專利名稱：MRSA中QacA基因攜帶情況的檢測(cè)引物及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)中耐消毒劑QacA基因攜帶情況的檢測(cè)引物及檢測(cè)方法，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
金黃色葡萄球菌的qac轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)屬于主要易化子超家族(major facilitator superfamily, MFS)，由QacA和qacR基因構(gòu)成，由質(zhì)粒編碼，QacA是多藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，因介導(dǎo)對(duì)親脂性消毒劑季胺類化合物(quaternary ammonium compounds, Qac)外排而命名； QacR是188個(gè)氨基酸的多藥結(jié)合蛋白，屬TerR類轉(zhuǎn)錄抑制蛋白。無誘導(dǎo)底物時(shí)，QacR結(jié)合在QacA啟動(dòng)子下游的假回文序列(IRl)上，抑制QacA的轉(zhuǎn)錄。因?yàn)樵摷倩匚男蛄?(IRl)與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)重疊，所以推測(cè)QacR通過結(jié)合IRl結(jié)構(gòu)而阻止RNA聚合酶2啟動(dòng)子復(fù)合體形成有效的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)而抑制QacA的轉(zhuǎn)錄，并不是通過阻止RNA聚合酶的結(jié)合。 QacA基因表達(dá)多種化合物外排泵蛋白，細(xì)菌獲得QacA基因可表現(xiàn)為對(duì)胺類(如苯扎溴銨) 、胍類(如氯己定)、腙類消毒劑耐藥，由此在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域帶來了極大的危險(xiǎn)因素。目前檢測(cè)QacA基因攜帶情況的方法主要有PCR后瓊脂糖凝膠電泳、測(cè)序。凝膠電泳法成本低、易操作，但靈敏度低，容易出現(xiàn)假陰性；測(cè)序是檢測(cè)基因突變的金標(biāo)準(zhǔn)，但測(cè)序技術(shù)步驟繁瑣、耗時(shí)長、容易污染。本發(fā)明基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，應(yīng)用具有分辨率更高、雜交特異性更強(qiáng)、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)的Taqman-MGB探針，不僅檢測(cè)速度快，全部反應(yīng)在封閉的反應(yīng)管中完成，有效避免了交叉污染，且自動(dòng)化程度高，能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)控，提供質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品，使結(jié)果判讀更直觀。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)中耐消毒劑QacA基因攜帶情況的PCR檢測(cè)引物及檢測(cè)方法。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一組MRSA中QacA基因攜帶情況的檢測(cè)引物，其特征在于，包括
QacA 基因正向弓丨物5' -ggttgtggaagaactttctcctt-3‘； QacA 基因反向弓丨物5' -ccaattccggaaggtaacac-3‘。本發(fā)明還提供了一種MRSA中QacA基因攜帶情況的檢測(cè)方法，其特征在于，具體步驟為
第一步取經(jīng)培養(yǎng)后鑒定為MRSA陽性的臨床樣本分離株，高溫滅活，提取樣本DNA，作為檢測(cè)樣品；取不攜帶QacA基因的金黃色葡萄球菌菌株，高溫滅活，提取樣本DNA，作為陰性對(duì)照品；人工合成QacA序列，構(gòu)建攜帶QacA基因的重組質(zhì)粒為陽性對(duì)照品；
第二步用無菌水配制濃度為5 15umol/L的QacA基因正向引物溶液，濃度為5 15umol/L的QacA基因反向引物溶液以及濃度為5 15umol/L的QacA基因檢測(cè)探針溶液，其中，引物和探針序列如下QacA 基因正向弓丨物5' -ggttgtggaagaactttctcctt-3‘； QacA 基因反向弓丨物5' -ccaattccggaaggtaacac-3‘； QacA 基因探針FAM-atggtgtttgcac-MGBNFQ ；
第三步在每一個(gè)PCR反應(yīng)孔中加入PCR Master Mix 10 15ul，第二步所得的 QacA基因正向引物溶液0. 1 Iul，QacA基因反向引物溶液0. 1 Iul，QacA基因檢測(cè)探針溶液0. 1 lul，第一步所得的檢測(cè)樣品、陰性對(duì)照品或陽性對(duì)照品0. 1 lul，用滅菌重蒸餾水補(bǔ)足25ul ；在熒光定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為40 60°C保溫1 3分鐘， 80 100°C保溫1 3分鐘，再運(yùn)行30 50個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括在80 100°C保溫10 20秒再在50 70°C保溫0. 5 1. 5分鐘；
第四步用軟件SDS2. 2進(jìn)行結(jié)果分析，PCR結(jié)果呈S形曲線即為攜帶QacA基因。本發(fā)明是對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌中是否還有耐消毒劑QacA基因的檢測(cè)， 細(xì)菌一旦獲得此基因即可對(duì)現(xiàn)用的消毒劑耐受，使消毒劑失效，通過檢測(cè)了解細(xì)菌中QacA 基因的攜帶情況，有利于對(duì)含有耐消毒劑基因的菌株的監(jiān)控，防止菌株繼續(xù)流行，同時(shí)從科研角度對(duì)其耐藥機(jī)理的進(jìn)一步了解還有利于新的滅菌制劑的研制開發(fā)。本發(fā)明檢測(cè)率高、可重復(fù)性強(qiáng)，檢測(cè)速度快，全部反應(yīng)在封閉的反應(yīng)管中完成，有效避免了交叉污染，且自動(dòng)化程度高，能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)控，提供質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品，使結(jié)果判讀更直觀。


圖1為攜帶QacA基因的陽性對(duì)照品的Realtime PCR曲線圖； 圖2為Realtime PCR陰性對(duì)照品的Realtime PCR曲線圖3為攜帶QacA基因檢測(cè)樣品的Realtime PCR曲線圖； 圖4為QacA基因檢測(cè)樣品的瓊脂糖凝膠電泳圖； 圖5為QacA基因檢測(cè)樣品的測(cè)序圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例1
1、常規(guī)方法制備一組MRSA中QacA基因攜帶情況的檢測(cè)引物，包括 QacA 基因正向弓丨物5' -ggttgtggaagaactttctcctt-3‘； QacA 基因反向弓丨物5' -ccaattccggaaggtaacac-3‘。2、一種MRSA中QacA基因攜帶情況的檢測(cè)方法，具體步驟為
(1)取經(jīng)培養(yǎng)后鑒定為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌陽性的臨床樣本分離株，高溫滅活， 用商品化的細(xì)菌基因組DNA磁珠提取試劑盒(深圳易瑞生物技術(shù)有限公司，YP03002)提取樣本DNA，稀釋至30ul(濃度lOng/ul)，置-20°C保存，待用；將標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌株(保藏編號(hào)ATCC Number: 43300)，高溫滅活，用商品化的細(xì)菌基因組DNA磁珠提取試劑盒(深圳易瑞生物技術(shù)有限公司，YP03002)提取樣本DNA，稀釋至30ul (濃度lOng/ul)，作為陰性對(duì)照品；人工合成QacA序列(由上海生工合成)，構(gòu)建攜帶QacA基因的重組質(zhì)粒，稀釋至30ul (濃度lOng/ul)，為陽性對(duì)照品。(2)根據(jù)QacA基因的保守區(qū)域，采用ABI Primer Express 3. 0實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)合成引物及Taqman探針，探針序列一端標(biāo)記有報(bào)告熒光染料，另一端標(biāo)記有淬滅熒光染料(由上海生工合成)，用無菌水配制濃度為lOumol/L的QacA基因正向引物溶液，濃度為lOumol/L的QacA基因反向引物溶液以及濃度為lOumol/L的QacA基因檢測(cè)探針溶液，其中，引物和探針序列如下
QacA 基因正向弓丨物5' -ggttgtggaagaactttctcctt-3‘； QacA 基因反向弓丨物5' -ccaattccggaaggtaacac-3‘； QacA 基因探針FAM-atggtgtttgcac-MGBNFQ ；
(3)在每一個(gè)PCR反應(yīng)孔中加入PCRMaster Mix (Applied Biosystems公司生產(chǎn)的 Taqman Universal PCR Master Mix 2X，包括 IOXPCR 緩沖液、MgC12、dNTP、DNA 聚合酶) 12. 5ul，QacA基因正向引物溶液0. 5ul，QacA基因反向引物溶液0. 5ul，QacA基因檢測(cè)探針溶液0. 5ul，第一步所得的檢測(cè)樣品、陰性對(duì)照品或陽性對(duì)照品0. 5ul，用滅菌重蒸餾水補(bǔ)足25ul ；在ABI7300型熒光定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為50°C保溫2分鐘，95°C保溫2分鐘，再運(yùn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括在95°C保溫15秒再在60°C保溫1分鐘；
(4)用軟件SDS2.2進(jìn)行結(jié)果分析，如圖1所示，陽性對(duì)照品的Realtime PCR曲線呈 S形，如圖2所示，陰性對(duì)照品的Realtime PCR曲線為非S形，如圖3所示，檢測(cè)樣品的 Realtime PCR曲線呈S形，判斷為攜帶QacA基因菌株。攜帶QacA基因菌株可使多種消毒劑如吖啶黃、氯化苯甲烷銨、氯化芐乙氧銨等的 MIC值幾倍或幾十倍的升高，對(duì)消毒劑表現(xiàn)為耐受。利用本發(fā)明對(duì)超過100例MRSA樣本的檢測(cè)結(jié)果顯示，根據(jù)上述方法進(jìn)行的QacA 基因攜帶情況檢出率可達(dá)99%以上，可重復(fù)性達(dá)到100%。而瓊脂糖凝膠電泳法的檢出率只有75% (如圖4所示)；上述方法與直接測(cè)序法相比，結(jié)果一致性可達(dá)到99. 5%以上(如圖5 所示)。
權(quán)利要求
1.一組MRSA中QacA基因攜帶情況的檢測(cè)引物，其特征在于，包括 QacA 基因正向弓丨物5' -ggttgtggaagaactttctcctt-3‘；QacA 基因反向弓丨物5' -ccaattccggaaggtaacac-3‘。
2.—種MRSA中QacA基因攜帶情況的檢測(cè)方法，其特征在于，具體步驟為第一步取經(jīng)培養(yǎng)后鑒定為MRSA陽性的臨床樣本分離株，高溫滅活，提取樣本DNA，作為檢測(cè)樣品；取不攜帶QacA基因的金黃色葡萄球菌菌株，高溫滅活，提取樣本DNA，作為陰性對(duì)照品；人工合成QacA序列，構(gòu)建攜帶QacA基因的重組質(zhì)粒為陽性對(duì)照品；第二步用無菌水配制濃度為5 15umol/L的QacA基因正向引物溶液，濃度為5 15umol/L的QacA基因反向引物溶液以及濃度為5 15umol/L的QacA基因檢測(cè)探針溶液，其中，引物和探針序列如下QacA 基因正向弓丨物5' -ggttgtggaagaactttctcctt-3‘； QacA 基因反向弓丨物5' -ccaattccggaaggtaacac-3‘； QacA 基因探針FAM-atggtgtttgcac-MGBNFQ ；第三步在每一個(gè)PCR反應(yīng)孔中加入PCR Master Mix 10 15ul，第二步所得的 QacA基因正向引物溶液0. 1 Iul，QacA基因反向引物溶液0. 1 Iul，QacA基因檢測(cè)探針溶液0. 1 lul，第一步所得的檢測(cè)樣品、陰性對(duì)照品或陽性對(duì)照品0. 1 lul，用滅菌重蒸餾水補(bǔ)足25ul ；在熒光定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為40 60°C保溫1 3分鐘， 80 100°C保溫1 3分鐘，再運(yùn)行30 50個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括在80 100°C保溫10 20秒再在50 70°C保溫0. 5 1. 5分鐘；第四步用軟件SDS2. 2進(jìn)行結(jié)果分析，PCR結(jié)果呈S形曲線即為攜帶QacA基因。
全文摘要
本發(fā)明提供了MRSA中QacA基因攜帶情況的檢測(cè)引物及檢測(cè)方法。所述的MRSA中QacA基因攜帶情況的檢測(cè)引物，其特征在于，包括QacA基因正向引物5′-ggttgtggaagaactttctcctt-3′；QacA基因反向引物5′-ccaattccggaaggtaacac-3′。所述的檢測(cè)方法為取經(jīng)培養(yǎng)后鑒定為MRSA陽性的臨床樣本分離株，高溫滅活，提取樣本DNA，作為檢測(cè)樣品；取不攜帶QacA基因的金黃色葡萄球菌菌株，高溫滅活，提取樣本DNA，作為陰性對(duì)照品；人工合成QacA序列，構(gòu)建攜帶QacA基因的重組質(zhì)粒為陽性對(duì)照品；進(jìn)行PCR反應(yīng)。本發(fā)明檢測(cè)率高、可重復(fù)性強(qiáng)。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102329886SQ20111033897
公開日2012年1月25日 申請(qǐng)日期2011年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月1日
發(fā)明者傅詠南, 張奕, 王校 申請(qǐng)人:上海中優(yōu)醫(yī)藥高科技有限公司