本發(fā)明涉及酶的改造，特別涉及一種熱穩(wěn)定無機(jī)焦磷酸酶的改造。
背景技術(shù)：
在生物體內(nèi)，NTPs/dNTPs參與核酸的生物合成會生成副產(chǎn)物焦磷酸鹽，體內(nèi)存在的焦磷酸鹽會在焦磷酸酶的催化作用下分解，減少焦磷酸累積可能造成的負(fù)面效應(yīng)。PCR利用嗜熱酶模擬體內(nèi)核酸復(fù)制的體外反應(yīng)，伴隨dNTPs的參入，焦磷酸的累積同樣會降低PCR擴(kuò)增的效率。
焦磷酸的積累，會導(dǎo)致反應(yīng)混合物的pH降低，影響熒光染料的穩(wěn)定性(羅氏，200510099911.5)。為了去除這些焦磷酸對PCR的抑制，人們在PCR反應(yīng)中添加無機(jī)焦磷酸酶，用以將焦磷酸(PPi)會水解為正磷酸(Pi)。
這種反應(yīng)，會使反應(yīng)混合液的pH增加，并是的熒光染料變得更穩(wěn)定。
為了適應(yīng)PCR的高溫，這種焦磷酸酶必須能耐受95℃的高溫。
趙丹彤等人重組表達(dá)了超嗜熱古菌(Pyrococcus horikoshii)的PPase基因(趙丹彤.重組超嗜熱無機(jī)焦磷酸酶的表達(dá)、純化及酶學(xué)性質(zhì)研究[D].吉林大學(xué),2003.)，這種酶最適溫度為88℃，最適pH為10.3，并不適合PCR的使用。
牟航等人重組表達(dá)了嗜熱棲熱菌(Thermus thermophiles)HB27株的PPase基因(牟航,夏勇,吳學(xué)強(qiáng),等.耐熱無機(jī)焦磷酸酶的表達(dá)純化與性質(zhì)研究[C]//全國酶學(xué)學(xué)術(shù)討論會暨鄒承魯誕辰85周年紀(jì)念會.2008.)，王磊等人重組表達(dá)了嗜熱棲熱菌HB8株的PPase基因。這種酶的最適溫度在65℃，最適pH為8.0，適合PCR的使用。然而這種酶的95℃下的半衰期僅20min，不足以滿足預(yù)變性時間較長，以及循環(huán)數(shù)較多的PCR反應(yīng)。
由此，基于嗜熱棲熱菌的PPase基因，構(gòu)建一種改造的熱穩(wěn)定無機(jī)焦磷酸酶，這種酶可以應(yīng)用于需要更多循環(huán)數(shù)以及反應(yīng)時間的超敏PCR擴(kuò)增，增加反應(yīng)的擴(kuò)增效率。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種新的具有更高擴(kuò)增效率的熱穩(wěn)定無機(jī)焦磷酸酶。
本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：
一種熱穩(wěn)定無機(jī)焦磷酸酶，由序列為SEQ ID NO:1的無機(jī)焦磷酸酶改造而來，其改造方法為下述方法中的至少一種：
1)將第6位氨基酸T改造為氨基酸S；
2)將第11位氨基酸E改為氨基酸K；
3)將第72位氨基酸L改為氨基酸I；
4)將第73位氨基酸V改為氨基酸I；
5)將第124位氨基酸D改造為氨基酸A；
6)將第160位氨基酸A改造為Q或K。
一種熱穩(wěn)定無機(jī)焦磷酸酶，其序列為：
MANLKSLPVGKKAPEVVNMVIEVPRGSGNKYEYDPGLGVIKLDRVLPGAQFYPGDYGFIPSTLAEDGDPLDGIVLSTYPLLPGVVVEVRVVGLLLMEDEKGGDAKIIGVVAEDQRLDHIQDIAAVPEGVKQEIQHFFETYKALEAKKGKWVRVTGWRDRQAALEEVKACIARYGK(SEQ ID NO:2)。
一種熱穩(wěn)定無機(jī)焦磷酸酶，其序列為：
MANLKTLPVGEKAPEVVNMVIEVPRGSGNKYEYDPGLGVIKLDRVLPGAQFYPGDYGFIPSTLAEDGDPLDGLILSTYPLLPGVVVEVRVVGLLLMEDEKGGDAKIIGVVAEDQRLDHIQDIAAVPEGVKQEIQHFFETYKALEAKKGKWVRVTGWRDRKAALEEVKACIARYGK(SEQ ID NO:3)。
本發(fā)明的有益效果是：改造后的無機(jī)焦磷酸酶，相較于改造之前，具有更高的擴(kuò)增效率，熱穩(wěn)定性也更好。
附圖說明
圖1為焦磷酸酶擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)圖；其中a為無機(jī)焦磷酸酶1擴(kuò)增曲線，b為無機(jī)焦磷酸沒2擴(kuò)增曲線，c為改造前無機(jī)焦磷酸酶擴(kuò)增曲線，d為不添加無機(jī)焦磷酸酶的擴(kuò)增曲線。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例熱穩(wěn)定無機(jī)焦磷酸酶的改造
商品化的熱穩(wěn)定無機(jī)焦磷酸酶(MCLAB，貨號TL-100)，其序列為：MANLKTLPVGEKAPEVVNMVIEVPRGSGNKYEYDPGLGVIKLDRVLPGAQFYPGDYGFIPSTLAEDGDPLDGLVLSTYPLLPGVVVEVRVVGLLLMEDEKGGDAKIIGVVAEDQRLDHIQDIADVPEGVKQEIQHFFETYKALEAKKGKWVRVTGWRDRAAALEEVKACIARYGK(SEQ ID NO:1)。
將上述酶的位點(diǎn)進(jìn)行改造，改造位點(diǎn)及改造方法如下：
將原酶的序列的第6位氨基酸T改造為氨基酸S；第11位氨基酸E改為氨基酸K；第72位氨基酸L改為氨基酸I或者第73位氨基酸V改為氨基酸I；第124位氨基酸D改造為氨基酸A；第160位氨基酸A改造為Q或K。
獲得兩條氨基酸序列如下的熱穩(wěn)定焦磷酸酶：
無機(jī)焦磷酸酶1：
MANLKSLPVGKKAPEVVNMVIEVPRGSGNKYEYDPGLGVIKLDRVLPGAQFYPGDYGFIPSTLAEDGDPLDGIVLSTYPLLPGVVVEVRVVGLLLMEDEKGGDAKIIGVVAEDQRLDHIQDIAAVPEGVKQEIQHFFETYKALEAKKGKWVRVTGWRDRQAALEEVKACIARYGK(SEQ ID NO:2)。
無機(jī)焦磷酸酶2
MANLKTLPVGEKAPEVVNMVIEVPRGSGNKYEYDPGLGVIKLDRVLPGAQFYPGDYGFIPSTLAEDGDPLDGLILSTYPLLPGVVVEVRVVGLLLMEDEKGGDAKIIGVVAEDQRLDHIQDIAAVPEGVKQEIQHFFETYKALEAKKGKWVRVTGWRDRKAALEEVKACIARYGK(SEQ ID NO:3)。
按照上述焦磷酸酶的氨基酸序列人工合成對應(yīng)的堿基序列，擴(kuò)增構(gòu)建表達(dá)載體，表達(dá)蛋白并進(jìn)行純化。
實(shí)驗(yàn)例改造酶效果的檢測
將本專利中改造的熱穩(wěn)定無機(jī)焦磷酸酶，以及商品化的熱穩(wěn)定無機(jī)焦磷酸酶(MCLAB，貨號TL-100)，0.05U，0.5μL用酶透析液稀釋成0.1U/μL。
使用廣州海力特的HBV DNA檢測試劑盒(國械注準(zhǔn)20163400199)，檢測HBV病毒，按下表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：
除添加無機(jī)焦磷酸酶以外，按試劑盒說明書進(jìn)行操作，使用ABI 7500熒光PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，結(jié)果表明，焦磷酸酶1擴(kuò)增時Ct值為11.38，焦磷酸酶2擴(kuò)增時Ct值為11.61，原始熱穩(wěn)定無機(jī)磷酸酶擴(kuò)增時Ct值為15.55，而不添加無機(jī)磷酸酶的擴(kuò)增時Ct值為17.45。由此可見經(jīng)過改造后的無機(jī)焦磷酸酶擴(kuò)增效率更高，熱穩(wěn)定性更好。
SEQUENCE LISTING
<110> 廣州海力特生物科技有限公司
<120> 一種改造的熱穩(wěn)定無機(jī)焦磷酸酶
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 175
<212> PRT
<213> 無機(jī)焦磷酸酶
<400> 1
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1 5 10 15
Val Asn Met Val Ile Glu Val Pro Arg Gly Ser Gly Asn Lys Tyr Glu
20 25 30
Tyr Asp Pro Gly Leu Gly Val Ile Lys Leu Asp Arg Val Leu Pro Gly
35 40 45
Ala Gln Phe Tyr Pro Gly Asp Tyr Gly Phe Ile Pro Ser Thr Leu Ala
50 55 60
Glu Asp Gly Asp Pro Leu Asp Gly Leu Val Leu Ser Thr Tyr Pro Leu
65 70 75 80
Leu Pro Gly Val Val Val Glu Val Arg Val Val Gly Leu Leu Leu Met
85 90 95
Glu Asp Glu Lys Gly Gly Asp Ala Lys Ile Ile Gly Val Val Ala Glu
100 105 110
Asp Gln Arg Leu Asp His Ile Gln Asp Ile Ala Asp Val Pro Glu Gly
115 120 125
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130 135 140
Ala Lys Lys Gly Lys Trp Val Arg Val Thr Gly Trp Arg Asp Arg Ala
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