本發(fā)明涉及一種應(yīng)用于胎盤干細(xì)胞分離的方法。

背景技術(shù)：

人類胎盤是由胎兒組織與母體組織共同構(gòu)成的器官，是寶寶賴以生存的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)輸送的紐帶，由滋養(yǎng)細(xì)胞及大量起源于外中胚胚層的間充質(zhì)和血管共同組成，提示胎盤中存在MSC，并現(xiàn)已證實(shí)。胎盤組織學(xué)結(jié)構(gòu)分為羊膜、絨毛膜和底蛻膜三部分構(gòu)成。胎盤中有許多種類的干細(xì)胞，其中胎盤中間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)數(shù)量最多。MSCs是一類能夠自我更新，具有多向分化能力的多能干細(xì)胞，可以分化為骨、軟骨、脂肪、神經(jīng)和肝細(xì)胞等組織細(xì)胞，并表達(dá)特異性標(biāo)志，同時(shí)具有來(lái)源方便、含量豐富、無(wú)倫理學(xué)限制等優(yōu)點(diǎn)，因此更易應(yīng)用于臨床。

胎盤MSCs能抑制免疫和促進(jìn)造血重建的特性，使其在造血干細(xì)胞移植及移植后GVHD防治方面具有良好的應(yīng)用前景。通過(guò)對(duì)絨毛層和底蛻膜MSCs的免疫標(biāo)記檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)它們均陽(yáng)性表達(dá)典型的MSCs表面抗原CD13、CD29、CD44、CD54、CD73、CD105，陰性表達(dá)造血干細(xì)胞表面抗原CD3、CD14、CD34、CD45和內(nèi)皮細(xì)胞表面抗原CD31。而底蛻膜作為母-胎界面的組成部分之一，為母體面，意味著來(lái)源于底蛻膜的MSCs可作為母親來(lái)源的干細(xì)胞的一種。

MSCs本身的生物學(xué)特性和獨(dú)特的免疫調(diào)控功能在組織工程、細(xì)胞治療等方面具有廣泛的臨床應(yīng)用前景。同時(shí)，胎盤MSCs的優(yōu)勢(shì)還在于來(lái)源廣泛，胎兒娩出后，胎盤就失去作用，只要正常分娩的健康產(chǎn)婦知情同意，都能夠提供胎盤。與骨髓捐獻(xiàn)相比，供者無(wú)痛苦，污染機(jī)會(huì)少。

近年來(lái)MSCs已成為干細(xì)胞領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，它不僅支持造血系統(tǒng)，而且還可向中胚層和外胚層來(lái)源的組織分化，在特定的培養(yǎng)條件下可分化為骨、脂肪、軟骨、肌肉及內(nèi)皮等組織細(xì)胞。MSCs具有體外抑制淋巴細(xì)胞增殖、體內(nèi)延長(zhǎng)皮膚移植物存活的獨(dú)特免疫學(xué)特點(diǎn)，在長(zhǎng)期存活于異基因環(huán)境中具有優(yōu)勢(shì)，同時(shí)MSCs具有自我更新的能力。胎盤來(lái)源的MSCs易分離培養(yǎng)，增殖迅速，可以分化為3個(gè)胚層來(lái)源的細(xì)胞系，并有向傷處遷移的能力。與捐獻(xiàn)骨髓或采集動(dòng)員外周血相比，胎盤供者無(wú)痛苦，感染機(jī)會(huì)少。已有臨床給白血病患者輸注人白細(xì)胞抗原單倍型相合的父母骨髓MSCs獲得成功的病例。

胎盤干細(xì)胞的分離方法為組織塊法和酶解法兩種方法，組織塊法在培養(yǎng)細(xì)胞過(guò)程中，由于每次換液的影響，貼壁較慢，細(xì)胞爬出慢，細(xì)胞生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，容易導(dǎo)致細(xì)胞老化現(xiàn)象，而酶硝化法則能夠獲取細(xì)胞的數(shù)量多，而且細(xì)胞生長(zhǎng)周期較短，短時(shí)間能夠獲取足夠的細(xì)胞。

膠原酶在生理?xiàng)l件下主要水解結(jié)蹄組織中膠原蛋白成分，膠原酶僅對(duì)細(xì)胞間質(zhì)有消化作用，對(duì)上皮細(xì)胞影響不大,適用于消化分離纖維性組織，上皮組織和癌組織等，膠原酶根據(jù)不同功能分為I，II，III，IV，V共五種類型，只有根據(jù)所分離消化組織的種類來(lái)選擇膠原酶類型，由于本研究是對(duì)胎盤組織進(jìn)行消化，根據(jù)所選組織種類的不同，本研究選用I，II，IV，V四種類型酶進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。目前胎盤干細(xì)胞的獲取大多使用某種單一膠原酶，但使用某種單一型號(hào)的膠原酶存在消化的不夠徹底，過(guò)度消化，需要較多組織才能獲取一定量的細(xì)胞等問(wèn)題，本發(fā)明使用的自配混合型酶能夠在保證細(xì)胞活率的同時(shí)，消化的比較徹底，細(xì)胞貼壁率較高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了提高膠原酶分離胎盤組織干細(xì)胞的消化效率以及細(xì)胞獲取數(shù)量及細(xì)胞活率，而提供一種分離胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞混合酶及其分離方法。

本發(fā)明的一種分離胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞混合酶，它是按照體積比為1：0.5～1.5：0.5～1.5：1.5～2.5的比例將膠原酶I，II，IV，V混和而成；所述的膠原酶I，II，IV，V的質(zhì)量百分比濃度分別為0.5～0.8％，0.5～1.5％，0.5～0.8％和0.5～1.5％。

本發(fā)明的一種用混合酶分離胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，它是按照以下步驟進(jìn)行的：

一、將權(quán)利要求1制得的混合酶37℃預(yù)熱；

二、將待處理組織剪碎，按體積比為1:2.5～3的比例將混合酶與剪碎后的組織混合均勻；

三、置于37～38℃恒溫?fù)u床搖30～40min后，終止消化，過(guò)濾，離心；

四、獲取組織干細(xì)胞，接種于CO₂培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；

五、培養(yǎng)36h后，在無(wú)菌操作條件下將上清倒入離心管內(nèi)，在轉(zhuǎn)速為1300rpm的條件下離心6min，收集沉淀，即完成所述的用混合酶分離胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞。

本發(fā)明將膠原酶I，II，IV和V按照不同濃度進(jìn)行配置后按照一定比例進(jìn)行混合配置，用于分離胎盤組織干細(xì)胞，對(duì)組織消化徹底，組織內(nèi)細(xì)胞不受影響，保證組織細(xì)胞的活性，對(duì)細(xì)胞表面抗原不受影響，細(xì)胞增殖能力較強(qiáng)，操作方法簡(jiǎn)單，比市面上單一出售的膠原酶消化效率高，能夠獲取更多的組織干細(xì)胞。獲取胎盤干細(xì)胞免疫標(biāo)記檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)它們均表達(dá)典型的MSCs表面抗原CD13、CD29、CD44、CD54、CD73、CD105，不表達(dá)造血干細(xì)胞表面抗原CD3、CD14、CD34、CD45和內(nèi)皮細(xì)胞表面抗原CD31，符合干細(xì)胞的特性。

本發(fā)明包含以下有益效果：

由于單一的膠原酶消化的蛋白酶種類比較局限，部分蛋白酶不能夠完全分解，容易過(guò)度消化，將不同膠原酶按照不同比例混合后能夠充分分解多種蛋白酶；

由多種不同膠原酶混合后的混合型膠原酶消化后的組織消化的比較徹底，獲取的組織細(xì)胞數(shù)量較多，活率較高，高達(dá)99％以上，顯著高于其它各組；

培養(yǎng)后的胎盤干細(xì)胞表型表達(dá)符合干細(xì)胞的特性，細(xì)胞增殖功能，分化功能及細(xì)胞形態(tài)均較好；

培養(yǎng)后的胎盤組織干細(xì)胞具有分化功能，能夠完全分化為成骨、成脂等細(xì)胞，保護(hù)了干細(xì)胞的分化功能；

由于混合型酶消化的較徹底，因此，很少組織即可獲取更多高活性的細(xì)胞；

通過(guò)計(jì)算細(xì)胞貼壁率發(fā)現(xiàn)，混合型酶消化分離胎盤干細(xì)胞后，原代細(xì)胞貼壁率達(dá)98％以上,顯著高于每種單獨(dú)酶消化的細(xì)胞貼壁率；

通過(guò)檢測(cè)胎盤干細(xì)胞增值功能，通過(guò)生長(zhǎng)曲線計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)P5代細(xì)胞與P3代細(xì)胞的增值功能未見(jiàn)顯著差異(p＞0.05)。

附圖說(shuō)明

圖1為P0代細(xì)胞培養(yǎng)(4x)后的胎盤干細(xì)胞培養(yǎng)形態(tài)學(xué)觀察；

圖2為P1代細(xì)胞培養(yǎng)(4x)后的胎盤干細(xì)胞培養(yǎng)形態(tài)學(xué)觀察；

圖3為P3代細(xì)胞培養(yǎng)(4x)后的胎盤干細(xì)胞培養(yǎng)形態(tài)學(xué)觀察；

圖4為P5代細(xì)胞培養(yǎng)(4x)后的胎盤干細(xì)胞培養(yǎng)形態(tài)學(xué)觀察；

圖5為胎盤干細(xì)胞P3,P5代生長(zhǎng)曲線測(cè)定圖；其中，A為P3代生長(zhǎng)曲線，B為P5代生長(zhǎng)曲線；

圖6為P3代胎盤干細(xì)胞成骨分化(10X)結(jié)果觀察；

圖7為P3代胎盤干細(xì)胞成骨分化(10X)結(jié)果觀察；

圖8為P3代胎盤干細(xì)胞成脂分化(10X)結(jié)果觀察；

圖9為P5代胎盤干細(xì)胞成脂分化(10X)結(jié)果觀察。

具體實(shí)施方式

具體實(shí)施方式一：本實(shí)施方式的一種分離胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞混合酶，它是按照體積比為1：0.5～1.5：0.5～1.5：1.5～2.5的比例將膠原酶I，II，IV，V混和而成；所述的膠原酶I，II，IV，V的質(zhì)量百分比濃度分別為0.5～0.8％，0.5～1.5％，0.5～0.8％和0.5～1.5％。

具體實(shí)施方式二：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一相同的是：它是按照體積比為1：1：1：2的比例將膠原酶I，II，IV，V混和而成；所述的膠原酶I，II，IV，V的質(zhì)量百分比濃度分別為0.5％，1％，0.5％和1％。其它與具體實(shí)施方式一相同。

具體實(shí)施方式三：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一相同的是：所述的高效分離胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞混合酶過(guò)0.22um濾器過(guò)濾除菌，-20℃下無(wú)菌保存。其它與具體實(shí)施方式一相同。具體實(shí)施方式四：本實(shí)施方式一種用混合酶分離胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，它是按照

以下步驟進(jìn)行的：

一、將權(quán)利要求1制得的混合酶37℃預(yù)熱；

二、將待處理組織剪碎，按體積比為1:2.5～3的比例將混合酶與剪碎后的組織混合均勻；

三、置于37～38℃恒溫?fù)u床搖30～40min后，終止消化，過(guò)濾，離心；

四、獲取組織干細(xì)胞，接種于CO₂培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；

五、培養(yǎng)36h后，在無(wú)菌操作條件下將上清倒入離心管內(nèi)，在轉(zhuǎn)速為1300rpm的條件下離心6min，收集沉淀，即完成所述的用混合酶分離胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞。

具體實(shí)施方式五：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式四不同的是：混合酶與剪碎后的組織混合比例為1:2.7。其它與具體實(shí)施方式四相同。

本發(fā)明內(nèi)容不僅限于上述各實(shí)施方式的內(nèi)容，其中一個(gè)或幾個(gè)具體實(shí)施方式的組合同樣也可以實(shí)現(xiàn)發(fā)明的目的。

通過(guò)以下實(shí)施例驗(yàn)證本發(fā)明的有益效果：

實(shí)施例1

本實(shí)施例的一種分離胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞混合酶，它是按照體積比為1：1：1：2的比例將膠原酶I，II，IV和V混和而成；所述的膠原酶I，II，IV和V的質(zhì)量百分比濃度分別為0.5％，1％，0.5％和1％。

本實(shí)施例的一種用混合酶分離胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，它是按照以下步驟進(jìn)行的：

一、將上述制得的混合酶37℃預(yù)熱；

二、將待處理組織剪碎，按體積比為1:2的比例將混合酶與剪碎后的組織混合均勻；

三、置于37℃恒溫?fù)u床搖30min后，終止消化，過(guò)濾，離心；

四、獲取組織干細(xì)胞，接種于CO₂培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；

五、培養(yǎng)36h后，在無(wú)菌操作條件下將上清倒入離心管內(nèi)，在轉(zhuǎn)速為1300rpm的條件下離心6min，收集沉淀，即完成所述的用混合酶分離胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞；

六、向傾倒上清后的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)補(bǔ)充11ml含(bFGF和EGF因子)DMEM╱F12繼續(xù)培養(yǎng)；

七、對(duì)收集的沉淀，計(jì)算沉淀細(xì)胞數(shù)(未貼壁，漂浮的細(xì)胞)，根據(jù)接種的細(xì)胞數(shù)和離心沉淀的細(xì)胞數(shù)計(jì)算細(xì)胞貼壁率。

結(jié)果如表1所示。

表1不同酶使用對(duì)比研究結(jié)果

注：貼壁率＝(貼壁細(xì)胞╱接種細(xì)胞總數(shù))*100％

由上表可知，單一的某種酶消化后的細(xì)胞活率，貼壁率顯著低于混合型酶消化后的細(xì)胞活率和貼壁率，推斷由于單一酶消化的蛋白種類較為單一，消化不徹底，若想獲取更多的細(xì)胞數(shù)量，則容易導(dǎo)致過(guò)度消化，細(xì)胞活率和貼壁率均降低。但多種不同膠原酶混合后消化組織則比較徹底，能夠分解多種蛋白，獲取的組織細(xì)胞數(shù)量較多，活率高達(dá)99％以上，顯著高于其它組。通過(guò)計(jì)算細(xì)胞貼壁率發(fā)現(xiàn)，混合型酶消化分離胎盤干細(xì)胞后，原代細(xì)胞貼壁率達(dá)98％以上。

通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，使用混合型酶消化后細(xì)胞形態(tài)均較好，渦旋狀，長(zhǎng)梭形；通過(guò)生長(zhǎng)曲線檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖能力較強(qiáng)，在2.5d-6.5d為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)混合型酶消化后獲取細(xì)胞的表面標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)表達(dá)率均符合間充質(zhì)干細(xì)胞的特性；通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞的成骨和成脂分化能力，發(fā)現(xiàn)使用混合型酶消化后的細(xì)胞均能夠分化為成骨細(xì)胞和成脂細(xì)胞。