本發(fā)明屬于酶制劑
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種新型磷脂酶A2及其制備sn-2位為二十二碳六烯酸的磷脂酰絲氨酸(2-DHA-PS)的方法。
背景技術(shù)：
：：二十二碳六烯酸(docosahexaenoicacid，DHA)，俗稱腦黃金，是一種對人體非常重要的不飽和脂肪酸，屬于ω-3不飽和脂肪酸家族中的重要成員。DHA是神經(jīng)系統(tǒng)細胞生長及維持的一種主要成分，是大腦和視網(wǎng)膜的重要構(gòu)成成分，在人體大腦皮層中含量高達20％，在眼睛視網(wǎng)膜中所占比例最大，約占50％，因此，對胎嬰兒智力和視力發(fā)育至關(guān)重要。磷脂酰絲氨酸(phosphatiAylserine，PS)是一種天然的磷脂，PS的結(jié)構(gòu)決定了其具有雙親性的獨特性質(zhì)，帶有負電荷的一端具有親水性(或水溶性)，由脂肪酸組成的另一端具有親脂性(或脂溶性)。PS是磷脂中的一種，天然含量稀少，但它是大腦中主要的酸性磷脂，能控制和調(diào)節(jié)細胞膜關(guān)鍵蛋白的功能狀態(tài)。PS占細胞膜雙分子層磷脂的10％-20％，對中樞神經(jīng)作用顯著，能提高腦細胞的活力，改善大腦功能、修復大腦損傷，成為“腦專一性營養(yǎng)物質(zhì)”，逐漸引起人們廣泛關(guān)注。單純地服用DHA會造成胃腸的負擔，而且DHA不容易通過血腦屏障。研究表明，PS可以作為DHA的一種載體，當DHA結(jié)合到磷脂酰絲氨酸甘油骨架2位時，DHA的穩(wěn)定性更高，而且更易通過血腦屏障。DHA和PS在體外以2-DHA-PS的形式被吸收后，在大腦中最終轉(zhuǎn)化為DHA-PS而進行神經(jīng)保護作用，2-DHA-PS可以兼具DHA和PS的生物學功能。磷脂酶A2(PhospholipaseA2，PLA2)，是磷脂-2-?；饷?EC3.1.1.4)，它催化甘油磷脂sn-2位酯鍵的水解反應(yīng)，生成溶血磷脂和脂肪酸，在磷脂分解代謝中有重要作用，此外某些來源的PLA2具有催化磷脂sn-2位磷酸二脂酯鍵堿基交換的功能。PLA2廣泛存在于自然界，幾乎所有的生物細胞及亞細胞中都有這種酶。存在于細胞內(nèi)的PLA2，濃度、酶活較低，但參與許多重要的生理代謝過程；存在于細胞外的PLA2，含量高、活力強、易于富集純化，是工業(yè)商品PLA2的主要來源。PLA2在多個領(lǐng)域具有應(yīng)用價值：1、用于溶血磷脂的制備：溶血磷脂在食品加工中可作為乳化分散劑、乳化劑使用，溶血磷脂添加在護膚化妝品中，能起到舒展皮膚皺紋，改善粗糙結(jié)構(gòu)的作用；2、用于油脂精煉：PLA2可以將油脂中的磷脂轉(zhuǎn)化成易于溶解在水中的溶血磷脂，然后經(jīng)過離心即可除去油脂中的磷脂，以達到脫膠的目的。3、用于功能性磷脂的制備：由于某些PLA2具有催化磷脂sn-2位磷酸二脂酯鍵堿基交換的功能，可以將不飽和脂肪酸(如二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸)整合在磷脂骨架中，從而提高磷脂的生理功能。但是大部分PLA2只具有水解作用，而本研究中來自于豬胰腺的PLA2不僅具有水解作用，還具有轉(zhuǎn)酯作用，可以用來制備功能性磷脂。雖然PLA2具有很多應(yīng)用價值，但距工業(yè)生產(chǎn)的需要，特別是與其他酶生產(chǎn)和應(yīng)用相比，存在很大的差距，主要原因是：1、酶源狹窄，目前PLA2主要從動物胰臟、蛇毒、蜂毒中提取，也有從動物內(nèi)臟或微生物中提取PLA2，但是工藝復雜，不利于PLA2的大量生產(chǎn)和利用；2、該酶的作用機理尚未完全搞清，目前對其催化磷脂sn-2位磷酸二脂酯鍵水解的研究較多，而對催化磷脂sn-2位磷酸二脂酯鍵堿基交換的研究甚少。畢赤酵母是一種單細胞低等真核生物，培養(yǎng)條件普通，生長繁殖速度迅速。畢赤酵母表達系統(tǒng)用于表達基因工程產(chǎn)品時，可以大規(guī)模生產(chǎn)，有效降低了生產(chǎn)成本。畢赤酵母表達系統(tǒng)具有一定的翻譯后加工能力，收獲的外源蛋白質(zhì)具有一定程度上的折疊加工和糖基化修飾，性質(zhì)較原核表達系統(tǒng)表達的蛋白質(zhì)更加穩(wěn)定，畢赤酵母表達系統(tǒng)具有兩種表達形式，包括畢赤酵母游離表達系統(tǒng)和畢赤酵母細胞表面展示系統(tǒng)。畢赤酵母游離表達系統(tǒng)表達的外源基因具有一定的翻譯后加工能力，收獲的外源蛋白質(zhì)具有一定程度上的折疊加工和糖基化修飾，性質(zhì)較原核表達系統(tǒng)表達的蛋白質(zhì)更加穩(wěn)定，某些酵母表達系統(tǒng)具有外分泌信號序列，能夠?qū)⑺磉_的外源蛋白質(zhì)分泌到細胞外，易于純化，而畢赤酵母細胞表面展示系統(tǒng)除具有外源基因的翻譯后加工能力和蛋白的折疊加工及適度糖基化的優(yōu)點外，經(jīng)該系統(tǒng)得到的全細胞催化劑還可以重復利用從而降低生產(chǎn)成本。畢赤酵母表達系統(tǒng)已成為現(xiàn)代分子生物學研究最重要的工具和模型，是表達外源基因比較理想的工具。在本發(fā)明中，對來源于豬胰腺的磷脂酶A2進行易錯PCR得到新型磷脂酶A2基因，在畢赤酵母表達系統(tǒng)中進行了表達，得到新型的畢赤酵母磷脂酶A2重組菌株(包括畢赤酵母磷脂酶A2游離表達重組菌株和畢赤酵母細胞表面展示磷脂酶A2重組菌株)。重組菌株發(fā)酵后，經(jīng)過相應(yīng)的處理可得新型磷脂酶A2催化劑。在新型磷脂酶A2催化劑的催化下，PS與DHA可生成2-DHA-PS。技術(shù)實現(xiàn)要素：：本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種磷脂酶A2突變體及其基因，本發(fā)明使用易錯PCR技術(shù)，對野生型豬胰腺磷脂酶A2進行隨機突變，得到磷脂酶A2突變體(Leu10Ala)。PS與DHA在磷脂酶A2突變體的催化下生成2-DHA-PS，經(jīng)分離純化得到2-DHA-PS產(chǎn)品。本發(fā)明實現(xiàn)目的技術(shù)路線如下：取新鮮豬胰腺于液氮中研碎，按照Trizol試劑說明書進行總RNA的提取并進行RT-PCR。以合成的cDNA第一鏈為模板，設(shè)計引物，擴增野生型豬胰腺磷脂酶A2基因序列(如SEQIDNO：3所示)。將其與pET22b連接后通過易錯PCR進行隨機突變，獲得磷脂酶A2突變體基因(如SEQIDNO：5所示)，構(gòu)建重組載體并在畢赤酵母GS115中成功表達，得到產(chǎn)新型磷脂酶A2的重組菌株，進一步通過發(fā)酵獲得新型磷脂酶A2。PS與DHA在新型磷脂酶A2的催化下生成2-DHA-PS，經(jīng)分離純化得到2-DHA-PS產(chǎn)品。在本發(fā)明中采用如下定義：1、氨基酸和DNA核酸序列的命名法使用氨基酸殘基的公認IUPAC命名法，用三字母代碼形式。DNA核酸序列采用公認IUPAC命名法。2、磷脂酶A2突變體的標識采用“原始氨基酸位置替換的氨基酸”來表示磷脂酶A2突變體中突變的氨基酸。如Leu10Ala，表示位置10的氨基酸由親本磷脂酶A2的Leu替換成Ala，位置的編號對應(yīng)于SEQIDNO：4中野生型磷脂酶A2的氨基酸序列編號。在本發(fā)明中，PLA2表示原始磷脂酶A2(氨基酸序列如SEQIDNO：4所示)，PLA2M表示突變后的磷脂酶A2(氨基酸序列如SEQIDNO：6所示)；pla2表示原始磷脂酶A2的基因(如SEQIDNO：3所示)，pla2m表示突變后磷脂酶A2的基因(如SEQIDNO：5所示)。磷脂酶A2堿基氨基酸PLA2第28位為T、第29位為T第10位為LeuPLA2M第28位為G、第29位為C第10位為Ala用于表達所述的磷脂酶A2突變體的宿主細胞為畢赤酵母GS115，表達載體為pPIC9K；用于表達所述的磷脂酶A2突變體的宿主細胞為畢赤酵母GS115，展示載體為pPIC9K-Flo；有益效果：1、本發(fā)明中磷脂酶A2突變體基因在畢赤酵母表達系統(tǒng)中進行了表達，得到畢赤酵母磷脂酶A2突變體重組菌株(包括畢赤酵母磷脂酶A2突變體游離表達重組菌株和畢赤酵母細胞表面展示磷脂酶A2突變體重組菌株)，重組菌株發(fā)酵后，經(jīng)過相應(yīng)的處理可得新型磷脂酶A2催化劑。2、本發(fā)明使用易錯PCR技術(shù)，對野生型磷脂酶A2進行隨機突變，得到磷脂酶A2突變體PLA2M，酶活較野生型磷脂酶A2的酶活提高了27％。3、本發(fā)明采用酵母展示系統(tǒng)，將新型磷脂酶A2展示于酵母表面，酵母細胞既作為酶的生產(chǎn)者，又可以充當固定化酶中的載體，免去了酶的純化和固定等操作，簡化了生產(chǎn)環(huán)節(jié)，降低了生產(chǎn)成本。4、本發(fā)明提供了一種催化制備2-DHA-PS的方法，2-DHA-PS經(jīng)過新型磷脂酶A2催化反應(yīng)制備而得，改善了現(xiàn)有合成方法產(chǎn)量低、選擇性不高、無法獲取高純度2-DHA-PS的問題，通過本發(fā)明的方法可制備2-DHA-PS，在醫(yī)藥、食品及保健品領(lǐng)域具有很大的應(yīng)用潛力。附圖說明：圖1為野生型磷脂酶A2成熟肽基因的PCR擴增電泳圖其中：M為DNAMarker，1為pla2成熟肽基因；圖2為本發(fā)明重組質(zhì)粒pPIC9K-pla2m酶切驗證圖其中：M為DNAMarker，1為pPIC9K-pla2m經(jīng)EcoRI和NotI雙酶切；圖3為本發(fā)明重組質(zhì)粒pPIC9K-Flo-pla2m酶切驗證圖其中：M為DNAMarker，1為pPIC9K-Flo-pla2m經(jīng)SnaBI和EcoRI雙酶切。具體實施方式：下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容做進一步說明；下述實施例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實施例來限定本發(fā)明的保護范圍。實施例1:野生型豬胰腺磷脂酶A2成熟肽基因pla2的獲得1、取新鮮豬胰腺于液氮中研碎，按照Trizol試劑說明書進行總RNA的提取并進行RT-PCR。2、以合成的cDNA第一鏈為模板，根據(jù)Genbank序列號Y00146.1登錄的pla2序列，在其ORF框上下游設(shè)計一對引物，分別引入限制性酶切位點BamHI、HindⅢ。設(shè)計本發(fā)明的pla2成熟肽基因的擴增引物如下：上游引物P1(SEQIDNO.1)：5’-CGCGGATCCATGCAGGAAGGCATCAGC-3’下游引物P2(SEQIDNO.2)：5’-CCCAAGCTTTTAACAGTACTTCTTGGTGTCCAG-3’其擴增的反應(yīng)體系為：2×buffer25μLdNTPs(2.5mmol/Leach)2μL上游引物P1(20μmol/L)5μL下游引物P2(20μmol/L)5μLDNA模版2μLPyrobest酶0.5μLddH2O10.5μL總體積50μL擴增條件為：95℃預變性5min；95℃變性30s，60℃退火40s，72℃延伸1min30s反應(yīng)30個循環(huán)；72℃延伸10min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)0.8％瓊脂糖凝膠電泳，得到399bp的條帶(圖1)，用小量DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，得到本發(fā)明的野生型磷脂酶A2成熟肽基因(pla2)，測序后見序列3。將擴增獲得的pla2與pET22b載體連接，得到重組質(zhì)粒pET22b-pla2，并化轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中，經(jīng)BamHI、HindⅢ雙酶切驗證，pla2已成功克隆到pET22b載體上。實施例2:磷脂酶A2突變體基因pla2m的獲得1.基于易錯PCR技術(shù)進行隨機突變，構(gòu)建磷脂酶A2突變體，設(shè)計引物如下：上游引物P1(SEQIDNO.1)：5’-CGCGGATCCATGCAGGAAGGCATCAGC-3’下游引物P2(SEQIDNO.2)：5’-CCCAAGCTTTTAACAGTACTTCTTGGTGTCCAG-3’在易錯PCR反應(yīng)體系中，以P1和P2作為上下游引物，以pla2成熟肽基因為模板，進行易錯PCR。其擴增的反應(yīng)條件為：10×PCR緩沖液(無Mg2+)10.0μLdATP0.2μLdGTP0.2μLdCTP1.0μLdTTP1.0μL上游引物P11.5μL下游引物P21.5μL野生型磷脂酶A21.0μLTaqDNA聚合酶1.0μLMg2+(7mM)28μLMn2+(0.15mM)2μLddH2O52.6uL擴增條件為：95℃預變性5min；95℃變性30s，60℃退火40s，72℃延伸1min30s反應(yīng)30個循環(huán)；72℃延伸10min。2.將磷脂酶A2易錯PCR產(chǎn)物克隆入表達載體pET22b中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，接種于每孔含200μLLB液體培養(yǎng)基(含30μg/mL的Kan)的96孔細胞培養(yǎng)板中，于37℃條件下200r/min搖床培養(yǎng)，當OD600達到0.6，向每個孔中加入IPTG(終濃度1mmol/L)，在16℃下誘導16h，4℃下4000r/min離心15min后收集菌體，重懸于15mL預冷的pH為7.4的PBS緩沖液中，用低溫超高壓連續(xù)流動細胞破碎儀破碎細胞，破碎結(jié)束后，在4℃下12000r/min離心45min，收集上清獲得粗酶液，隨后進行酶活力檢測。3.磷脂酶A2活力測定(1)磷脂酶A2酶活測定原理微孔比色法是國外最新發(fā)展的一種磷脂酶A2測定法。其原理是基于1976年Aarsman等建立的巰基顯色法,即合成一種磷脂類似物2-硫代十六酰乙基磷酸膽堿(2-hexadecanoylthio-l-ethyl-phosphorylcholine，HEPC)作底物，該底物中sn-2位以硫酯鍵替代，仍可受磷脂酶A2水解，并釋放出游離巰基，與5,5’-二硫代硝基苯甲酸(DTNB)或其它顯色劑顯色,在410nm波長附近有最大吸收，測定吸收值，換算出巰基的量就可以求出酶活力。反應(yīng)在96孔板中進行，用酶標儀測定吸收值。酶活力定義為：37℃下每分鐘產(chǎn)生1nmol游離巰基的酶量為1個酶活力單位。(2)磷脂酶A2酶活測定方法基礎(chǔ)液：0.2mol/LpH8.0Tris-HCl緩沖液90ml，加入0.2mol/LCaCl2，5mmol/LDTNB，5mmol/L去氧膽酸鈉各20ml，充分混勻。工作液：5mmol/LHEPC1ml加基礎(chǔ)液15ml，混勻。對照液：蒸餾水1ml，加基礎(chǔ)液15ml，混勻。磷脂酶A2的測定步驟混勻，37℃溫育1h，測410nm波長A值，空白調(diào)零(3)酶活力計算磷脂酶A2活力(U/ml)＝73.5×(A測定孔-A對照孔)(4)磷脂酶A2酶活測定經(jīng)測定，PLA2M的酶活比PLA2提高了27％；4、序列測定測序(北京華大生物工程公司)結(jié)果表明，此時擴增得到突變位點為Leu10Ala的新型磷脂酶A2(pla2m)，見序列5。實施例3:畢赤酵母野生型磷脂酶A2及磷脂酶A2突變體游離表達重組菌的構(gòu)建1、PLA2和PLA2M表達載體pPIC9K-pla2、pPIC9K-pla2m的構(gòu)建分別將擴增產(chǎn)物野生型豬胰腺磷脂酶A2基因(pla2)和易錯PCR純化產(chǎn)物(pla2m)EcoRI和NotI雙酶切后與同樣雙酶切的畢赤酵母表達載體pPIC9K用連接酶進行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)Amp抗性篩選，菌落37℃過夜培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒，重組質(zhì)粒進行酶切驗證(見圖2)。將驗證正確的重組表達質(zhì)粒分別命名為pPIC9K-pla2和pPIC9K-pla2m。將經(jīng)過酶切后得到的陽性克隆送至北京華大基因科技股份有限公司測序，以保證目的片段序列的正確性。2、PLA2和PLA2M重組菌株的構(gòu)建及其高表達菌株的篩選(1)線性化質(zhì)粒DNA的制備在轉(zhuǎn)化畢赤酵母之前，要先將構(gòu)建好的重組表達質(zhì)粒pPIC9K-pla2和pPIC9K-pla2m線性化，以提高質(zhì)粒在畢赤酵母染色體上的整合效率。每次轉(zhuǎn)化需要線性化質(zhì)粒DNA10μg。用SalI限制性內(nèi)切酶進行線性化酶切。(2)線性化質(zhì)粒pPIC9K-pla2和pPIC9K-pla2m電轉(zhuǎn)化畢赤酵母、陽性轉(zhuǎn)化子的鑒定及新型磷脂酶A2菌株的篩選①將80μL畢赤酵母GS115感受態(tài)細胞和10μg經(jīng)線性化的DNA加入到1.5mL預冷的離心管中，混勻，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到預先冰浴的轉(zhuǎn)化杯中；②將裝有轉(zhuǎn)化液的轉(zhuǎn)化杯冰浴5min后，在電轉(zhuǎn)電壓1500V，電轉(zhuǎn)時間5ms的條件下，進行畢赤酵母電轉(zhuǎn)化；③脈沖后，立即向轉(zhuǎn)化杯中加入1mL預冷的1mol/L的山梨醇溶液，把轉(zhuǎn)化液轉(zhuǎn)移到一個新的1.5mL離心管中；④30℃靜置培養(yǎng)lh，吸取畢赤酵母GS115電轉(zhuǎn)液200μL涂布在MD培養(yǎng)基上；⑤30℃培養(yǎng)直至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)；⑥挑取轉(zhuǎn)化子單菌落溶解在10μL去離子水中，取2μL菌液，加入Lyticase破壁酶，30℃反應(yīng)l0min，反應(yīng)液立即放入-80℃冰箱中冷凍l0min，使酵母細胞壁裂解，釋放的基因組作為模板進行PCR。以轉(zhuǎn)入空質(zhì)粒pPIC9K的畢赤酵母GS115/pPIC9K作為對照，確定陽性轉(zhuǎn)化子。⑦在確定陽性轉(zhuǎn)化子的基礎(chǔ)上，先用含不同濃度遺傳霉素的抗性平板篩選高遺傳霉素抗性的轉(zhuǎn)化子，然后分別測定這些高遺傳霉素抗性的轉(zhuǎn)化子的磷脂酶A2的酶活，以得到PLA2的重組菌株GS115/pPIC9K-pla2和PLA2M的重組菌株GS115/pPIC9K-pla2m。實施例4:畢赤酵母細胞表面展示PLA2和PLA2M重組菌的構(gòu)建1、重組質(zhì)粒pPIC9K-Flo-pla2和pPIC9K-Flo-pla2m的構(gòu)建野生型磷脂酶A2基因(pla2)、磷脂酶A2突變體基因(pla2m)和載體pPIC9K-Flo經(jīng)SnaBI和EcoRI雙酶切后，pla2、pla2m分別與pPIC9K-Flo連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)中，在含有Amp的LB固體培養(yǎng)基中篩選培養(yǎng)，挑取陽性轉(zhuǎn)化子，培養(yǎng)后提質(zhì)粒，雙酶切鑒定并測序(見圖3)，命名為pPIC9K-Flo-pla2和pPIC9K-Flo-pla2m。2、畢赤酵母重組菌的構(gòu)建將測序正確的重組質(zhì)粒經(jīng)SalI線性化后，用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，MD平板篩選重組子，獲得畢赤酵母細胞表面展示野生型磷脂酶A2重組菌GS115/pPIC9K-Flo-pla2和畢赤酵母細胞表面展示磷脂酶A2突變體重組菌GS115/pPIC9K-Flo-pla2m。實施例5：PLA2和PLA2M在畢赤酵母游離表達重組菌中的表達及制備將培養(yǎng)于YPD固體平板上實施例3所得到的畢赤酵母游離表達重組菌GS115/pPIC9K-pla2和GS115/pPIC9K-pla2m分別接種至YPD液體培養(yǎng)基中，30℃、250r/min培養(yǎng)24h。以1％的接種量轉(zhuǎn)接到新鮮BMGY培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)24h，然后6000r/min離心5min得到菌體，轉(zhuǎn)入BMMY培養(yǎng)基中。30℃、250r/min，每隔24h補甲醇，使其終濃度保持在0.5％V/V，培養(yǎng)120h后可得到磷脂酶A2的粗酶液。測定其磷脂酶A2酶活，其中畢赤酵母游離表達野生型PLA2的酶活可達89U/ml，畢赤酵母游離表達PLA2M的酶活可達113U/ml，比野生型PLA2的酶活提高了27％。然后采用分級鹽析法沉淀野生型PLA2和新型PLA2M，收集蛋白質(zhì)沉淀，溶解后，透析除鹽，再經(jīng)離子交換層析、凝膠層析后，冷凍干燥制得野生型PLA2和新型PLA2M酶粉。實施例6：畢赤酵母細胞表面展示PLA2和PLA2M全細胞催化劑的制備將培養(yǎng)于YPD固體平板上實施例4得到的畢赤酵母細胞表面展示重組菌GS115/pPIC9K-Flo-pla2和GS115/pPIC9K-Flo-pla2m分別接種至YPD液體培養(yǎng)基中，30℃、250r/min培養(yǎng)24h，以1％的接種量轉(zhuǎn)接到新鮮BMGY培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)24h，然后6000r/min離心5min得到菌體，轉(zhuǎn)入BMMY培養(yǎng)基中，30℃、250r/min培養(yǎng)120h，每隔24h補甲醇，使其終濃度保持在0.5％V/V，然后離心收集取菌體，用雙蒸水洗2次，通過真空冷凍干燥制得畢赤酵母細胞表面展示PLA2全細胞催化劑和PLA2M全細胞催化劑。測定其磷脂酶A2酶活，其中野生型PLA2全細胞催化劑的酶活可達237U/g，PLA2M全細胞催化劑的酶活可達301U/g。實施例7：本發(fā)明采用的2-DHA-PS的分析方法樣品中2-DHA-PS相對含量的分析方法為液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(HPLC/ESI/MSn)，具體過程是取適量的樣品，溶解于氯仿:甲醇＝1:1(v/v)溶液中，并在樣品溶液中加入1μM的磷酯酰絲氨酸(PS(14:0/14:0))內(nèi)標物。利用HPLC/ESI/MSn法檢測的色譜條件為：固定相：Si60色譜柱(125mm×4mm,5μm)；柱溫：25℃；樣品溶液進樣量：5μl；采用柱后分流技術(shù)：色譜柱內(nèi)流速為1mL/min，分流后流入質(zhì)譜離子源的流速為0.2mL/min；流動相體系：流動相A：氯仿:甲醇:氫氧化銨＝89:10.5:0.5(v/v/v)；流動相B：氯仿:甲醇:氫氧化銨:水＝55:39.5:0.5:5(v/v/v/v)；洗脫梯度程序:0-45min，95％A-50％A，5％B-50％B；45-60min，50A-95％A，50％B-5％B；利用HPLC/ESI/MSn法檢測的質(zhì)譜條件為：離子化方式：ESI(負離子方式)；掃描范圍在m/z550～1000；噴霧電壓為4.5KV；離子傳輸管的溫度為350℃；2-DHA-PS相對含量的表征方法為：2-DHA-PS轉(zhuǎn)化率(％)＝2-DHA-PS/PS*100％實施例8：PLA2和PLA2M的酶粉催化制備2-DHA-PS以PS和DHA為底物，實施例5所得PLA2和PLA2M的酶粉為催化劑制備2-DHA-PS。反應(yīng)體系為：PS的質(zhì)量160mg、DHA的質(zhì)量280mg溶于5g甘油，磷脂酶A2酶粉3mg溶于0.5mL1mmoL/LpH＝8.0的Tris-HCl緩沖溶液(含3mmoL/LCaCl2)，混合，反應(yīng)溫度為50℃、反應(yīng)轉(zhuǎn)速為500rpm/min、反應(yīng)時間為32h時。PS和DHA經(jīng)PLA2酶粉催化得到2-DHA-PS的轉(zhuǎn)化率為23％，PS和DHA經(jīng)PLA2M酶粉催化得到2-DHA-PS的轉(zhuǎn)化率為39％。實施例9：PLA2和PLA2M的全細胞催化劑催化制備2-DHA-PS以PS和DHA為底物，實施例6制備的PLA2和PLA2M的全細胞催化劑為催化劑制備2-DHA-PS。反應(yīng)體系為：PS的質(zhì)量為160mg、DHA的質(zhì)量為280mg溶于5g甘油，磷脂酶A2全細胞催化劑4mg溶于0.5mL1mmoL/LpH＝8.0的Tris-HCl緩沖溶液(含3mmoL/LCaCl2)，混合，反應(yīng)溫度為50℃、反應(yīng)轉(zhuǎn)速為500rpm/min、反應(yīng)時間為32h時。PS和DHA經(jīng)PLA2全細胞催化劑催化得到2-DHA-PS的轉(zhuǎn)化率為32％，PS和DHA經(jīng)PLA2M全細胞催化劑催化得到2-DHA-PS的轉(zhuǎn)化率為56％。SEQUENCELISTING<110>天津科技大學<120>一種新型磷脂酶A2及其制備2-DHA-PS的方法<130>1<160>6<170>PatentInversion3.5<210>1<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>1cgcggatccatgcaggaaggcatcagc27<210>2<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>2cccaagcttttaacagtacttcttggtgtccag33<210>3<211>399<212>DNA<213>豬胰腺<400>3atgcaggaaggcatcagctcaagggcattatggcagtttcgtagcatgattaagtgcgca60atccccggcagtcaccccttgatggatttcaacaactatggctgctactgtggcctaggt120ggatcagggacccctgtggatgaactggacaggtgctgcgagacacacgacaactgctac180agagatgccaagaacctggacagctgtaaattcctcgtggacaatccctacaccgaaagc240tactcctactcatgttctaacactgagatcacctgcaacagcaaaaacaatgcttgtgag300gccttcatctgtaactgtgaccgaaatgctgccatttgcttctcaaaggccccatacaac360aaggagcacaagaacctggacaccaagaagtactgttaa399<210>4<211>133<212>PRT<213>豬胰腺<400>4MetGlnGluGlyIleSerSerArgAlaLeuTrpGlnPheArgSerMet151015IleLysCysAlaIleProGlySerHisProLeuMetAspPheAsnAsn202530TyrGlyCysTyrCysGlyLeuGlyGlySerGlyThrProValAspGlu354045LeuAspArgCysCysGluThrHisAspAsnCysTyrArgAspAlaLys505560AsnLeuAspSerCysLysPheLeuValAspAsnProTyrThrGluSer65707580TyrSerTyrSerCysSerAsnThrGluIleThrCysAsnSerLysAsn859095AsnAlaCysGluAlaPheIleCysAsnCysAspArgAsnAlaAlaIle100105110CysPheSerLysAlaProTyrAsnLysGluHisLysAsnLeuAspThr115120125LysLysTyrCysIle130<210>5<211>399<212>DNA<213>人工序列<400>5atgcaggaaggcatcagctcaagggcagcatggcagtttcgtagcatgattaagtgcgca60atccccggcagtcaccccttgatggatttcaacaactatggctgctactgtggcctaggt120ggatcagggacccctgtggatgaactggacaggtgctgcgagacacacgacaactgctac180agagatgccaagaacctggacagctgtaaattcctcgtggacaatccctacaccgaaagc240tactcctactcatgttctaacactgagatcacctgcaacagcaaaaacaatgcttgtgag300gccttcatctgtaactgtgaccgaaatgctgccatttgcttctcaaaggccccatacaac360aaggagcacaagaacctggacaccaagaagtactgttaa399<210>6<211>133<212>PRT<213>人工序列<400>6MetGlnGluGlyIleSerSerArgAlaAlaTrpGlnPheArgSerMet151015IleLysCysAlaIleProGlySerHisProLeuMetAspPheAsnAsn202530TyrGlyCysTyrCysGlyLeuGlyGlySerGlyThrProValAspGlu354045LeuAspArgCysCysGluThrHisAspAsnCysTyrArgAspAlaLys505560AsnLeuAspSerCysLysPheLeuValAspAsnProTyrThrGluSer65707580TyrSerTyrSerCysSerAsnThrGluIleThrCysAsnSerLysAsn859095AsnAlaCysGluAlaPheIleCysAsnCysAspArgAsnAlaAlaIle100105110CysPheSerLysAlaProTyrAsnLysGluHisLysAsnLeuAspThr115120125LysLysTyrCysIle130當前第1頁1 2 3