本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高穩(wěn)定型MazF突變體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

毒素-抗毒素系統(tǒng)(Toxin-Antitoxin system，TA)是原核生物中的一對基因操縱元件，通常為中間有一個(gè)或數(shù)個(gè)堿基重疊的相鄰基因，分別編碼一個(gè)穩(wěn)定的毒素蛋白和不穩(wěn)定的抗毒素，可以在細(xì)菌應(yīng)對各種脅迫條件時(shí)誘導(dǎo)其生長抑制或程序性死亡，具有重要的生理調(diào)節(jié)功能。在典型的TA中，抗毒素基因編碼的不穩(wěn)定抗毒素易被降解，使毒素能夠從毒素-抗毒素復(fù)合物中得以釋放,進(jìn)而發(fā)揮其毒性作用。TA最先發(fā)現(xiàn)于低拷貝質(zhì)粒上，通過“分離后致死”效應(yīng)維持質(zhì)粒的穩(wěn)定傳遞，隨后被發(fā)現(xiàn)大量存在于細(xì)菌的基因組中。毒素蛋白的作用靶標(biāo)很多，已經(jīng)明確的包括破壞細(xì)胞膜、抑制細(xì)胞壁形成、剪切mRNA及rRNA、抑制核糖體亞基的功能及抑制螺旋酶的活性等。其中，對細(xì)胞最重要和常見的毒性表現(xiàn)為對翻譯水平的調(diào)控，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)菌的生長抑制或死亡。

由于基于TA編碼的毒素對細(xì)菌的顯著抑制活性，對其采用人為干預(yù)的方式進(jìn)行激活，釋放毒素進(jìn)而殺死致病菌的抗菌策略已引起了廣泛關(guān)注。與傳統(tǒng)的抗生素治療原理不同，該策略利用了細(xì)菌特有的TA基因元件，由于未經(jīng)過臨床上的篩選壓力，因而在對抗耐藥菌方面有獨(dú)特的優(yōu)勢。此外，這種利用細(xì)菌內(nèi)源毒素的策略不僅對人及其它高等生物的安全性較高，而且不易導(dǎo)致新耐藥菌的產(chǎn)生。

根據(jù)抗毒素與毒素的特性與作用機(jī)制的不同，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的TA可以分為六種類型，其中最為典型的是II型。II型TA的毒素和抗毒素為兩個(gè)相互作用的蛋白，抗毒素通過與毒素的結(jié)合中和毒素的活性。由于抗毒素不穩(wěn)定，易被ClpXP和Lon蛋白酶降解，得以釋放毒素，導(dǎo)致細(xì)菌的生長抑制或死亡。

目前，研究最為充分的II型TA是大腸桿菌來源的mazEF基因元件,分別編碼毒素MazF和抗毒素MazE。MazF是一種特異剪切ACA位點(diǎn)的RNA內(nèi)切酶，可以高效剪切mRNA和rRNA。蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，MazE對MazF的中和作用是通過與MazF形成一個(gè)六聚體結(jié)構(gòu)(包含2個(gè)MazE和4個(gè)MazF)實(shí)現(xiàn)的。由于其機(jī)構(gòu)和活性的深入解析，MazE/MazF被廣泛應(yīng)用于體內(nèi)、體外的抑菌模型及相關(guān)實(shí)驗(yàn)中，對于研究基于TA的新型抗菌(特別是抗耐藥菌)策略具有重要的意義。此外，將MazF蛋白的表達(dá)和激活與病毒相關(guān)的生物信號分子相結(jié)合，在抗HIV和HCV病毒方面也得到了應(yīng)用。

Engelberg-Kulka研究組發(fā)現(xiàn)一種由大腸桿菌產(chǎn)生的群感分子EDF(extracellular death factor)能夠通過作用于mazEF系統(tǒng)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。EDF是一個(gè)序列為NNWNN的五肽，由zwf基因的mRNA經(jīng)過特定剪切及翻譯后ClpXP蛋白酶的修飾而形成，通過與MazF關(guān)鍵位點(diǎn)的結(jié)合抑制MazE/MazF復(fù)合體的形成,從而激活MazF并顯著增強(qiáng)其毒性。Nora R等建立了一種以兩端修飾的嵌合核酸為底物的MazF體外活性評價(jià)方法，該底物中間含有一個(gè)可以被MazF剪切的ACA，通過剪切后底物熒光強(qiáng)度的升高來定量評價(jià)MazF蛋白的活性。采用類似的方法，可以在體外條件下進(jìn)行毒素活性、抗毒素與毒素的相互作用、以及可以干擾TA正常作用的小分子篩選(例如EDF類小分子)等研究工作。

盡管毒素蛋白相對于抗毒素較為穩(wěn)定，但在研究中發(fā)現(xiàn),其自身的穩(wěn)定性不高、活性保持時(shí)間有限，經(jīng)較短時(shí)間的處理或存放會(huì)帶來顯著的活性差異。而毒素蛋白由于自身對宿主菌的毒性，其表達(dá)純化步驟十分復(fù)雜，從而使穩(wěn)定的高活性毒素蛋白的制備成為制約相關(guān)研究工作的瓶頸。因此，根據(jù)結(jié)構(gòu)生物學(xué)信息對毒素蛋白進(jìn)行點(diǎn)突變和定向改造，構(gòu)建高穩(wěn)定性高活性的毒素蛋白具有重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的構(gòu)思是：根據(jù)大腸桿菌來源的MazF毒素蛋白的結(jié)構(gòu)及其與抗毒素MazE及核酸結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)，確定候選的突變位點(diǎn)，擴(kuò)增MazF的系列突變體基因，并通過融合表達(dá)和親和層析獲得MazF突變體。通過體外、體內(nèi)篩選獲得活性保持、穩(wěn)定性大幅提升的MazF突變體，并將其應(yīng)用于相關(guān)的生物醫(yī)學(xué)功能載體中。

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種蛋白質(zhì)。

本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，為如下1)或2)：

1)所示的蛋白為將野生型MazF蛋白氨基酸序列中第48位半胱氨酸進(jìn)行修飾，得到的蛋白；

2)所示的蛋白為將1)所示蛋白的氨基酸序列末端添加標(biāo)簽序列且由1)衍生的蛋白質(zhì)。

上述蛋白質(zhì)中，所述修飾為氨基酸置換。

上述蛋白質(zhì)中，所述氨基酸置換為將第48位的半胱氨酸置換為丙氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸或異亮氨酸。

上述蛋白質(zhì)中，所述野生型MazF蛋白來源于大腸桿菌；

或所述野生型MazF蛋白來源于大腸桿菌，其氨基酸序列為序列2。

編碼上述蛋白的DNA分子也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

含有上述DNA分子的表達(dá)盒、重組載體、重組菌或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種融合蛋白或蛋白組合物。

本發(fā)明提供的融合蛋白或蛋白組合物，包括抗毒素蛋白MazE和權(quán)利要求1-5中任一所述蛋白；

或一種融合蛋白或蛋白組合物，包括抗毒素蛋白MazE部分片段和權(quán)利要求1-5中任一所述蛋白。

上述的融合蛋白或蛋白組合物中，所述抗毒素蛋白MazE源于大腸桿菌；

或所述抗毒素蛋白MazE部分片段為大腸桿菌MazE蛋白C端部分中包括但不限于可中和MazF毒性的氨基酸序列。

上述蛋白或上述的表達(dá)盒、重組載體、重組菌或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系在剪切核酸中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；

或上述蛋白在作為核酸內(nèi)切酶中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；

或上述的蛋白或上述的表達(dá)盒、重組載體、重組菌或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系在制備核酸內(nèi)切酶中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；

或上述蛋白或上述的表達(dá)盒、重組載體、重組菌或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系在抑制細(xì)菌生長或促進(jìn)細(xì)菌死亡中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；

或上述蛋白或上述的表達(dá)盒、重組載體、重組菌或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系在制備抑制細(xì)菌生長或促進(jìn)細(xì)菌死亡產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；

或上述蛋白或上述的表達(dá)盒、重組載體、重組菌或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或上述的融合蛋白在篩選干擾毒素-抗毒素系統(tǒng)相互作用的小分子化合物中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；

或上述蛋白或上述的表達(dá)盒、重組載體、重組菌或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或上述的融合蛋白在制備篩選干擾毒素-抗毒素系統(tǒng)相互作用的小分子化合物產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；

或上述蛋白或上述的表達(dá)盒、重組載體、重組菌或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或上述的融合蛋白或蛋白組合物在構(gòu)建抗性篩選模塊、抗菌載體、抗HIV載體、抗HCV載體或抗腫瘤載體中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；

或上述蛋白或上述的表達(dá)盒、重組載體、重組菌或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或上述的融合蛋白或蛋白組合物在制備構(gòu)建抗性篩選模塊、抗菌載體、抗HIV載體、抗HCV載體或抗腫瘤載體產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；

或本發(fā)明還提供一種產(chǎn)品，其活性成分為上述蛋白或上述的表達(dá)盒、重組載體、重組菌或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或上述的融合蛋白或蛋白組合物。

上述中，所述核酸為RNA或mRNA或DNA或RNA和DNA的結(jié)合體；

或所述產(chǎn)品具有如下1)-4)中至少一種功能：

1)剪切核酸；

2)抑制細(xì)菌生長或促進(jìn)細(xì)菌死亡；

3)篩選干擾毒素-抗毒素系統(tǒng)相互作用的小分子化合物；

4)構(gòu)建抗性篩選模塊、抗菌載體、抗HIV載體、抗HCV載體或抗腫瘤載體。

本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)一個(gè)突變體MazF(C48A)，其較野生型MazF具有更高的穩(wěn)定性，從而可以降低用藥劑量或給藥次數(shù)，可以應(yīng)用于生物技術(shù)及醫(yī)藥領(lǐng)域，用于mazEF基因抗性篩選模塊、篩選MazE/MazF相互作用的干擾分子、抗HIV、抗HCV及抗腫瘤的mazF基因或mazEF操縱子的功能載體構(gòu)建，以及其它可能的醫(yī)藥用途載體。

附圖說明

圖1為MazF及突變體MazF表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染陽性菌株P(guān)CR驗(yàn)證；

泳道1為1000bp Marker，泳道2、3為pET28a-mazE--mazF陽性菌，泳道4、5為pET-mazE-mazF(C48A)陽性菌。

圖2為MazE-MazF融合蛋白PAGE電泳圖。

圖3為純化后MazF突變體PAGE電泳圖。

圖4為MC4100菌株中mazEF操縱子基因敲除；

A，以pKOV重組質(zhì)粒的基因敲除方法示意圖；B，基因敲除的PCR驗(yàn)證。

圖5為過表達(dá)野生型和突變體MazF對細(xì)胞存活率的影響。

圖6為過表達(dá)野生型和突變體MazF對細(xì)胞懸液OD600的影響。

圖7為野生型和突變體MazF對枯草芽孢桿菌總RNA的降解情況。

圖8為經(jīng)不同處理時(shí)間后MazF與MazF(C48A)剪切含ACA位點(diǎn)嵌合核酸底物導(dǎo)致的熒光強(qiáng)度變化情況；柱圖中的每一個(gè)系列，藍(lán)色、紅色、綠色三個(gè)值對應(yīng)的分別為蛋白經(jīng)1、3、7天的低溫保存后反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范疇。

如本文所用，屬于MazE、MazF、MazEF在無特殊說明的情況下均指來源于大腸桿菌K12菌株的mazEF操縱子相應(yīng)的抗毒素、毒素以及抗毒素-毒素復(fù)合體。文中突變體的表示方法為：突變前氨基酸+突變位點(diǎn)+突變后氨基酸，例如C48A，是指在N端第48位的半胱氨酸C突變?yōu)楸彼酇。

如本文所用，MazF(C48A)突變體是指通過氨基酸替換所得到。該突變體的活性與野生型相當(dāng)，但穩(wěn)定性提高了3倍以上，使得以其為組分的各類反應(yīng)體系更為有效。與之相應(yīng)的，mazF(C48A)突變體基因序列，可以應(yīng)用于構(gòu)建抗性篩選模塊、抗病毒功能載體。

若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。

實(shí)施例中所使用的載體、菌株、試劑及其來源：

大腸桿菌MC4100(下面也稱為MC4100(WT)，CGMCC 1.1560)菌株、枯草芽孢桿菌(CGMCC 1.1630)菌株購自中國科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心(CGMCC)，大腸桿菌BW25113(Baba et al,2006)；載體pET28a購自Novagen公司(69864-3CN)，pBAD33購自優(yōu)寶生物(www.youbio.cn)，pKOV質(zhì)粒(Link AJ,Phillips D,Church GM.Methods for generating precise deletions and insertions in the genome of wild-type Escherichia coli:application to open reading frame characterization.J Bacteriol.1997Oct；179(20):6228-37)；限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶菌購自Takara公司；Phanta DNA聚合酶購自諾唯贊公司，抗生素購自Sigma公司。DNA合成與測序均由上海生工生物有限公司完成。PCR擴(kuò)增、酶切、連接、回收、轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取等常規(guī)實(shí)驗(yàn)操作步驟詳見《分子克隆(第三版)》。

實(shí)施例1、MazF突變體的制備

一、表達(dá)大腸桿菌野生型MazF的表達(dá)載體pBAD33-mazF的構(gòu)建

1、MC4100(WT)基因組的提取

①M(fèi)C4100(WT)菌株于LB培養(yǎng)基中，37℃、220rpm過夜培養(yǎng)12-16h；

②取2ml培養(yǎng)菌液，12000rpm離心收集菌體，移液槍吸盡上清培養(yǎng)基；

③向菌體沉淀中加入200μl Buffer GA，渦旋振蕩重懸；

④加入20μl蛋白酶K，移液槍吹打混勻，使菌體蛋白徹底裂解；

⑤加入220μl Buffer GB，振蕩15s，70℃金屬浴10min，溶液澄清透亮；

⑥簡短離心，加入220μl無水乙醇，渦旋振蕩15s，產(chǎn)生少許絮狀沉淀；

⑦簡短離心，將上述溶液和絮狀沉淀都加入吸附柱中，12000rpm離心30s，倒掉廢液，將吸附柱放入收集管中，加入500μl Buffer GD，12000rpm離心30s，棄廢液；

⑧向吸附柱中加入600μl漂洗液PW，12000rpm離心30s，棄廢液，重復(fù)一遍；

⑨12000rpm空管離心2min后，吸附柱于室溫敞口放置5-10min；

⑩將吸附柱置于干凈的離心管中，加入50-100μl的洗脫液滅菌蒸餾水，室溫靜置2min，12000rpm離心2min，即得到MC4100(WT)的基因組。

2、擴(kuò)增大腸桿菌野生型mazF基因

①設(shè)計(jì)擴(kuò)增mazF片段的正反向引物；

mazF-F：5’-GAGGTACCATGGTAAGCCGATACGTAC-3’(KpnI)

mazF-R：5’-AACTGCAGCTACCCAATCAGTACGTT-3’(PstI)

②以高保真DNA聚合酶Phanta PCR擴(kuò)增mazF基因片段；

反應(yīng)體系(50μl體系)：2×Phanta Max Buffer 25μl，10mM dNTP Mix 1μl，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1μl，MC4100基因組1μl，mazF-F和mazF-R各5μl，滅菌蒸餾水17μl；

反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3min；95℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；最后72℃徹底延伸5min。

反應(yīng)結(jié)束后，利用瓊脂糖凝膠來回收DNA產(chǎn)物。

(3)用限制性內(nèi)切酶KpnI/PstI對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和pBAD33質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切；

反應(yīng)條件如下：

pBAD33雙酶切(100μl體系)：質(zhì)粒pBAD33(4-5μg)，KpnI/PstI 5μl/5μl，10×Buffer 10μl，滅菌蒸餾水50μl；

mazF片段雙酶切(50μl體系)：mazF 20μl(1-2μg)，KpnI/PstI 2μl/2μl，10×Buffer 5μl，滅菌蒸餾水21μl；

37℃水浴反應(yīng)1-2h。

(4)乙醇沉淀法回收酶切產(chǎn)物

①每100μl酶切體系加400μl滅菌蒸餾水和150μl中酚，充分混勻，12000rpm離心5min；

②小心吸取上層清液至無菌的EP管，加入150μl氯仿充分混勻，12000rpm離心5min；

③用移液槍吸取上清于另一無菌的EP管，加入48μl乙酸鈉(3M，pH4.7)混勻，再加入4μl糖原(10mg/ml)混勻，最后加入850μl無水乙醇，充分混勻；

④將混合放入-20℃冰箱靜置1h以上，在4℃條件下，12000rpm離心10min，出現(xiàn)白色絮狀沉淀；

⑤用700μl 70％乙醇漂洗兩遍，12000rpm離心2min，室溫下?lián)]干，加入65℃預(yù)熱的無菌蒸餾水15μl，重新溶解片段，用吸光光度法測量片段濃度和純度。

(5)T4連接酶連接線性化載體與片段

連接體系設(shè)為10μl：質(zhì)粒片段1μl，mazF片段1μl，10×Buffer 1μl，T4DNA Ligase 0.2μl，無菌蒸餾水6.8μl，在22℃條件下連接1-2h，直接進(jìn)行轉(zhuǎn)化或-20℃保存。

(6)熱激轉(zhuǎn)化

①-80℃保存的DH5α感受態(tài)細(xì)胞于冰上解凍，同時(shí)將連接產(chǎn)物在冰上預(yù)冷；

②將2μl連接產(chǎn)物加入50μl感受態(tài)細(xì)胞中混勻，冰浴30min；

③42℃熱激80s，立即加入800μl LB或SOC液體培養(yǎng)基，冰浴2-3min；

④37℃、200rpm，復(fù)蘇轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞1h后，取300μl菌液涂布LB平板(氯霉素30μg/ml)，37℃倒置培養(yǎng)。

(7)菌落PCR驗(yàn)證

①設(shè)置反應(yīng)體系(10μl體系)：2×Taq Master Mix 5μl，引物對pBAD33F/R各1μl，無菌蒸餾水3μl；

②隨機(jī)挑選7個(gè)克隆于7個(gè)反應(yīng)體系中，并以空質(zhì)粒pBAD33作為對照；

③PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)；72℃徹底延伸5min；

④1％瓊脂糖凝膠，110V電泳20min(陽性菌落PCR產(chǎn)物在膠上位置應(yīng)為300bp左右)。

(8)測序驗(yàn)證

挑取陽性克隆，接至3ml LB培養(yǎng)基氯(霉素30μg/ml)中，37℃溫度下220rpm過夜培養(yǎng)，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。

以pBAD33通用引物pBAD-F(引物序列：ATGCCATAGCATTTTTATCC)測定質(zhì)粒DNA序列，測序結(jié)果如下：

該質(zhì)粒為將序列1所示的野生型MazF基因替換pBAD33載體的KpnI和PstI酶切位點(diǎn)間的片段得到的質(zhì)粒，命名為pBAD33-mazF，該質(zhì)粒表達(dá)野生型MazF基因。

野生型MazF基因的核苷酸序列為序列1，該基因表達(dá)的野生型MazF蛋白的氨基酸序列為序列2。

用Blast序列比對軟件比對無誤后，繼續(xù)后續(xù)工作。

二、表達(dá)突變體MazF(mutant)的表達(dá)載體pBAD-mazF(mutant)的構(gòu)建

根據(jù)大腸桿菌來源的MazF毒素蛋白的結(jié)構(gòu)及其與抗毒素MazE及核酸結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)，確定候選的突變位點(diǎn)：15、29、48、50、79、81、86位氨基酸為可能的定點(diǎn)突變位點(diǎn)，通過overlap PCR反應(yīng)構(gòu)建突變體載體。

(1)引物設(shè)計(jì)

以突變堿基為中心，overlap堿基為19bp，非重疊區(qū)域?yàn)橄嗤?2bp，引物序列如下：

mazF V15A(F)：5’-GGCGATCTGATTTGGGCTGATTTTGACCC-3’

mazF V15A(R)：5’-GCCCAAATCAGATCGCCCATATCGGGTAC-3’

mazF R29A(F)：5’-CGAGCAAGCTGGACATGCTCCAGCTGTTGT-3’

mazF R29A(R)：5’-GCATGTCCAGCTTGCTCGCTACCTTTTGTC-3’

mazF C48A(F)：5’-CAAAACAGGTATGTGTCTGGCTGTTCCTTGTAC-3’

mazF C48A(R)：5’-GCCAGACACATACCTGTTTTGTTGTTGTACATG-3’

mazF P50A(F)：5’-TATGTGTCTGTGTGTTGCTTGTACAACGC-3’

mazF P50A(R)：5’-CAACACACAGACACATACCTGTTTTGTTG-3’

mazF K79A(F)：5’-CGTTAGCTGATCAGGTAGCAAGTATCGCCTG-3’

mazF K79A(R)：5’-GCTACCTGATCAGCTAACGCTACGCCATCAC-3’

mazF I81A(F)：5’-CTGATCAGGTAAAAAGTGCCGCCTGGCGGGC-3’

mazF I81A(R)：5’-GCACTTTTTACCTGATCAGCTAACGCTACGC-3’

mazF R86A(F)：5’-TATCGCCTGGCGGGCAGCAGGAGCAACGAAG-3’

mazF R86A(R)：5’-GCTGCCCGCCAGGCGATACTTTTTACCTGATC-3’

(2)以上述一構(gòu)建的pBAD33-mazF質(zhì)粒為模板，用上述(1)的引物對分別進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到多個(gè)PCR產(chǎn)物。

上述反應(yīng)的體系(50μl體系)如下：

質(zhì)粒模板0.5μl(PAGE純化),引物對F/R 2μl，5×Fast Alteration Buffer 10μl，DNA Polymerase 1.5μl，滅菌蒸餾水34μl；

反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性2min；94℃變性20s，55℃退火10s，68℃延伸2.5min，20個(gè)循環(huán)；68℃徹底延伸5min。

(3)質(zhì)粒模板pBAD33-mazF的消化降解

向50μl上述獲得的每個(gè)PCR產(chǎn)物中加入1μl DpnI酶并混勻，37℃反應(yīng)1.5h，徹底降解模板DNA。

(4)熱激轉(zhuǎn)化與陽性克隆篩選

將5μl酶消化產(chǎn)物加入50μl感受態(tài)細(xì)胞中混勻，冰浴30min以上；隨后42℃熱激80s，冰浴2.5min，最后向EP管中加入1ml SOC培養(yǎng)基，180rpm、37℃復(fù)蘇1h。取200μl復(fù)蘇后的菌液涂布LB平板(氯霉素30μg/ml)。

菌液提取質(zhì)粒測序驗(yàn)證同上述一。

結(jié)果如下：

質(zhì)粒pBAD33-mazF V15A為將pBAD33-mazF質(zhì)粒中的野生型基因mazF替換為突變基因mazF V15A得到的質(zhì)粒，該質(zhì)粒表達(dá)突變蛋白MazF V15A。

突變基因mazF V15A的核苷酸序列為將野生型基因mazF核苷酸序列第44位的T替換為C，得到的序列。

突變蛋白MazF V15A的氨基酸序列為將野生型蛋白MazF氨基酸序列第15位的Val替換為Ala，得到的序列。

質(zhì)粒pBAD33-mazF R29A為將pBAD33-mazF質(zhì)粒中的野生型基因mazF替換為突變基因mazF R29A得到的質(zhì)粒，該質(zhì)粒表達(dá)突變蛋白MazF R29A。

突變基因mazF R29A的核苷酸序列為將野生型基因mazF核苷酸序列第85-86位的CG替換為GC，得到的序列。

突變蛋白MazF R29A的氨基酸序列為將野生型蛋白MazF氨基酸序列第29位的Arg替換為Ala，得到的序列。

質(zhì)粒pBAD33-mazF C48A為將pBAD33-mazF質(zhì)粒中的野生型基因mazF替換為突變基因mazF C48A得到的質(zhì)粒，該質(zhì)粒表達(dá)突變蛋白MazF C48A(序列3)。

突變基因mazF C48A的核苷酸序列為將野生型基因mazF核苷酸序列第142-143位的TG替換為GC，得到的序列。

突變蛋白MazF C48A的氨基酸序列為將野生型蛋白MazF氨基酸序列第48位的Cys替換為Ala，得到的序列(序列4)。

質(zhì)粒pBAD33-mazF P50A為將pBAD33-mazF質(zhì)粒中的野生型基因mazF替換為突變基因mazF P50A得到的質(zhì)粒，該質(zhì)粒表達(dá)突變蛋白MazF P50A。

突變基因mazF P50A的核苷酸序列為將野生型基因mazF核苷酸序列第148位的C替換為G，得到的序列。

突變蛋白MazF P50A的氨基酸序列為將野生型蛋白MazF氨基酸序列第50位的Pro替換為Ala，得到的序列。

質(zhì)粒pBAD33-mazF K79A為將pBAD33-mazF質(zhì)粒中的野生型基因mazF替換為突變基因mazF K79A得到的質(zhì)粒，該質(zhì)粒表達(dá)突變蛋白MazF K79A。

突變基因mazF K79A的核苷酸序列為將野生型基因mazF核苷酸序列第235-236位的AA替換為GC，得到的序列。

突變蛋白MazF K79A的氨基酸序列為將野生型蛋白MazF氨基酸序列第79位的Lys替換為Ala，得到的序列。

質(zhì)粒pBAD33-mazF I81A為將pBAD33-mazF質(zhì)粒中的野生型基因mazF替換為突變基因mazFI81A得到的質(zhì)粒，該質(zhì)粒表達(dá)突變蛋白MazFI81A。

突變基因mazF I81A的核苷酸序列為將野生型基因mazF核苷酸序列第238-239位的AT替換為GC，得到的序列。

突變蛋白MazFI81A的氨基酸序列為將野生型蛋白MazF氨基酸序列第81位的Ile替換為Ala，得到的序列。

質(zhì)粒pBAD33-mazF R86A為將pBAD33-mazF質(zhì)粒中的野生型基因mazF替換為突變基因mazFR86A得到的質(zhì)粒，該質(zhì)粒表達(dá)突變蛋白MazF R86A。

突變基因mazF R86A的核苷酸序列為將野生型基因mazF核苷酸序列第256-257位的AT替換為GC，得到的序列。

突變蛋白MazF R86A的氨基酸序列為將野生型蛋白MazF氨基酸序列第86位的Arg替換為Ala，得到的序列。

實(shí)施例2、表達(dá)突變體MazF(C48A)的表達(dá)載體的構(gòu)建

本實(shí)施例中，根據(jù)研究目的的不同，分別構(gòu)建兩套表達(dá)載體：一種為單獨(dú)表達(dá)載體pET28a-mazF(his)₆及pET28a-mazF(C48A)-(his)₆質(zhì)粒及其菌株BL21(DE3)，主要用于誘導(dǎo)表達(dá)毒素，評估毒素的體內(nèi)活性；另外一種為融合表達(dá)載體pET28a-mazE^--mazF(his)₆及pET28a-mazE^--mazF(C48A)-(his)₆的構(gòu)建及其表達(dá)菌株BL21(DE3)，主要用于過表達(dá)毒素和抗毒素的融合蛋白，進(jìn)行毒蛋白的分離純化。

一、pET28a-mazF(his)₆及pET28a-mazF(C48A)-(his)₆質(zhì)粒的構(gòu)建

①引物設(shè)計(jì)：

mazF-2(F)：5’-TGCCATGGTAAGCCGATACGTAC(NcoI)-3’

mazF-2(R)：5’-CTCGAGCCCAATCAGTACGTTAATT(XhoI)-3’

②以高保真DNA聚合酶Phanta PCR擴(kuò)增野生型mazF基因或突變體mazF基因；反應(yīng)體系(50μl體系)：2×Phanta Master Mix 25μl，mazF-2F/R 5μl，pBAD33-mazF或pBAD33-mazF(C48A)質(zhì)粒模板，滅菌蒸餾水14μl；

反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3min；95℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)；72℃徹底延伸5min，4℃保存；

③膠回收mazF及mazF(C48A)片段(DNA純化回收試劑盒)，同實(shí)施例1；

④NcoI/XhoI雙酶切目的基因片段及pET28a質(zhì)粒載體

pET28a質(zhì)粒雙酶切(50μl體系)：質(zhì)粒pET28a 2.5μg，NcoI/XhoI 3μl/3μl，10×Buffer 5μl，滅菌蒸餾水19μl；mazF或mazF(C48A)片段雙酶切(50μl體系)：mazF 10μl(1-1.5μg)，NcoI/XhoI 2μl/2μl，10×Buffer 5μl，滅菌蒸餾水31μl，37℃水浴1-2h；

⑤酶切產(chǎn)物回收，同實(shí)施例1；

⑥T4連接酶連接

雙酶切片段的連接(10μl體系)：質(zhì)粒片段1μl，mazF片段0.5μl，10×Buffer1μl，T4DNA Ligase 0.3μl，滅菌蒸餾水7.2μl；反應(yīng)體系在22℃水浴中反應(yīng)1h；

⑦熱激轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)(同實(shí)施例1)，通過菌落PCR篩選陽性菌落，并接菌至3ml新鮮LB(卡那霉素50μg/ml)中過夜培養(yǎng)，采用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，采用pET28a質(zhì)粒的通用測序引物T7(T7引物序列：TAATACGACTCACTATAGGG)確認(rèn)基因的正確插入。

得到如下兩種質(zhì)粒：

質(zhì)粒pET28a-mazF(his)₆為將基因mazF替換pET28a載體的NcoI和XhoI雙酶切位點(diǎn)間得到的質(zhì)粒，表達(dá)融合蛋白MazF(his)₆(His標(biāo)簽為載體自帶序列)。

融合基因mazF(his)₆的核苷酸序列為將野生型基因mazF核苷酸序列的3’末端添加6個(gè)his密碼子得到的序列。

融合蛋白MazF(his)₆的氨基酸序列為將野生型蛋白MazF氨基酸序列的C末端添加6個(gè)his得到的序列。

質(zhì)粒pET28a-mazF(C48A)(his)₆為將基因mazF(C48A)替換pET28a載體的NcoI和XhoI雙酶切位點(diǎn)間得到的質(zhì)粒，表達(dá)融合蛋白MazF(his)₆。

融合基因mazF(C48A)(his)₆的核苷酸序列為將突變體基因mazF(C48A)核苷酸序列的3’末端添加6個(gè)his密碼子得到的序列。

融合蛋白MazF(C48A)(his)₆的氨基酸序列為將突變體MazF(C48A)氨基酸序列的C末端添加6個(gè)his得到的序列。

采用上述方法制備如下質(zhì)粒：

質(zhì)粒pET28a-mazF(V15A)(his)₆為將基因mazF(V15A)替換pET28a載體的NcoI和XhoI雙酶切位點(diǎn)間得到的質(zhì)粒，表達(dá)融合蛋白MazF(his)₆。

融合基因mazF(V15A)(his)₆的核苷酸序列為將突變體基因mazF(V15A)核苷酸序列的3’末端添加6個(gè)his密碼子得到的序列。

融合蛋白MazF(V15A)(his)₆的氨基酸序列為將突變體MazF(V15A)氨基酸序列的C末端添加6個(gè)his得到的序列。

質(zhì)粒pET28a-mazF(R29A)(his)₆為將基因mazF(R29A)替換pET28a載體的NcoI和XhoI雙酶切位點(diǎn)間得到的質(zhì)粒，表達(dá)融合蛋白MazF(his)₆。

融合基因mazF(R29A)(his)₆的核苷酸序列為將突變體基因mazF(R29A)核苷酸序列的3’末端添加6個(gè)his密碼子得到的序列。

融合蛋白MazF(R29A)(his)₆的氨基酸序列為將突變體MazF(R29A)氨基酸序列的C末端添加6個(gè)his得到的序列。

質(zhì)粒pET28a-mazF(P50A)(his)₆為將基因mazF(R29A)替換pET28a載體的NcoI和XhoI雙酶切位點(diǎn)間得到的質(zhì)粒，表達(dá)融合蛋白MazF(his)₆。

融合基因mazF(P50A)(his)₆的核苷酸序列為將突變體基因mazF(R29A)核苷酸序列的3’末端添加6個(gè)his密碼子得到的序列。

融合蛋白MazF(P50A)(his)₆的氨基酸序列為將突變體MazF(R29A)氨基酸序列的C末端添加6個(gè)his得到的序列。

質(zhì)粒pET28a-mazF(K79A)(his)₆為將基因mazF(K79A)替換pET28a載體的NcoI和XhoI雙酶切位點(diǎn)間得到的質(zhì)粒，表達(dá)融合蛋白MazF(his)₆。

融合基因mazF(K79A)(his)₆的核苷酸序列為將突變體基因mazF(K79A)核苷酸序列的3’末端添加6個(gè)his密碼子得到的序列。

融合蛋白MazF(K79A)(his)₆的氨基酸序列為將突變體MazF(K79A)氨基酸序列的C末端添加6個(gè)his得到的序列。

質(zhì)粒pET28a-mazF(I81A)(his)₆為將基因mazF(I81A)替換pET28a載體的NcoI和XhoI雙酶切位點(diǎn)間得到的質(zhì)粒，表達(dá)融合蛋白MazF(his)₆。

融合基因mazF(I81A)(his)₆的核苷酸序列為將突變體基因mazF(I81A)核苷酸序列的3’末端添加6個(gè)his密碼子得到的序列。

融合蛋白MazF(I81A)(his)₆的氨基酸序列為將突變體MazF(I81A)氨基酸序列的C末端添加6個(gè)his得到的序列。

質(zhì)粒pET28a-mazF(R86A)(his)₆為將基因mazF(R86A)替換pET28a載體的NcoI和XhoI雙酶切位點(diǎn)間得到的質(zhì)粒，表達(dá)融合蛋白MazF(his)₆。

融合基因mazF(R86A)(his)₆的核苷酸序列為將突變體基因mazF(R86A)核苷酸序列的3’末端添加6個(gè)his密碼子得到的序列。

融合蛋白MazF(R86A)(his)₆的氨基酸序列為將突變體MazF(R86A)氨基酸序列的C末端添加6個(gè)his得到的序列。

二、融合表達(dá)載體pET28a-mazE^--mazF(his)₆及pET28a-mazE^--mazF(C48A)-(his)₆的構(gòu)建

載體構(gòu)建的思路是先將mazE(42-82)基因和mazF基因通過一個(gè)linker連接，形成一個(gè)融合蛋白，從而中和MazF蛋白的毒性，實(shí)現(xiàn)融合蛋白的大量表達(dá)；其次，表達(dá)完成后，通過酶切反應(yīng)將兩個(gè)蛋白分離，純化得到目的蛋白。

①引物設(shè)計(jì)

擴(kuò)增mazE(42-82)引物對A/B及擴(kuò)增mazF或mazF(C48A)引物對C/D，引物B和C部分序列堿基互補(bǔ)，且兩個(gè)片段之間有一個(gè)Factor Xa酶切位點(diǎn)(linker)。引物序列為：

A：5’-TGCCATGGGCTTAATTATTGAGCCAGTGC-3’(NcoI)

B：5’-GGATCCACGACCTTCAATACCTCCCCAGACTTCCTTATCTTT-3’

C：5’-GGAGGTATTGAAGGTCGTGGATCCGGGATGGTAAGCCGATACGT-3’

D：5’-CTCGAGCCCAATCAGTACGTTAATT-3’(XhoI)

②融合片段mazE^--mazF(his)₆及mazE^--mazF(C48A)-(his)₆的構(gòu)建

1)片段mazE(42-82)+linker

反應(yīng)體系(50μl體系)：2×Phanta Master Mix 25μl，引物對A/B 5μl，MC4100基因組1μl，滅菌蒸餾水14μl；

反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3min；95℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；72℃徹底延伸5min；

膠回收試劑盒回收147bp引物對A/B擴(kuò)增片段，同實(shí)施例1；

2)片段linker+mazF及l(fā)inker+mazF(C48A)的構(gòu)建

反應(yīng)體系(50μl體系)：2×Phanta Master Mix 25μl，引物對C/D 5μl，pBAD33-mazF或pBAD33-mazF(C48A)1μl，滅菌蒸餾水14μl；

反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3min；95℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；72℃徹底延伸5min；

膠回收試劑盒回收360bp引物對C/D擴(kuò)增片段或360bp引物對C/D擴(kuò)增片段，同實(shí)施例1；

3)片段連接

反應(yīng)體系(50μl體系)：2×Phanta Master Mix 25μl，引物對A/D 5μl，引物對A/B擴(kuò)增片段0.5μl和不同大小的引物對C/D擴(kuò)增片段0.5μl，滅菌蒸餾水14μl；

反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；72℃徹底延伸5min；

得到擴(kuò)增片段mazE^--linker+mazF和mazE^-linker+mazF(C48A)。

③酶切

分別用NcoI和XhoI雙酶切擴(kuò)增片段mazE^--linker+mazF、mazE^--linker+mazF(C48A)和pET28a載體；回收酶切產(chǎn)物。

④T4DNA連接酶分別將上述mazE^--linker+mazF酶切產(chǎn)物、mazE^-linker+mazF(C48A)酶切產(chǎn)物與載體酶切產(chǎn)物連接，連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在卡那霉素抗性的LB平板上過夜培養(yǎng)，PCR驗(yàn)證陽性克隆(引物為T7，圖1，mazF代表mazE^--linker+mazF酶切產(chǎn)物與載體的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的菌落，mazF(C48A)代表mazE^--linker+mazF酶切產(chǎn)物與載體的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的菌落)；挑取陽性克隆過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并測序確認(rèn)表達(dá)載體的DNA序列。

得到如下兩種質(zhì)粒質(zhì)粒pET28a-mazE^--mazF(his)₆和質(zhì)粒pET28a-mazE^--mazF(C48A)(his)₆：

質(zhì)粒pET28a-mazE^--mazF(his)₆為將融合基因mazE^--mazF替換pET28a載體(載體自帶(his)₆)的NcoI和XhoI雙酶切位點(diǎn)間得到的質(zhì)粒，表達(dá)融合蛋白MazE^--MazF(his)₆。

融合基因mazE^--mazF依次由突變基因mazE^-、連接肽編碼基因和野生型mazF基因組成；融合基因mazE^--mazF(his)₆的核苷酸序列為序列5；其中序列5第1-123位為突變基因mazE^-，第124-150位為連接肽編碼基因，第151-483位為野生型mazF基因。

融合蛋白mazE^--mazF(his)₆依次由突變體MazE^-、連接肽、野生型MazF蛋白和6個(gè)his組成；融合蛋白MazE^--MazF(his)₆的氨基酸序列為序列6；其中序列6第1-41位為突變體MazE^-，第42-50位為連接肽，第51-163位為野生型MazF蛋白，第166-171位為6個(gè)his。

質(zhì)粒pET28a-mazE^--mazF(C48A)(his)₆為將融合基因mazE^--mazF(C48A)替換pET28a載體的NcoI和XhoI雙酶切位點(diǎn)間得到的質(zhì)粒，表達(dá)融合蛋白MazE^--MazF(C48A)(his)₆。

融合基因mazE^--mazF(C48A)依次由突變基因mazE^-、連接肽編碼基因和突變基因mazF(C48A)組成；融合基因mazE^--mazF(C48A)(his)₆的核苷酸序列為序列7；其中序列7第1-123位為突變基因mazE^-，第124-150位為連接肽編碼基因，第151-483位為突變基因mazF(C48A)。

融合蛋白MazE^--MazF(C48A)(his)₆依次由突變體MazE^-、連接肽、突變蛋白mazF(C48A)和6個(gè)his組成；融合蛋白MazE^--MazF(his)₆的氨基酸序列為序列8；其中序列8第1-41位為突變體MazE^-，第42-50位為連接肽，第51-163位為突變蛋白MazF(C48A)，第166-171位為6個(gè)his。

采用同樣的方法制備表達(dá)其他融合蛋白突變體的載體：質(zhì)粒pET28a-mazE^--mazF(V15A)(his)₆、質(zhì)粒pET28a-mazE^--mazF(R29A)(his)₆、質(zhì)粒pET28a-mazE^--mazF(P50A)(his)₆、質(zhì)粒pET28a-mazE^--mazF(K79A)(his)₆、質(zhì)粒pET28a-mazE^--mazF(I81A)(his)₆、質(zhì)粒pET28a-mazE^--mazF(R86A)(his)₆。

實(shí)施例3、MazF突變體體內(nèi)活性分析

一、MazF及突變體MazF(C48A)的體內(nèi)毒性評價(jià)方法一

1、重組菌的構(gòu)建

1)、MC4100菌株mazEF操縱子的敲除構(gòu)建MC4100(ΔmazEF)

MC4100(ΔmazEF)為將大腸桿菌MC4100菌株基因組中的mazEF基因敲除，得到重組菌MC4100(ΔmazEF)。

具體構(gòu)建如下:

根據(jù)大腸桿菌基因組序列信息，在mazEF的兩側(cè)分別選取500bp左右的同源臂(左右兩側(cè)同源臂的序列分別為序列9和10)，通過overlap PCR的方法將同源臂連接，進(jìn)而克隆進(jìn)pKOV同源重組質(zhì)粒。然后將構(gòu)建好的質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入MC4100感受態(tài)細(xì)胞中，在LB培養(yǎng)基中30℃復(fù)蘇1h，隨后取100μl涂布LB平板(氯霉素34μg/ml)，43℃過夜培養(yǎng)。挑取生長狀態(tài)良好的1-5個(gè)單克隆，重懸于1ml的LB培養(yǎng)基中，稀釋10⁴-10⁵倍，涂布于5％sucrose的LB平板上，30℃過夜篩選。挑取克隆，分別在LB和LB+5％sucrose的平板上，反篩。最后利用PCR驗(yàn)證陽性菌落。基本原理參照圖4。圖中，A為同源臂設(shè)計(jì)與pKOV質(zhì)粒的構(gòu)建原理示意圖；B為基因敲除菌的陽性驗(yàn)證，上圖為驗(yàn)證引物的設(shè)計(jì)方法，下圖為分別以AD和BC為引物驗(yàn)證敲除菌(-，泳道3、5，)和野生菌(+，泳道2,、4)的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，泳道1為marker。從結(jié)果可以明顯看到，敲除菌中不再含有mazEF操縱子序列。

2)、MC4100(ΔmazEF)菌株感受態(tài)的制備

①M(fèi)C4100(ΔmazEF)菌株接入新鮮的LB培養(yǎng)基中，37℃、220rpm過夜復(fù)蘇；

②取過夜復(fù)蘇菌液0.5ml(1:100)接菌50ml LB液體培養(yǎng)基，至生長對數(shù)期(OD600＝0.4)；

③培養(yǎng)菌液轉(zhuǎn)移至無菌離心管中，冰浴10min，4℃、4000rpm離心10min收集菌體；

④棄上層清液，加入30ml預(yù)冷的0.1M CaCl₂-MgCl₂(1:4)緩沖液洗滌，4℃、4000rpm離心10min；

⑤棄上層清液，加入2ml預(yù)冷的CaCl₂溶液重懸，分裝成100μl每管，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3)、重組菌構(gòu)建

重組菌MC4100(ΔmazEF)/pBAD33-mazF為將實(shí)施例1構(gòu)建好的pBAD33-mazF導(dǎo)入MC4100(ΔmazEF)中得到的菌。

重組菌MC4100(ΔmazEF)/pBAD33-mazF(C48A)為將實(shí)施例1構(gòu)建好的pBAD33-mazF(C48A)導(dǎo)入MC4100(ΔmazEF)中得到的菌。

重組菌pBAD為將空載體pBAD33導(dǎo)入MC4100(ΔmazEF)中得到的菌。

重組菌MazF為將質(zhì)粒pBAD33-mazF導(dǎo)入MC4100(ΔmazEF)中得到的菌。

重組菌R29A為將質(zhì)粒pBAD33-mazFR29A導(dǎo)入MC4100(ΔmazEF)中得到的菌。

重組菌C48A為將質(zhì)粒pBAD33-mazFC48A導(dǎo)入MC4100(ΔmazEF)中得到的菌。

重組菌K79A為將質(zhì)粒pBAD33-mazFK79A導(dǎo)入MC4100(ΔmazEF)中得到的菌。

重組菌R86A為將質(zhì)粒pBAD33-mazFR86A導(dǎo)入MC4100(ΔmazEF)中得到的菌。

上述重組菌的制備方法如下：將構(gòu)建好的質(zhì)粒，熱激轉(zhuǎn)化導(dǎo)入MC4100(ΔmazEF)后，在1ml無菌LB培養(yǎng)基中復(fù)蘇1h，取200μl菌液涂布平板(氯霉素30μg/ml)，37℃恒溫培養(yǎng)過夜，利用Taq酶PCR驗(yàn)證陽性菌落，得到重組菌。

2、L-阿拉伯糖誘導(dǎo)毒素過表達(dá)

重組菌MC4100(ΔmazEF)/pBAD33-mazF和重組菌MC4100(ΔmazEF)/pBAD33-mazF(C48A)過夜復(fù)蘇菌液，按照1:100分別轉(zhuǎn)接至6ml M9液體培養(yǎng)基(0.5％甘油和0.2％氨基酸混合物)，50ml試管37℃、220rpm培養(yǎng)，至對數(shù)生長期OD600為0.5，加入誘導(dǎo)劑L-阿拉伯糖至質(zhì)量百分含量為0.1％誘導(dǎo)培養(yǎng)，每隔一段時(shí)間(0min、30min、60min、120min……)取樣進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)；

3、細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)

分別取重組菌MC4100(ΔmazEF)/pBAD33-mazF和重組菌MC4100(ΔmazEF)/pBAD33-mazF(C48A)誘導(dǎo)后不同時(shí)間培養(yǎng)菌液加入900μl LB液體培養(yǎng)基，吹打混勻，并顛倒徹底混合均勻(10^-1倍)；重復(fù)上述步驟五次，梯度稀釋菌液(10^-2-10^-6)；取各個(gè)稀釋濃度的菌液5μl點(diǎn)樣LB固體培養(yǎng)基(氯霉素30μg/ml，葡萄糖0.2％)；37℃恒溫培養(yǎng)12h后計(jì)數(shù)生長的菌落。

將未加阿拉伯糖誘導(dǎo)的菌液作為對照，分析毒素過表達(dá)不同時(shí)間之后存活細(xì)菌的數(shù)量，數(shù)量越多，說明毒素活性越弱。

結(jié)果如圖5所示，MazF表示重組菌MC4100(ΔmazEF)/pBAD33-mazF，C48A表示表示重組菌MC4100(ΔmazEF)/pBAD33-mazFC48A，表明，MazF(C48A)與MazF活性相當(dāng)，均能抑制大腸桿菌MC4100生長。

將實(shí)施例1中的其余突變載體和空載體pBAD33導(dǎo)入的重組菌均按照上述方法實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖5，可以看出，其它突變體的活性明顯低于野生型，即相應(yīng)點(diǎn)突變對MazF活性具有較大影響。

二、MazF及MazF(C48A)的體內(nèi)毒性評價(jià)方法二

1、重組菌的構(gòu)建

重組菌mazF為將實(shí)施例2構(gòu)建好的pET28a-mazF(his)₆導(dǎo)入BL21(DE3)中得到的菌。

重組菌C48A為將實(shí)施例2構(gòu)建好的pET28a-mazF(C48A)-(his)₆導(dǎo)入BL21(DE3)中得到的菌。

重組菌V15A為將實(shí)施例2構(gòu)建好的pET28a-mazF(V15A)-(his)₆導(dǎo)入BL21(DE3)中得到的菌。

重組菌R29A為將實(shí)施例2構(gòu)建好的pET28a-mazF(R29A)-(his)₆導(dǎo)入BL21(DE3)中得到的菌。

重組菌P50A為將實(shí)施例2構(gòu)建好的pET28a-mazF(P50A)-(his)₆導(dǎo)入BL21(DE3)中得到的菌。

重組菌K79A為將實(shí)施例2構(gòu)建好的pET28a-mazF(K79A)-(his)₆導(dǎo)入BL21(DE3)中得到的菌。

重組菌I81A為將實(shí)施例2構(gòu)建好的pET28a-mazF(I81A)-(his)₆導(dǎo)入BL21(DE3)中得到的菌。

重組菌R86A為將實(shí)施例2構(gòu)建好的pET28a-mazF(R86A)-(his)₆導(dǎo)入BL21(DE3)中得到的菌。

2、誘導(dǎo)檢測

將上述1的重組菌分別過夜復(fù)蘇；按照1:100轉(zhuǎn)接于6ml LB培養(yǎng)基，37℃、220rpm培養(yǎng)至對數(shù)生長期OD600為0.5，加入誘導(dǎo)劑IPTG至1mM誘導(dǎo)毒素基因表達(dá)；每隔一段時(shí)間(0h、0.5h、1h、2h、3h、4h)取樣測其OD600，繪制生長曲線；

隨著毒素的表達(dá)，同誘導(dǎo)的空質(zhì)粒相比，毒素表達(dá)導(dǎo)致細(xì)菌生長基本停滯。不同突變體表達(dá)對細(xì)菌生長的影響如圖6所示，各突變體的活性存在顯著差異，其中，MazF(C48A)與MazF活性相當(dāng)(250min對應(yīng)的最下面兩個(gè)點(diǎn)所在的線)。

實(shí)施例4、MazF及MazF(C48A)的表達(dá)與純化

一、重組菌的制備

重組菌BL21(DE3)/pET28a-mazE^--mazF(his)₆為將實(shí)施例2中制備的質(zhì)粒pET28a-mazE^--mazF(his)₆導(dǎo)入BL21(DE3)得到的重組菌。

重組菌BL21(DE3)/pET28a-mazE^--mazF(C48A)-(his)₆為將實(shí)施例2中制備的質(zhì)粒pET28a-mazE^--mazF(C48A)-(his)₆導(dǎo)入BL21(DE3)得到的重組菌。

二、表達(dá)

將重組菌BL21(DE3)/pET28a-mazE^--mazF(his)₆和重組菌BL21(DE3)/pET28a-mazE^--mazF(C48A)-(his)₆過夜復(fù)蘇；按照1:100轉(zhuǎn)接于100ml LB培養(yǎng)基，在500ml三角瓶中37℃、220rpm培養(yǎng)至對數(shù)生長期(OD600＝0.5)，加入IPTG至1mM，30℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4h；4℃、8000rpm離心10min收集菌體，于-80℃保存?zhèn)溆?，?shí)現(xiàn)目的蛋白的表達(dá)。

三、MazF(His)₆及MazF(C48A)-(His)₆親和層析純化

①8ml預(yù)冷的結(jié)合液(50mM Tris-HCl,300mM NaCl,10mM imidazole,pH8.0)分別加入凍存的誘導(dǎo)后重組菌BL21(DE3)/pET28a-mazE^--mazF(his)₆和誘導(dǎo)后重組菌BL21(DE3)/pET28a-mazE^--mazF(C48A)-(his)₆菌體中解凍；

②菌體混懸均勻后于10ml燒杯中冰浴，超聲破碎30min，超聲3s間歇5s；

③4℃、9000rpm離心10min，小心吸取上清，0.22μm濾膜過濾；

④2ml Ni-NTA用結(jié)合液平衡后，加入上步過濾之后的上清，4℃結(jié)合1h以上；

⑤靜置5min，待柱床形成后釋放流穿液；

⑥加入漂洗液(50mM Tris-HCl,300mM NaCl,20mM imidazole,pH8.0)漂洗15ml；

⑦加入洗脫液(50mM Tris-HCl,300mM NaCl,250mM imidazole,pH8.0)3ml收集；

⑧洗脫液用孔徑為3k的超濾管4℃、4000rpm濃縮，并置換蛋白質(zhì)結(jié)合液，得到融合蛋白mazE^--mazF(his)₆和融合蛋白mazE^--mazF(C48A)-(his)₆。圖2為MazE^—MazF純化過程的PAGE電泳圖，泳道1為蛋白Marker，泳道2為細(xì)胞裂解液，泳道3為層析柱流出液，泳道4為第一次漂洗流出液，泳道5為第二次漂洗流出液，泳道6為洗脫得到的蛋白樣品。

(3)Factor Xa分別酶切上述融合蛋白，采用親和層析去除MazE(請?zhí)峁┚唧w方法)，得到蛋白MazF(his)₆和蛋白MazF(C48A)(his)₆，結(jié)果如圖3所示，圖中泳道1為蛋白Marker，泳道2為融合蛋白酶切后的混合物，泳道3為純化的目的蛋白。

每1mg融合蛋白加入0.1mg Factor Xa酶，37℃水浴反應(yīng)1h，酶切產(chǎn)物重新用Ni-NTA結(jié)合，重復(fù)上述步驟④-⑦，最后用貯存液(10mM Tris-HCl,1mM EDTA,5％glycerol,pH8.0)置換高鹽的溶液，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(4)Tricine SDS-PAGE

①緩沖液配置

a、AB-3：48g丙烯酰胺與1.5g甲叉丙烯酰胺于100ml超純水中溶解完全；

b、正極液(10×)：1M Tris-HCl pH 8.9；負(fù)極液(10×)：1M Tris，1M Tricine，1％SDS，pH8.2；制膠緩沖液(3×)：3M Tris，0.3％SDS，pH8.45；

c、制膠配方如下表所示：

②電泳

正極加入500ml(1×)的正極液，負(fù)極加入200ml(1×)負(fù)極液，置于冰水浴中，濃縮膠電泳電壓為60V，分離膠電泳電壓為100V，電泳直至溴酚藍(lán)條帶遷移至膠的最下端；

③染色

用考馬斯亮藍(lán)染色液(R250 0.1％，異丙醇25％，乙酸10％，蒸餾水65％)染色分離膠1.5-3h；

④脫色

用脫色液(乙醇10％，乙酸5％，蒸餾水85％)脫色3次以上，直至藍(lán)色背景基本去除。

(5)BCA法測量蛋白濃度

①按所需體積配置BCA工作液(A液/B液＝49/1)，混合均勻于37℃水浴預(yù)熱；

②標(biāo)準(zhǔn)蛋白的配置：配置蛋白終濃度依次為0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0(mg/ml)的標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣，每個(gè)樣品體積為20μl，加入96孔板中；

③每個(gè)樣品蛋白取20μl加入96孔板中，每個(gè)樣品設(shè)三個(gè)重復(fù)孔，振搖均勻；

④向每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣和測試樣的孔中加入預(yù)熱的工作液200μl，振搖均勻，37℃恒溫反應(yīng)30min；

⑤用酶標(biāo)儀檢測各個(gè)蛋白在562nm波長處的吸光度，以空白組吸光度為對照，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品蛋白MazF(his)₆及MazF(C48A)(his)₆的濃度。

樣品蛋白MazF(his)₆的濃度為1.5mg/ml，MazF(C48A)(his)₆的濃度為0.9mg/ml。

采用同樣的方法將質(zhì)粒pET28a-mazE^--mazF(V15A)(his)₆、質(zhì)粒pET28a-mazE^--mazF(R29A)(his)₆、質(zhì)粒pET28a-mazE^--mazF(P50A)(his)₆、質(zhì)粒pET28a-mazE^--mazF(K79A)(his)₆、質(zhì)粒pET28a-mazE^--mazF(I81A)(his)₆、質(zhì)粒pET28a-mazE^--mazF(R86A)(his)₆進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)和純化，得到突變蛋白mazF(V15A)、mazF(R29A)、mazF(P50A)、mazF(K79A)、mazF(I81A)和mazF(R86A)。

實(shí)施例5、MazF(his)₆及MazF(C48A)(his)₆的體外活性

1、定性水解總RNA

①枯草芽孢桿菌總RNA提取

首先將葡聚糖凝膠、槍頭、1.5ml離心管、TE溶液等進(jìn)行121℃高溫蒸汽滅菌，除去可能存在的RNA酶。取枯草芽孢桿菌CGMCC 1.1630過夜培養(yǎng)菌液1-1.5ml，4℃、12000rpm離心1min收集菌體；用含有15mg/ml溶解酶的TE溶液100μl重懸菌體，37℃孵育15min；用1ml RLT(Trizol)充分混懸細(xì)胞，室溫靜置5min；加入200μl氯仿，上下顛倒混勻，劇烈渦旋振蕩15s，室溫放置2min，4℃、12000rpm離心10min；緩慢取出分層后菌液，小心將上層無色水相轉(zhuǎn)移至新EP管，加入等體積預(yù)冷的75％乙醇混勻；分兩次加入吸附柱，4℃、12000rpm離心30s，棄廢液；用700μl緩沖液RW1漂洗柱體一次，4℃、12000rpm離心30s，棄廢液；用500μl緩沖液RW2漂洗柱體兩次，4℃、12000rpm離心30s，棄廢液；4℃、12000rpm離心2min，棄廢液，室溫晾干5-10min；加入50μl滅菌蒸餾水洗脫，4℃、12000rpm離心2min收集核酸，測其OD260/280為2.0左右，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

②MazF及MazF(C48A)水解總RNA

設(shè)置反應(yīng)體系10μl，反應(yīng)溶液為TE(10mM Tris-HCl，EDTA 1mM，pH8.0)，加入100ng MazF(his)₆或MazF(C48A)(his)₆蛋白，及2μg RNA底物，不加蛋白的空白組為對照，37℃水浴反應(yīng)30min，加入上樣緩沖液終止反應(yīng)，1.2％瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證反應(yīng)產(chǎn)物的完整情況(圖7)。

將實(shí)施例4制備的其余突變蛋白mazF(V15A)(his)₆、mazF(R29A)(his)₆、mazF(P50A)(his)₆、mazF(K79A)(his)₆、mazF(I81A)(his)₆和mazF(R86A)(his)₆采用上述方法檢測，結(jié)果如圖7所示。圖中，C為未加入毒素蛋白的對照組，其余為各個(gè)毒素蛋白反應(yīng)后的結(jié)果

可以看出，各個(gè)毒素蛋白對RNA降解的程度存在差異，與野生型MazF接近的突變體為C48A和V15A，該結(jié)果與細(xì)菌生長OD600值的結(jié)果相吻合。

2、MazF及MazF(C48A)的體外活性——熒光定量

①底物

5’-6-FAM-AAGTCrGACATCAG-BHQ1-3’為單鏈DNA/RNA的雜合鏈，5’端嵌合了熒光素基團(tuán)6-FAM，3’端嵌合了熒光猝滅基團(tuán)BHQ-1，rG為核糖核苷酸，ACA為MazF(His)₆或MazF(C48A)-(His)₆的識別位點(diǎn)，完整的該底物由于熒光基團(tuán)和熒光猝滅基團(tuán)相距很近，在熒光素的激發(fā)光譜內(nèi)，并不能產(chǎn)生發(fā)射光；而當(dāng)MazF(His)₆或MazF(C48A)-(His)₆水解底物，產(chǎn)生5’端和3’端產(chǎn)物，此時(shí)熒光素基團(tuán)與熒光猝滅基團(tuán)距離拉遠(yuǎn)，在熒光素的最大激發(fā)光下，產(chǎn)生熒光，酶標(biāo)儀捕捉的信號RFUs反映蛋白的活性。

本研究所用底物委托上海生工生物有限公司代為合成。

②反應(yīng)體系

反應(yīng)總體積為100μl，反應(yīng)溶液為TE(10mM Tris-HCl，EDTA 1mM，pH8.0)，加入1μg實(shí)施例4制備的MazF(his)₆或MazF(C48A)(his)₆蛋白及0.5μM底物，不加蛋白的空白組作為對照；

③反應(yīng)條件

在96孔板(costar black plate)中進(jìn)行，酶標(biāo)儀恒溫25℃，激發(fā)光為485nm，發(fā)射光530nm，無截留，體系混合均勻后于酶標(biāo)儀中暗光檢測60min，檢測間隔1min；

④定量計(jì)算

反應(yīng)前3min的3個(gè)檢測值作為初始值，最后3min的3個(gè)檢測值最為最終值，兩者的熒光值之差作為MazF(his)₆或MazF(C48A)(his)₆蛋白的60min酶活。

結(jié)果表明，兩個(gè)蛋白均帶來體系熒光強(qiáng)度的顯著增長。

實(shí)施例6、MazF(C48A)(his)₆與野生型MazF(his)₆穩(wěn)定性比較

將100μl實(shí)施例4制備的MazF(C48A)(his)₆與野生型MazF(his)₆的蛋白貯存液(TE保存，濃度0.1mg/ml)，于4℃條件下保存。

為了檢測不同時(shí)間酶的活性，分別取第保存1、3、7天的蛋白樣品進(jìn)行熒光定量檢測，每次所用的蛋白質(zhì)量為1μg，熒光素嵌合底物為0.5μM，比較其相對熒光強(qiáng)度變化，從而確定各個(gè)蛋白的穩(wěn)定性，具體如下：

①熒光素嵌合底物

5’-6-FAM-AAGTCrGACATCAG-BHQ1-3’為單鏈DNA/RNA的雜合鏈，5’端嵌合了熒光素基團(tuán)6-FAM，3’端嵌合了熒光猝滅基團(tuán)BHQ-1，rG為核糖核苷酸，ACA為MazF(His)₆或MazF(C48A)-(His)₆的識別位點(diǎn)，完整的該底物由于熒光基團(tuán)和熒光猝滅基團(tuán)相距很近，在熒光素的激發(fā)光譜內(nèi)，并不能產(chǎn)生發(fā)射光；而當(dāng)MazF(His)₆或MazF(C48A)-(His)₆水解底物，產(chǎn)生5’端和3’端產(chǎn)物，此時(shí)熒光素基團(tuán)與熒光猝滅基團(tuán)距離拉遠(yuǎn)，在熒光素的最大激發(fā)光下，產(chǎn)生熒光，酶標(biāo)儀捕捉的信號RFUs反映蛋白的活性。

本研究所用底物委托上海生工生物有限公司代為合成。

②反應(yīng)體系

反應(yīng)總體積為100μl，反應(yīng)溶液為TE(10mM Tris-HCl，EDTA 1mM，pH8.0)，加入1μg MazF(his)₆或MazF(C48A)(his)₆蛋白及0.5μM熒光素嵌合底物，不加蛋白的空白組作為對照；

③反應(yīng)條件

在96孔板(costar black plate)中進(jìn)行，酶標(biāo)儀恒溫25℃，激發(fā)光為485nm，發(fā)射光530nm，無截留，體系混合均勻后于酶標(biāo)儀中暗光檢測60min，檢測間隔1min；

④定量計(jì)算

反應(yīng)前3min的3個(gè)檢測值作為初始值，最后3min的3個(gè)檢測值最為最終值，兩者的熒光值之差作為MazF(his)₆及MazF(C48A)(his)₆的60min酶活。

結(jié)果如附圖8所示，圖中每個(gè)柱形圖從左到右為藍(lán)色、紅色、綠色，分別表示在保存1、3、7天之后的相同反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度。在1天時(shí)，C48A活性與MazF基本相當(dāng)，但隨著時(shí)間的延長，野生型活性迅速下降，而mazF(C48A)的活性則得到較好保持。7天后樣品活性，mazF(C48A)和MazF的值分別為174.8和54.9，本發(fā)明突變體穩(wěn)定性較野生型提高三倍以上。

將上述制備的突變蛋白mazF(V15A)、mazF(R29A)、mazF(P50A)、mazF(K79A)、mazF(I81A)和mazF(R86A)按照上述檢測，均沒有mazF(C48A)穩(wěn)定性高。

最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。

序列表

<110> 中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所 中國藥科大學(xué)

<120> 一種高穩(wěn)定型MazF突變體及其應(yīng)用

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 336

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400> 1

atggtaagcc gatacgtacc cgatatgggc gatctgattt gggttgattt tgacccgaca 60

aaaggtagcg agcaagctgg acatcgtcca gctgttgtcc tgagtccttt catgtacaac 120

aacaaaacag gtatgtgtct gtgtgttcct tgtacaacgc aatcaaaagg atatccgttc 180

gaagttgttt tatccggtca ggaacgtgat ggcgtagcgt tagctgatca ggtaaaaagt 240

atcgcctggc gggcaagagg agcaacgaag aaaggaacag ttgccccaga ggaattacaa 300

ctcattaaag ccaaaattaa cgtactgatt gggtag 336

<210> 2

<211> 111

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400> 2

Met Val Ser Arg Tyr Val Pro Asp Met Gly Asp Leu Ile Trp Val Asp

1 5 10 15

Phe Asp Pro Thr Lys Gly Ser Glu Gln Ala Gly His Arg Pro Ala Val

20 25 30

Val Leu Ser Pro Phe Met Tyr Asn Asn Lys Thr Gly Met Cys Leu Cys

35 40 45

Val Pro Cys Thr Thr Gln Ser Lys Gly Tyr Pro Phe Glu Val Val Leu

50 55 60

Ser Gly Gln Glu Arg Asp Gly Val Ala Leu Ala Asp Gln Val Lys Ser

65 70 75 80

Ile Ala Trp Arg Ala Arg Gly Ala Thr Lys Lys Gly Thr Val Ala Pro

85 90 95

Glu Glu Leu Gln Leu Ile Lys Ala Lys Ile Asn Val Leu Ile Gly

100 105 110

<210> 3

<211> 336

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400> 3

atggtaagcc gatacgtacc cgatatgggc gatctgattt gggttgattt tgacccgaca 60

aaaggtagcg agcaagctgg acatcgtcca gctgttgtcc tgagtccttt catgtacaac 120

aacaaaacag gtatgtgtct ggctgttcct tgtacaacgc aatcaaaagg atatccgttc 180

gaagttgttt tatccggtca ggaacgtgat ggcgtagcgt tagctgatca ggtaaaaagt 240

atcgcctggc gggcaagagg agcaacgaag aaaggaacag ttgccccaga ggaattacaa 300

ctcattaaag ccaaaattaa cgtactgatt gggtag 336

<210> 4

<211> 111

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400> 4

Met Val Ser Arg Tyr Val Pro Asp Met Gly Asp Leu Ile Trp Val Asp

1 5 10 15

Phe Asp Pro Thr Lys Gly Ser Glu Gln Ala Gly His Arg Pro Ala Val

20 25 30

Val Leu Ser Pro Phe Met Tyr Asn Asn Lys Thr Gly Met Cys Leu Ala

35 40 45

Val Pro Cys Thr Thr Gln Ser Lys Gly Tyr Pro Phe Glu Val Val Leu

50 55 60

Ser Gly Gln Glu Arg Asp Gly Val Ala Leu Ala Asp Gln Val Lys Ser

65 70 75 80

Ile Ala Trp Arg Ala Arg Gly Ala Thr Lys Lys Gly Thr Val Ala Pro

85 90 95

Glu Glu Leu Gln Leu Ile Lys Ala Lys Ile Asn Val Leu Ile Gly

100 105 110

<210> 5

<211> 489

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400> 5

ttaattattg agccagtgcg taaagagccc gtatttacgc ttgctgaact ggtcaacgac 60

atcacgccgg aaaacctcca cgagaatatc gactggggag agccgaaaga taaggaagtc 120

tggggaggta ttgaaggtcg tggatccggg atggtaagcc gatacgtacc cgatatgggc 180

gatctgattt gggttgattt tgacccgaca aaaggtagcg agcaagctgg acatcgtcca 240

gctgttgtcc tgagtccttt catgtacaac aacaaaacag gtatgtgtct gtgtgttcct 300

tgtacaacgc aatcaaaagg atatccgttc gaagttgttt tatccggtca ggaacgtgat 360

ggcgtagcgt tagctgatca ggtaaaaagt atcgcctggc gggcaagagg agcaacgaag 420

aaaggaacag ttgccccaga ggaattacaa ctcattaaag ccaaaattaa cgtactgatt 480

gggctcgag 489

<210> 6

<211> 169

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400> 6

Leu Ile Ile Glu Pro Val Arg Lys Glu Pro Val Phe Thr Leu Ala Glu

1 5 10 15

Leu Val Asn Asp Ile Thr Pro Glu Asn Leu His Glu Asn Ile Asp Trp

20 25 30

Gly Glu Pro Lys Asp Lys Glu Val Trp Gly Gly Ile Glu Gly Arg Gly

35 40 45

Ser Gly Met Val Ser Arg Tyr Val Pro Asp Met Gly Asp Leu Ile Trp

50 55 60

Val Asp Phe Asp Pro Thr Lys Gly Ser Glu Gln Ala Gly His Arg Pro

65 70 75 80

Ala Val Val Leu Ser Pro Phe Met Tyr Asn Asn Lys Thr Gly Met Cys

85 90 95

Leu Cys Val Pro Cys Thr Thr Gln Ser Lys Gly Tyr Pro Phe Glu Val

100 105 110

Val Leu Ser Gly Gln Glu Arg Asp Gly Val Ala Leu Ala Asp Gln Val

115 120 125

Lys Ser Ile Ala Trp Arg Ala Arg Gly Ala Thr Lys Lys Gly Thr Val

130 135 140

Ala Pro Glu Glu Leu Gln Leu Ile Lys Ala Lys Ile Asn Val Leu Ile

145 150 155 160

Gly Leu Glu His His His His His His

165

<210> 7

<211> 489

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400> 7

ttaattattg agccagtgcg taaagagccc gtatttacgc ttgctgaact ggtcaacgac 60

atcacgccgg aaaacctcca cgagaatatc gactggggag agccgaaaga taaggaagtc 120

tggggaggta ttgaaggtcg tggatccggg atggtaagcc gatacgtacc cgatatgggc 180

gatctgattt gggttgattt tgacccgaca aaaggtagcg agcaagctgg acatcgtcca 240

gctgttgtcc tgagtccttt catgtacaac aacaaaacag gtatgtgtct ggctgttcct 300

tgtacaacgc aatcaaaagg atatccgttc gaagttgttt tatccggtca ggaacgtgat 360

ggcgtagcgt tagctgatca ggtaaaaagt atcgcctggc gggcaagagg agcaacgaag 420

aaaggaacag ttgccccaga ggaattacaa ctcattaaag ccaaaattaa cgtactgatt 480

gggctcgag 489

<210> 8

<211> 169

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400> 8

Leu Ile Ile Glu Pro Val Arg Lys Glu Pro Val Phe Thr Leu Ala Glu

1 5 10 15

Leu Val Asn Asp Ile Thr Pro Glu Asn Leu His Glu Asn Ile Asp Trp

20 25 30

Gly Glu Pro Lys Asp Lys Glu Val Trp Gly Gly Ile Glu Gly Arg Gly

35 40 45

Ser Gly Met Val Ser Arg Tyr Val Pro Asp Met Gly Asp Leu Ile Trp

50 55 60

Val Asp Phe Asp Pro Thr Lys Gly Ser Glu Gln Ala Gly His Arg Pro

65 70 75 80

Ala Val Val Leu Ser Pro Phe Met Tyr Asn Asn Lys Thr Gly Met Cys

85 90 95

Leu Ala Val Pro Cys Thr Thr Gln Ser Lys Gly Tyr Pro Phe Glu Val

100 105 110

Val Leu Ser Gly Gln Glu Arg Asp Gly Val Ala Leu Ala Asp Gln Val

115 120 125

Lys Ser Ile Ala Trp Arg Ala Arg Gly Ala Thr Lys Lys Gly Thr Val

130 135 140

Ala Pro Glu Glu Leu Gln Leu Ile Lys Ala Lys Ile Asn Val Leu Ile

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Gly Leu Glu His His His His His His

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<210> 9

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<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400> 9

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ctacgaggaa tatcgtccag cgccgaatgc tgcgctttct gcgcgcgctc ttcggttttg 180

atttgctccc aacgggcaag cacttcacta ctgttttcgg cagaactatc agcaaaaaca 240

tgcggatggc gacgctctaa tttatcgcta atagcagcgc aaatatcatt aaagtcaaag 300

cgcccttctt cctgagccat ttgcgcgtaa aacaccacct ggaatagcag atcgcccagt 360

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aca 603

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<223>

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agatacgagc aaatttcggc ctaactcccg tgcaaccgac gcgcgtcgat aacatccggc 120

acctggttga gtttacccag cacgcgcccc agcacttgca ggttgtaaat ctcaatggtc 180

atgtcgatgg tcgccagttg ctgtttggtg tcgctacggc tggcaacgcc aagcacgttc 240

accttctcgt tggcgagaat ggtcgtgata tcacgtaaca acccactacg atcattagct 300

accacgcgga ccaccagcga atatccggcg gagtagctct caccccatac cgcgtcaaca 360

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gaaataccgc gcccctgggt aatgaagccg acaatctcat ctccaggaat cggctggcag 480

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