體系分別進(jìn)行LAMP反應(yīng)， 反應(yīng)的溫度范圍為56°C，反應(yīng)時(shí)間為40min，8(TC滅活lOmin，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析(條件6V/Cm，20min)，對(duì)待測(cè)樣品中是否含有鮑肌肉萎縮癥病毒進(jìn)行檢測(cè)，其中，陽(yáng)性樣品可見清晰的階梯狀擴(kuò)增條帶，若待測(cè)樣品同樣為階梯狀擴(kuò)增條帶，則待測(cè)樣品為陽(yáng)性，若待測(cè)樣品無階梯狀條帶，則為陰性。或者是在反應(yīng)后的各LAMP反應(yīng)體系中加入顯色液，混勻，陽(yáng)性對(duì)照品LAMP反應(yīng)體系中有亮綠色可見熒光，如果待測(cè)鮑樣品環(huán)介導(dǎo)LAMP體系有亮綠色可見熒光，則待測(cè)鮑樣品中有鮑肌肉萎縮癥病毒，即為陽(yáng)性，反之則為陰性。實(shí)施例8:靈敏度試驗(yàn)
以實(shí)施例4的快速診斷試劑盒為例，進(jìn)行本發(fā)明靈敏度試驗(yàn)。該LAMP檢測(cè)鮑肌肉萎縮癥病毒的方法為
(1)分別取鮑肌肉萎縮癥病毒含量為660ng、66ng、6. 6ng、660fg、66fg、6. 6fg和Ong的 DNA樣品各luL，分別加入試劑盒中的外側(cè)引物對(duì)和內(nèi)側(cè)引物對(duì)、LAMP反應(yīng)液、Bst DNA聚合酶混勻，構(gòu)成LAMP靈敏度檢測(cè)的反應(yīng)體系。步驟(1)中的LAMP反應(yīng)體系各為25μ ，反應(yīng)體系中，外側(cè)引物對(duì)F3和Β3加入終濃度為160nmol/L，而外側(cè)引物對(duì)和內(nèi)側(cè)引物對(duì)的添加比例為1 1 (摩爾比)，MgSO4的濃度0. 5mmol/L，甜菜堿的濃度0. 8mol/L,dNTPs的濃度1. 2mmol/L,內(nèi)側(cè)引物對(duì)FIP和BIP濃度 160nmol/L。IX 反應(yīng)緩沖液包括20mM pH 為 8. 8 的 Tris-HCl、10mmol/L KClUOmmol/L (MM)2SO4、2mmol/L MgSO4和占反應(yīng)緩沖液體積百分含量為0. 1% Triton X-IOO0其中外側(cè)引物對(duì)為
F3 TGCCTAAAATTCACACAAACT, B3 :ACAGACAAAATGTTTTTCATCG ； 內(nèi)側(cè)引物對(duì)為
FIP CCTTGTGGATCCAAGGCATACTGAACTACATGGTAACACCCA, BIP :GCCTTTATTTGACTGGCAATTGGCTGTTTTTCCGGAAAAATTTAGC。(3)待測(cè)鮑樣品LAMP反應(yīng)體系和陽(yáng)性對(duì)照品LAMP反應(yīng)體系分別進(jìn)行LAMP反應(yīng)， 反應(yīng)的溫度范圍為56°C，反應(yīng)時(shí)間為40min，8(TC滅活lOmin，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析(條件6V/Cm，20min)，對(duì)待測(cè)樣品中是否含有鮑肌肉萎縮癥病毒進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖2 所示，66fg以上病毒含量均有條帶擴(kuò)增，說明該方法的AbSV病毒檢測(cè)限最低可去到66fg。實(shí)施例9 特異性試驗(yàn)
以實(shí)施例4的快速診斷試劑盒為例，進(jìn)行本發(fā)明特異性試驗(yàn)。該LAMP檢測(cè)鮑肌肉萎縮癥病毒的方法為
(1)分別取WSSV、RGNNV, LMBV, MCRV, MCDV、AbSV病毒DNA樣品各luL，分別加入試劑盒中的外側(cè)引物對(duì)和內(nèi)側(cè)引物對(duì)、LAMP反應(yīng)液、Bst DNA聚合酶混勻，構(gòu)成LAMP特異性檢測(cè)的反應(yīng)體系。步驟(1)中的LAMP反應(yīng)體系各為25μ ，反應(yīng)體系中，外側(cè)引物對(duì)F3和Β3加入終濃度為160nmol/L，而外側(cè)引物對(duì)和內(nèi)側(cè)引物對(duì)的添加比例為1 1 (摩爾比)，MgSO4的濃度0. 5mmol/L，甜菜堿的濃度0. 8mol/L,dNTPs的濃度1. 2mmol/L,內(nèi)側(cè)引物對(duì)FIP和BIP濃度 160nmol/L。IX 反應(yīng)緩沖液包括20mM pH 為 8. 8 的 Tris-HCl、10mmol/L KClU0mmol/L (MM)2SO4、2mmol/L MgSO4和占反應(yīng)緩沖液體積百分含量為0. 1% Triton X-IOO0其中外側(cè)引物對(duì)為
F3 TGCCTAAAATTCACACAAACT, B3 :ACAGACAAAATGTTTTTCATCG ； 內(nèi)側(cè)引物對(duì)為FIP CCTTGTGGATCCAAGGCATACTGAACTACATGGTAACACCCA, BIP :GCCTTTATTTGACTGGCAATTGGCTGTTTTTCCGGAAAAATTTAGC。(3)待測(cè)鮑樣品LAMP反應(yīng)體系和陽(yáng)性對(duì)照品LAMP反應(yīng)體系分別進(jìn)行LAMP反應(yīng)， 反應(yīng)的溫度范圍為56°C，反應(yīng)時(shí)間為40min，8(TC滅活lOmin，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析(條件6V/Cm，20min)，對(duì)待測(cè)樣品中是否含有鮑肌肉萎縮癥病毒進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖3 所示，只有AbSV病毒有清晰條帶擴(kuò)增，說明該方法只能檢測(cè)到AbSV病毒，其它病毒不會(huì)對(duì)其產(chǎn)生干擾。以上實(shí)施例僅用于闡述本發(fā)明，而本發(fā)明的保護(hù)范圍并非僅僅局限于以下實(shí)施例。所述技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員依據(jù)以上本發(fā)明公開的內(nèi)容和各參數(shù)所取范圍，均可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。而且檢測(cè)鮑樣品中是否含有鮑肌肉萎縮癥病毒還通過以下方式來判斷 直接觀察鮑樣品DNA的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增后是否有沉淀物產(chǎn)生，或者檢測(cè)鮑樣品DNA的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增后的產(chǎn)物中是否含有鮑肌肉萎縮癥病毒。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測(cè)鮑肌肉萎縮癥病毒的引物組，其特征在于，由下述外引物對(duì)和內(nèi)引物對(duì)組成所述的外側(cè)引物對(duì)F3 TGCCTAAAATTCACACAAACT,B3 :ACAGACAAAATGTTTTTCATCG ；所述的內(nèi)側(cè)引物對(duì)FIP CCTTGTGGATCCAAGGCATACTGAACTACATGGTAACACCCA,BIP :GCCTTTATTTGACTGGCAATTGGCTGTTTTTCCGGAAAAATTTAGC。
2.含有權(quán)利要求1所述的引物組的用于檢測(cè)鮑肌肉萎縮癥病毒的快速診斷試劑盒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于LAMP檢測(cè)鮑肌肉萎縮癥病毒的快速診斷試劑盒，其特征在于，所述的快速診斷試劑盒還包括LAMP反應(yīng)液和Bst DNA聚合酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的用于LAMP檢測(cè)鮑肌肉萎縮癥病毒的快速診斷試劑盒，其特征在于，所述的快速診斷試劑盒還包括陽(yáng)性對(duì)照品和顯色液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于LAMP檢測(cè)鮑肌肉萎縮癥病毒的快速診斷試劑盒，其特征在于，所述LAMP反應(yīng)液含有1 X反應(yīng)緩沖液、0. 5 2. Ommol/LdNTPs、0. 2 1. Omol/L甜菜堿和0. 5 2. Ommol/L MgSO4 ；所述的顯色液為含熒光染料，所述的熒光染料為STOR Green I或EvaGreen ；所述的陽(yáng)性對(duì)照品為含有肌肉萎縮癥病毒的鮑基因組DNA。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于LAMP檢測(cè)鮑肌肉萎縮癥病毒的快速診斷試劑盒，其特征在于，所述的IX反應(yīng)緩沖液含有20mM pH為8. 8的Tris-HClUOmmol/L KClUOmmol/L (MM)2SO4、2mmol/L MgSO4和占反應(yīng)緩沖液體積百分含量為0. 1% Triton X-IOO0
7.利用權(quán)利要求2飛所述的LAMP檢測(cè)鮑肌肉萎縮癥病毒的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)采用所述的引物組或所述的用于檢測(cè)鮑肌肉萎縮癥病毒的快速診斷試劑盒對(duì)陽(yáng)性對(duì)照品進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，得到陽(yáng)性對(duì)照品反應(yīng)液；(2)采用所述的引物組或所述的用于檢測(cè)鮑肌肉萎縮癥病毒的快速診斷試劑盒對(duì)待測(cè)鮑樣品基因組的DNA進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，得到待測(cè)樣品反應(yīng)液；(3)采用瓊脂糖凝膠電泳分析陽(yáng)性對(duì)照品反應(yīng)液和待測(cè)樣品反應(yīng)液中的擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物，陽(yáng)性對(duì)照品反應(yīng)液可見清晰的階梯狀擴(kuò)增條帶，若待測(cè)樣品反應(yīng)液同樣為階梯狀擴(kuò)增條帶，則待測(cè)樣品含有鮑肌肉萎縮癥病毒，即為陽(yáng)性，若待測(cè)鮑樣品無階梯狀條帶，則為陰性；或者是分別向陽(yáng)性對(duì)照品反應(yīng)液和待測(cè)樣品反應(yīng)液中加入顯色液，陽(yáng)性對(duì)照品反應(yīng)液中有亮綠色可見熒光，如果待測(cè)樣品反應(yīng)液有亮綠色可見熒光，則待測(cè)鮑樣品中有鮑肌肉萎縮癥病毒，即為陽(yáng)性，反之則為陰性；或者是觀察待測(cè)樣品反應(yīng)液中是否有沉淀物，如果有沉淀物，則待測(cè)鮑樣品中有鮑肌肉萎縮癥病毒，即為陽(yáng)性，反之則為陰性。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的LAMP檢測(cè)鮑肌肉萎縮癥病毒的方法，其特征在于，所述的步驟⑴和(3)的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的溫度范圍為56飛6°C，反應(yīng)時(shí)間為4(T70min。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的LAMP檢測(cè)鮑肌肉萎縮癥病毒的方法，其特征在于，還包括以下步驟在進(jìn)行完環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)后進(jìn)行滅活，滅活的溫度為75 85°C，滅活時(shí)間為 5 15min。
10.權(quán)利要求1所述的引物組在制備用于檢測(cè)鮑肌肉萎縮癥病毒的快速診斷試劑盒中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開一種用于LAMP檢測(cè)鮑肌肉萎縮癥病毒的引物組，所述的引物組由下述外引物對(duì)和內(nèi)引物對(duì)組成所述的外引物對(duì)為F3TGCCTAAAATTCACACAAACT，B3ACAGACAAAATGTTTTTCATCG；所述的內(nèi)引物對(duì)為FIPCCTTGTGGATCCAAGGCATACTGAACTACATGGTAACACCCA，BIPGCCTTTATTTGACTGGCAATTGGCTGTTTTTCCGGAAAAATTTAGC。本發(fā)明還公開了包含上述引物組的用于LAMP檢測(cè)鮑肌肉萎縮癥病毒的快速診斷試劑盒以及使用該試劑盒的LAMP檢測(cè)鮑肌肉萎縮癥病毒的方法。本發(fā)明在很大程度上減少了擴(kuò)增反應(yīng)的背景影響，大大改善了鮑肌肉萎縮癥病毒檢測(cè)的特異性。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102443656SQ20111033918
公開日2012年5月9日 申請(qǐng)日期2011年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月1日
發(fā)明者劉廣鋒, 姜敬哲, 張晗, 王江勇 申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所