本發(fā)明涉及人工模擬酶領(lǐng)域，是一種兼具細胞膜穿透效應(yīng)和雙抗氧化物酶活性的76肽，具體地說，是一種通過基因重組技術(shù)制備的具有超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)雙活性的含硒金屬76肽化合物。

背景技術(shù)：

機體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的平衡和人類重大疾病的發(fā)生與發(fā)展息息相關(guān)，且機體內(nèi)氧化還原平衡的維持需要依靠諸多抗氧化酶間的協(xié)同作用，僅對單一功能酶的研究很難深入探索這個復(fù)雜體系的作用機制，而進行構(gòu)建具有多種抗氧化活性的模擬酶，有利于對抗氧化多酶體系中各種抗氧化酶的協(xié)同作用進行深入研究。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GPx)作為生物體天然抗氧化酶系的重要成員，大量研究表明兩者的相互協(xié)同作用對清除和人類多種疾病相關(guān)的高濃度的ROS(reactive oxygen species,ROS)具有重要作用。因此，對SOD和GPx協(xié)同抗氧化效應(yīng)的模擬化合物的研究至關(guān)重要。本申請人所在博士課題組曾經(jīng)以具有晶體結(jié)構(gòu)的SOD3為模板，保留了其活性必須的氨基酸序列，引入了SOD活性中心的Cu²⁺和穩(wěn)定活性基團的Zn²⁺，同時插入了一段具有GPx底物GSH特異性結(jié)合位點的15肽，又通過結(jié)構(gòu)模擬，在特定部位引入了除GPx活性殘基Sec以外的對穩(wěn)定活性部位起到至關(guān)重要的氨基酸殘基Gln和Trp組成催化三聯(lián)體，并利用Cys營養(yǎng)缺陷型表達系統(tǒng)，獲得一種具有精巧的雙酶活性中心結(jié)構(gòu)域的銅鋅含硒65肽即Se-CuZn-65P。相對大分子量模擬物，65P作為短肽提高了穿透細胞的效率，但效果依然不夠理想?；诖?，申請人在Se-CuZn-65P的氨基端連接上人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)反式轉(zhuǎn)錄激活因子(trans-activator of transcription,TAT)的蛋白穿膜結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，即細胞穿膜肽(cell-penetrating peptide,CPP)，使其具有穿透生物膜的能力，命名為Se-CuZn-76P，借助計算機模擬功能建立Se-CuZn-76P的三維結(jié)構(gòu)模型，并與Se-CuZn-65P進行結(jié)構(gòu)比對，分析其活性部位，預(yù)測其活性變化。然后在單一蛋白生產(chǎn)(single protein production,SPP)系統(tǒng)中進行半胱氨酸缺陷表達(cysteine auxotrophic expression)，酶學(xué)特征及穿膜能力鑒定表明，Se-CuZn-76是一種具有雙酶活性，位點清晰，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，催化機理明確且具有穿膜作用和抗氧化協(xié)同效應(yīng)的小分子76肽，其對闡明酶的催化機理以及相互間協(xié)同作用有重要意義，而且還有廣闊的藥用前景。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一是，提供一種兼具細胞膜穿透效應(yīng)和雙抗氧化物酶活性的76肽，通過引入系列催化氨基酸群和蛋白穿膜結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，建立具有細胞膜穿透效應(yīng)并兼具SOD和GPx催化活性的新型雙功能模擬酶，其把SOD活性中心結(jié)構(gòu)域和GPx活性中心結(jié)構(gòu)域有機整合在一起，使它們能夠在各自發(fā)揮活性的基礎(chǔ)上又能相互協(xié)同作用，細胞穿膜肽使其具有穿透生物膜的能力，賦予其廣闊的藥用前景。本發(fā)明的另一目的是，提供一種科學(xué)合理，簡單實用的兼具細胞膜穿透效應(yīng)和雙抗氧化物酶活性的76肽的制備方法。

實現(xiàn)本發(fā)明目的之一采用的技術(shù)方案是：一種兼具細胞膜穿透效應(yīng)和雙抗氧化物酶活性的76肽，結(jié)構(gòu)中含有使細胞膜具有穿透功能的轉(zhuǎn)錄活化因子(Trans-activating transcriptional activator,TAT)序列，其特征是，還含有與超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)相似的結(jié)構(gòu)，其氨基酸一級序列為：Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-His-Gln-His-Gln-Phe-Gly-Asp-Leu-Ser-Gln-Gly-Ala-Glu-Ser-Thr-Gly-Pro-His-Tyr-Asn-Pro-Leu-Ala-Val-Pro-His-Pro-Gln-His-Pro-Gly-Asp-Trp-Gly-Asn-Phe-Ala-Val-Arg-Asp-Gly-Ser-Leu-Trp-Pro-Phe-Leu-Arg-His-Asn-Val-Tyr-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala-Sec-Val-Val-His-Ala-Gly-Glu-Asp。

實現(xiàn)本發(fā)明目的之二采用的技術(shù)方案是：一種兼具細胞膜穿透效應(yīng)和雙抗氧化物酶活性的76肽的制備方法，其特征是，它包括以下步驟：

1)Se-CuZn-76P分子模型的建立與分析

以Se-CuZn-65P氨基酸序列為基礎(chǔ)，連接上TAT序列(YGRKKRRQRRR)，利用BLAST數(shù)據(jù)庫和Homology模塊進行同源序列比對并建立Se-CuZn-76P的三維結(jié)構(gòu)模型，預(yù)測其活性變化；

BLAST搜索表明，天然SOD1(PDB entry 1HL5,1AZV)，SOD3(PDB entry 2JLP)蛋白結(jié)構(gòu)與Se-CuZn-76P有較高的同源性，依據(jù)其空間結(jié)構(gòu)建立Se-CuZn-76P三維模型，優(yōu)化后獲得穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，其具有發(fā)揮GPx活性的催化三聯(lián)體(catalytic triad)結(jié)構(gòu)和發(fā)揮SOD活性的金屬離子配位(metal ion-coordinated)結(jié)構(gòu)；

2)pColdⅠ(sp-4)-76P重組質(zhì)粒的構(gòu)建

參照OMEGAPlasmid Mini Kit I質(zhì)粒提取試劑盒說明書:

將帶有質(zhì)粒的E.coli接種于5mL LB/抗生素培養(yǎng)液中，37℃搖床培養(yǎng)16h；

分次取5.0mL的菌液，室溫下10000×g離心1min收集細菌,倒棄培養(yǎng)基；

加入250μl SolutionⅠ/RNaseA混合液，旋窩震蕩使細胞完全懸??；

加入250μl SolutionⅡ，輕輕顛倒混勻6次；

加入350μl SolutionⅢ，溫和顛倒數(shù)次至形成白色絮狀沉淀；

室溫下，≥10000×g離心10min；

轉(zhuǎn)移上清液至套有2mL收集管的HiBind DNA結(jié)合柱中，室溫下，10000×g離心1min，倒去收集管中的濾液；

把柱子重新裝回收集管，加入500μl HB Buffer，按上述條件離心，棄去濾液；

把柱子重新裝回收集管，加入700μl DNA Wash Buffer按上述條件離心，棄去濾液。注意：濃縮的DNA Wash Buffer在使用之前必需按標簽的提示用無水乙醇稀釋，重復(fù)一次；

棄去濾液，把柱子重新裝回收集管，10000×g離心空柱2min以甩干柱子基質(zhì)；

把柱子裝在干凈的1.5mL離心管上，加入50μl Elution Buffer到柱子基質(zhì)中，靜置2min，10000×g離心1min洗脫出DNA。

對pET28a-76P和pColdⅠ(sp-4)pPelB質(zhì)粒進行提取，并采用NdeⅠ和XbaⅠ限制性核酸內(nèi)切酶對這兩個質(zhì)粒分別雙酶切，再用T4DNA連接酶進行連接，雙酶切和連接體系如下：

雙酶切體系20μL如下：

37℃溫育4h，1.5％瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切結(jié)果并回收酶切片段；

連接體系10μL如下：

雙酶切后的76P基因 4.5μL

雙酶切后的pColdⅠ(sp-4)載體 1.5μL

H₂O 2.5μL

45℃溫育5min，冷卻至室溫，使酶切的目的基因和載體進行粘端退火連接，然后加入10×連接緩沖液1μL，T4DNA連接酶0.5μL，16℃連接16h；

重組質(zhì)粒經(jīng)CaCl₂法轉(zhuǎn)化入E.coli DH5α感受態(tài)菌株中，在含有100μg/mL Amp的盧-貝(Luria-Bertani,LB)固體培養(yǎng)基中篩選后，挑取單克隆在含有100μg/mL Amp的LB液體培養(yǎng)基中擴增培養(yǎng)，提取pColdⅠ(sp-4)-76P質(zhì)粒，再用1％瓊脂糖凝膠電泳進行酶切鑒定；

pColdⅠ(sp-4)-76P質(zhì)粒為4587bp，由76P氨基端被轉(zhuǎn)錄增強元件(translation enhancing element,TEE)、6×組氨酸標簽(6×His-Tag)和凝血酶切位點(FactorⅩa site)所表達肽段保護，使其不能發(fā)揮穿膜作用而在胞漿內(nèi)高效表達，由限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和XbaⅠ單、雙酶切后1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果可知pColdⅠ(sp-4)-76P質(zhì)粒構(gòu)建成功；

3)Se-CuZn-76P的表達和蛋白切割

將pColdⅠ(sp-4)-76P質(zhì)粒和pMzaF質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化入E.coli BL21(DE3)selB:cysE51感受態(tài)菌株中，建立成SPP表達系統(tǒng)，然后采用半胱氨酸缺陷表達法表達和純化。從轉(zhuǎn)化平板上挑取陽性單克隆接種20mL LB，含100μg/mL Ampicillin，50μg/mL Kanamycin培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，將過夜的種子液接種于500mL M9expression medium 1，含100μg/mL Ampicillin，100μg/mL Kanamycin，50μg/mL Cys培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)，當(dāng)菌體的OD₆₀₀達到1.0時，加入誘導(dǎo)劑IPTG使其終濃度達到1mM，37℃誘導(dǎo)10min,再加入Chloramphenicol終濃度為34μg/mL，37℃振蕩培養(yǎng)5min后，6000rpm離心10min，棄上清液，菌體用與培養(yǎng)基等體積的0.9％NaCl重懸，6000rpm離心10min，棄上清液，重復(fù)洗滌一次，6000rpm離心15min，再次收集菌體，重懸于500mL M9expression medium 2，含100μg/mL Ampicillin，100μg/mL Kanamycin培養(yǎng)基中，同時加入利福平至終濃度為400mg/L，37℃振蕩培養(yǎng)5h。離心收集菌體，于50mM，Tris-HCl(pH7.5)緩沖液中反復(fù)洗滌兩次，重懸于4倍體積的50mM，Tris-HCl，pH7.5溶液中，加入蛋白酶抑制劑PMSF，溶于100μg/mL異丙醇，冰浴下超聲破碎菌體，15000rpm離心30min，收集上清液；

M9expression medium 1:6g/L Na₂HPO₄；3g/L KH₂PO₄；0.5g/L NaCl；1g/L NH₄Cl；400μM H₃BO₄；30μM CoCl₂；10μM CuSO₄；80μM MnCl₂；10μM ZnSO₄；10μM FeCl₃；18種常見氨基酸，無Cys，各100μg/mL；1％甘油；0.4％葡萄糖；2mM MgSO₄或50μg/mL半胱氨酸鹽酸鹽；硫胺素(VB1)5μg/mL；

M9expression medium 2:10g/L K₂HPO₄；1g/L NH₄Cl；10mg/L CaCl₂；3.6mg/L FeCl₂；429mg/L MgAc；2g/L NaAc；丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、甘氨酸各400μg/mL；天門冬氨酸、天門冬酰胺、甲硫氨酸、組氨酸各250μg/mL；異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、脯氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、酪氨酸各100μg/mL；色氨酸50μg/mL；絲氨酸1600μg/mL；0.5％甘油；0.2％蔗糖；胞嘧啶、鳥苷、脲嘧啶各125μg/mL，胸腺嘧啶50μg/mL；胺素(VB1)50μg/mL；煙酸50μg/mL；生物素100ng/mL；硒代胱氨酸200mg/L；

經(jīng)Cys缺陷型表達后，把菌液6000rpm離心收集，棄上清，沉淀重懸于25mM,Tris-HCl，pH8.0緩沖液中，清洗3次后，超聲破碎，留上清，用醋酸調(diào)pH值為5.2～5.4。加入終濃度為0.1mM的CuSO₄室溫放置1h，然后加入終濃度為0.1mM的ZnSO₄室溫放置30min，用25mM Tris-HCl緩沖液再次調(diào)整pH值為8.0，超濾濃縮后，蛋白上清經(jīng)DEAE陰離子交換柱層析，用10倍柱體積的0～100mM NaCl洗脫，目的蛋白出現(xiàn)在20mM NaCl的洗脫液中，收集洗脫峰，用10mM PBS透析后，分別用截留分子量5KD和10KD的Millipore超濾離心管超濾，濃縮，用Tricine-SDS-PAGE鑒定目的小肽Se-CuZn-65P；

在表達0，12，24，48，72，96，120h時6000rpm離心10min收集沉淀；用50mM Tris-HCl，pH 8.0緩沖液中反復(fù)洗滌兩次，重懸于4倍體積的50mM Tris-HCl，pH 8.0溶液中，冰浴下超聲破碎菌體，15000rpm離心30min后收集上清液，用0.45mm濾膜過濾，考馬斯亮藍G-250方法測定表達蛋白濃度，用2％(w/w)的凝血酶對表達蛋白進行酶切，反應(yīng)條件23℃，24h，用截留分子為3kDa的Milliproe超濾離心管收集目的肽，凍干備用，獲得76肽。

本發(fā)明的一種兼具細胞膜穿透效應(yīng)和雙抗氧化物酶活性的76肽，以Se-CuZn-65為基礎(chǔ)經(jīng)過計算機模擬設(shè)計引入蛋白穿膜結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，建立具有細胞膜穿透效應(yīng)并兼具SOD和GPx催化活性的新型雙功能模擬酶，并通過實驗驗證，獲得具有雙酶活性和穿透生物膜能力的76肽，具有廣闊的藥用前景。

本發(fā)明的一種兼具細胞膜穿透效應(yīng)和雙抗氧化物酶活性的76肽及其制備方法的進一步優(yōu)點體現(xiàn)在：

1.保留原65肽中與天然SOD相似的三維結(jié)構(gòu)和天然GPx相似的催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)，因此，同樣兼具SOD和GPx的活性，其中GPx活力為10⁹U/mg protein，SOD活力為1218U/mg protein，兩種酶可以協(xié)同參與抗氧化效應(yīng)，藥物應(yīng)用前景廣闊；

2.在原有65肽功能基因基礎(chǔ)上，引入攜帶抗氧化76肽穿透細胞膜功能的轉(zhuǎn)錄活化因子TAT穿膜肽基因，使其具有穿透細胞膜的功能，可進入細胞發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)；

3.采用單一蛋白生產(chǎn)(SPP)系統(tǒng)進行富集表達，該系統(tǒng)包括的MazF載體和冷休克表達載體pColdI。MazF表達的MazF蛋白，發(fā)揮對mRNA的ACA序列的剪切作用，從而抑制雜蛋白的合成，而不影響設(shè)計合成的不含ACA序列的目的蛋白表達，共轉(zhuǎn)的攜帶目的基因的pColdI載體含有翻譯增強元件(translational enhancer element,TEE)、6×His標簽、Xa因子切割位點和多種限制性核酸內(nèi)切酶切割位點，然后利用組氨酸標簽純化目的蛋白，簡化了純化步驟；

4.已被FITC成功標記，采用激光共聚焦顯微鏡在放大100倍狀態(tài)下觀察發(fā)現(xiàn)Se-CuZn-76P可以在TAT序列的協(xié)助下可穿透細胞膜而進入細胞。同時測定穿膜過程中細胞內(nèi)GPx和SOD變化也發(fā)現(xiàn)，隨著Se-CuZn-76P對L02細胞作用的時間延長，細胞內(nèi)GPx和SOD活性增加，在第8h時間點上細胞內(nèi)GPx和SOD活性分別為23.49U/mg protein和83.05U/mg protein，為L02細胞正常水平的1.65和4.12倍，這也可從側(cè)面證明Se-CuZn-76P穿過了細胞膜。

5.其制備方法科學(xué)合理，簡單實用。

附圖說明

圖1為Se-CuZn-76P的空間結(jié)構(gòu)；

圖2為Se-CuZn-76P發(fā)揮GPx活性的催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)；

圖3為Se-CuZn-76P發(fā)揮SOD活性的金屬離子配位結(jié)構(gòu)；

圖4為pColdⅠ(sp-4)-76P質(zhì)粒構(gòu)建的物理圖譜；

圖5為pColdⅠ(sp-4)-76P質(zhì)粒構(gòu)建的瓊脂糖凝膠電泳鑒定圖，

Lane1：DNA Marker；Lane2：pColdⅠ(sp-4)-76P；Lane3：pColdⅠ(sp-4)-76P+NdeⅠ；Lane4：pColdⅠ(sp-4)-76P+XbaⅠ；Lane5：pColdⅠ(sp-4)-76P+NdeⅠ+XbaⅠ)；

圖6為Se-CuZn-76P在SPP系統(tǒng)中表達與凝血酶切割的Tricine-SDS-PAGE鑒定圖，

Lane1：Protein Marker；Lane2-8：表達不同時間(0h，12h，24h，48h，72h，96h，120h)的可溶性蛋白；Lane9：凝血酶切后純化的Se-CuZn-76P；

圖7為FITC-Se-CuZn-76P穿透L02細胞膜的示意圖；

圖8為在不同時間點上L02細胞內(nèi)GPx和SOD活力示意圖。

本發(fā)明的一種兼具細胞膜穿透效應(yīng)和雙抗氧化物酶活性的76肽，結(jié)構(gòu)中含有使細胞膜具有穿透功能的轉(zhuǎn)錄活化因子(Trans-activating transcriptional activator,TAT)序列，其特征是，還含有與超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)相似的結(jié)構(gòu)，其氨基酸一級序列為：Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-His-Gln-His-Gln-Phe-Gly-Asp-Leu-Ser-Gln-Gly-Ala-Glu-Ser-Thr-Gly-Pro-His-Tyr-Asn-Pro-Leu-Ala-Val-Pro-His-Pro-Gln-His-Pro-Gly-Asp-Trp-Gly-Asn-Phe-Ala-Val-Arg-Asp-Gly-Ser-Leu-Trp-Pro-Phe-Leu-Arg-His-Asn-Val-Tyr-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala-Sec-Val-Val-His-Ala-Gly-Glu-Asp。

本發(fā)明的一種兼具細胞膜穿透效應(yīng)和雙抗氧化物酶活性的76肽的制備方法，包括以下步驟：

1)Se-CuZn-76P分子模型的建立與分析

以Se-CuZn-65P氨基酸序列為基礎(chǔ)，連接上TAT序列(YGRKKRRQRRR)，利用BLAST數(shù)據(jù)庫和Homology模塊進行同源序列比對并建立Se-CuZn-76P的三維結(jié)構(gòu)模型，預(yù)測其活性變化；

BLAST搜索表明，天然SOD1(PDB entry 1HL5,1AZV)，SOD3(PDB entry 2JLP)蛋白結(jié)構(gòu)與Se-CuZn-76P有較高的同源性，依據(jù)其空間結(jié)構(gòu)建立Se-CuZn-76P三維模型，優(yōu)化后獲得穩(wěn)定結(jié)構(gòu)(圖1)，其具有發(fā)揮GPx活性的催化三聯(lián)體(catalytic triad)結(jié)構(gòu)(圖2)和發(fā)揮SOD活性的金屬離子配位(metal ion-coordinated)結(jié)構(gòu)(圖3)；

2)pColdⅠ(sp-4)-76P重組質(zhì)粒的構(gòu)建

參照OMEGAPlasmid Mini Kit I質(zhì)粒提取試劑盒說明書，對pET28a-76P和pColdⅠ(sp-4)pPelB質(zhì)粒進行提取，并采用NdeⅠ和XbaⅠ限制性核酸內(nèi)切酶對這兩個質(zhì)粒分別雙酶切，再用T4DNA連接酶進行連接，雙酶切和連接體系如下：

雙酶切體系20μL如下：

37℃溫育4h，1.5％瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切結(jié)果并回收酶切片段；

連接體系10μL如下：

雙酶切后的76P基因 4.5μL

雙酶切后的pColdⅠ(sp-4)載體 1.5μL

H₂O 2.5μL

45℃溫育5min，冷卻至室溫，使酶切的目的基因和載體進行粘端退火連接，然后加入10×連接緩沖液1μL，T4DNA連接酶0.5μL，16℃連接16h；

重組質(zhì)粒經(jīng)CaCl₂法轉(zhuǎn)化入E.coli DH5α感受態(tài)菌株中，在含有100μg/mL Amp的盧-貝(Luria-Bertani,LB)固體培養(yǎng)基中篩選后，挑取單克隆在含有100μg/mL Amp的LB液體培養(yǎng)基中擴增培養(yǎng)，提取pColdⅠ(sp-4)-76P質(zhì)粒，再用1％瓊脂糖凝膠電泳進行酶切鑒定；

pColdⅠ(sp-4)-76P質(zhì)粒為4587bp，由其物理圖譜(圖4)可知表達的76P氨基端被轉(zhuǎn)錄增強元件(translation enhancing element,TEE)、6×組氨酸標簽(6×His-Tag)和凝血酶切位點(Factor Ⅹasite)所表達肽段保護，使其不能發(fā)揮穿膜作用而在胞漿內(nèi)高效表達。由限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和XbaⅠ單、雙酶切后1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定(圖5)結(jié)果可知pColdⅠ(sp-4)-76P質(zhì)粒構(gòu)建成功；

3)Se-CuZn-76P的表達和蛋白切割

將pColdⅠ(sp-4)-76P質(zhì)粒和pMzaF質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化入E.coli BL21(DE3)selB:cysE51感受態(tài)菌株中，建立成SPP表達系統(tǒng)，然后采用半胱氨酸缺陷表達法表達和純化。從轉(zhuǎn)化平板上挑取陽性單克隆接種20mL LB，含 100μg/mL Ampicillin，50μg/mL Kanamycin培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，將過夜的種子液接種于500mL M9 expression medium 1，含100μg/mL Ampicillin，100μg/mL Kanamycin，50μg/mL Cys培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)，當(dāng)菌體的OD₆₀₀達到1.0時，加入誘導(dǎo)劑IPTG使其終濃度達到1mM，37℃誘導(dǎo)10min,再加入Chloramphenicol終濃度為34μg/mL，37℃振蕩培養(yǎng)5min后，6000rpm離心10min，棄上清液，菌體用與培養(yǎng)基等體積的0.9％NaCl重懸，6000rpm離心10min，棄上清液，重復(fù)洗滌一次，6000rpm離心15min，再次收集菌體，重懸于500mL M9 expression medium 2，含100μg/mL Ampicillin，100μg/mL Kanamycin培養(yǎng)基中，同時加入利福平至終濃度為400mg/L，37℃振蕩培養(yǎng)5h。離心收集菌體，于50mM，Tris-HCl(pH7.5)緩沖液中反復(fù)洗滌兩次，重懸于4倍體積的50mM，Tris-HCl，pH7.5溶液中，加入蛋白酶抑制劑PMSF，溶于100μg/mL異丙醇，冰浴下超聲破碎菌體，15000rpm離心30min，收集上清液；

M9expression medium 1:6g/L Na₂HPO₄；3g/L KH₂PO₄；0.5g/L NaCl；1g/L NH₄Cl；400μM H₃BO₄；30μM CoCl₂；10μM CuSO₄；80μM MnCl₂；10μM ZnSO₄；10μM FeCl₃；18種常見氨基酸，無Cys，各100μg/mL；1％甘油；0.4％葡萄糖；2mM MgSO₄或50μg/mL半胱氨酸鹽酸鹽；硫胺素(VB1)5μg/mL；

M9expression medium 2:10g/L K₂HPO₄；1g/L NH₄Cl；10mg/L CaCl₂；3.6mg/L FeCl₂；429mg/L MgAc；2g/L NaAc；丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、甘氨酸各400μg/mL；天門冬氨酸、天門冬酰胺、甲硫氨酸、組氨酸各250μg/mL；異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、脯氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、酪氨酸各100μg/mL；色氨酸50μg/mL；絲氨酸1600μg/mL；0.5％甘油；0.2％蔗糖；胞嘧啶、鳥苷、脲嘧啶各125μg/mL，胸腺嘧啶50μg/mL；胺素(VB1)50μg/mL；煙酸50μg/mL；生物素100ng/mL；硒代胱氨酸200mg/L；

經(jīng)Cys缺陷型表達后，把菌液6000rpm離心收集，棄上清，沉淀重懸于25mM,Tris-HCl，pH8.0緩沖液中，清洗3次后，超聲破碎，留上清，用醋酸調(diào)pH值為5.2～5.4。加入終濃度為0.1mM的CuSO₄室溫放置1h，然后加入終濃度為0.1mM的ZnSO₄室溫放置30min，用25mM Tris-HCl緩沖液再次調(diào)整pH值為8.0，超濾濃縮后，蛋白上清經(jīng)DEAE陰離子交換柱層析，用10倍柱體積的0～100mM NaCl洗脫，目的蛋白出現(xiàn)在20mM NaCl的洗脫液中，收集洗脫峰，用10mM PBS透析后，分別用截留分子量5KD和10KD的Millipore超濾離心管超濾，濃縮，用Tricine-SDS-PAGE鑒定目的肽；

在表達0，12，24，48，72，96，120h時6000rpm離心10min收集沉淀；用50mM Tris-HCl，pH 8.0緩沖液中反復(fù)洗滌兩次，重懸于4倍體積的50mM Tris-HCl，pH 8.0溶液中，冰浴下超聲破碎菌體，15000rpm離心30min后收集上清液，用0.45mm濾膜過濾，考馬斯亮藍G-250方法測定表達蛋白濃度，用2％(w/w)的凝血酶對表達蛋白進行酶切，反應(yīng)條件23℃，24h，用截留分子為3kDa的Milliproe超濾離心管收集目的肽，凍干備用，獲得76肽。

pColdⅠ(sp-4)-76P質(zhì)粒在含有SPP系統(tǒng)的E.coli BL21cysE51表達，Tricine-SDS-PAGE實驗結(jié)果(圖6)初步證明的結(jié)果發(fā)現(xiàn)在表達的第2天即可表達較純的可溶性蛋白，理論分子量為10.8kDa，說明以Se-CuZn-76P為主體的可溶性蛋白可以在SPP系統(tǒng)成功表達，表達的可溶性蛋白經(jīng)凝血酶FactorⅩa切割和超濾純化后獲得暴漏出穿膜肽的Se-CuZn-76P，理論分子量為9.3kDa；

4)Se-CuZn-76P的酶活力和元素含量測定

利用試劑盒測定Se-CuZn-76P的GPx和SOD活力，采用原子吸收分光光度法測定Cu²⁺和Zn²⁺的含量，采用氫化物原子熒光光譜法測定硒含量。

經(jīng)檢測Se-CuZn-76P的GPx活力為10⁹U/mg protein，SOD活力為1218U/mg protein，每分子Se-CuZn-76P中含Se、Cu、Zn原子各1個，這些指標均與Se-CuZn-65P相當(dāng)，但與天然酶相比，Se-CuZn-76P的GPx活力和SOD活力依然比較低，見表1。

表1 Se-CuZn-76P的SOD活力、GPx活力和Se、Cu、Zn元素含量

5)Se-CuZn-76P穿膜實驗

采用Kawamura法將FITC熒光素標記于Se-CuZn-76P的氨基端，生成FITC-Se-CuZn-76P，經(jīng)Sephadex G-25凝膠層析除去未結(jié)合的熒光素。制備的FITC-Se-CuZn-76P加入0.01％疊氮化鈉后凍干保存。標記后的鑒定：用紫外分光光度計測定FITC-Se-CuZn-76P在495nm和280nm處的吸光度值(absorbance,A)，A₄₉₅/A₂₈₀比值在0.3～1.0范圍內(nèi)表示FITC成功標記在蛋白質(zhì)上。將肝L02細胞接種于6孔板中(5×10³細胞/孔)，用含10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液在37℃，5％CO₂環(huán)境中培養(yǎng)，待細胞貼壁后，加入0.2g/L的FITC-Se-CuZn-76P，繼續(xù)培養(yǎng)1、2、4、8h。分別在各個時間點上收集細胞，破碎細胞后利用試劑盒測定細胞內(nèi)GPx和SOD活力。在第8h時間點上，棄去培養(yǎng)液，加入10mg/L DAPI和25μmol/L DiI兩種染液，在37℃下孵育10min，然后用0.02mol/L pH7.4磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)沖洗5遍，加入2％多聚甲醛固定15min，激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞染色。

測定FITC-Se-CuZn-76P的A₄₉₅/A₂₈₀比值為0.43，說明Se-CuZn-76P已被FITC成功標記。采用激光共聚焦顯微鏡在放大100倍狀態(tài)下觀察FITC-Se-CuZn-76P進入細胞的情況(圖7)發(fā)現(xiàn)Se-CuZn-76P可以在TAT序列的協(xié)助下可穿透細胞膜而進入細胞。同時測定穿膜過程中細胞內(nèi)GPx和SOD變化(圖5)也發(fā)現(xiàn)，隨著Se-CuZn-76P對L02細胞作用的時間延長，細胞內(nèi)GPx和SOD活性增加，在第8h時間點上細胞內(nèi)GPx和SOD活性分別為23.49U/mg protein和83.05U/mg protein，為L02細胞正常水平的1.65和4.12倍，這也可從側(cè)面證明Se-CuZn-76P穿過了細胞膜。

6.統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，各項指標檢測數(shù)據(jù)以平均值±標準差(±SD)表示。圖中結(jié)果可以看出Se-CuZn-76P兼具GPx和SOD雙酶活性(圖8)。

結(jié)論：本發(fā)明將SOD和GPx催化活性中心和蛋白穿膜結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列結(jié)合，以原有工作為基礎(chǔ)，構(gòu)建了新型的一種兼具細胞膜穿透效應(yīng)和雙抗氧化物酶活性的76肽，實驗也證明，76肽不但具有較高的SOD和GPx雙酶活性，同時具有穿透生物膜的能力，Se-CuZn-76P的成功獲得，不僅為構(gòu)建抗氧化協(xié)同作用的模擬酶領(lǐng)域提供了一個新策略，也將對闡明酶的催化機制，探討蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系有重要科學(xué)意義，并具有重大的藥物應(yīng)用前景。