本發(fā)明涉及細(xì)胞分離
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及了一種人脂肪組織消化酶及其制備方法。
背景技術(shù)：
：人脂肪干細(xì)胞是可以進(jìn)行細(xì)胞再生的多能成人干細(xì)胞，它們被稱作“神奇的種子”，具有治療疾病、使器官再生、甚至延年益壽的潛力，這對當(dāng)前的行醫(yī)方式有著很大的改變，如何快速、準(zhǔn)確的分離高活力的脂肪干細(xì)胞是研發(fā)脂肪干細(xì)胞各項(xiàng)功能的前提。目前普遍采用消化的方法進(jìn)行人脂肪干細(xì)胞的分離、提取，但現(xiàn)有技術(shù)在操作過程中脂肪組織總是粘在一起，震蕩時脂肪組織也會黏成團(tuán)，即使移液器吹打不開；上清分離后放到培養(yǎng)瓶中在顯微鏡下觀察，視野中會出現(xiàn)大量的組織碎片，僅有少量的細(xì)胞存在。為了解決上述問題，人們通過改變消化酶配方或者消化方法來獲取更優(yōu)質(zhì)的人脂肪干細(xì)胞。中國專利，公開號CN102719396A，公開了一種人體脂肪干細(xì)胞快速提取方法，該方法使用了專用的人脂肪組織消化劑，其成分包含膠原酶IV型、胰蛋白酶-EDT復(fù)合體、抗胰蛋白酶和二甲基亞砜，從而可以使脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞充分游離出來同時保護(hù)細(xì)胞不受傷害，最終獲得充分游離且存活率高的人脂肪干細(xì)胞。中國專利，公開號CN104357387A，公開了一種人體脂肪干細(xì)胞的分離方法，使用含有低分子肝素鈣的生理鹽水清洗人脂肪組織，可很好的去處雜質(zhì)，從而分離出純度更高的人脂肪干細(xì)胞。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：基于
背景技術(shù)：
存在的技術(shù)問題，本發(fā)明提出了一種用于臨床級別分離脂肪干細(xì)胞的組織消化酶，該消化酶中包括膠原酶和DNA酶，大大縮短了消化時間，使消化粘稠度降低，添加青霉素可有效防止樣本在采集的過程中污染以及運(yùn)輸過程中細(xì)菌的滋生。一種人脂肪組織消化酶，包括按照重量份計(jì)的如下組份：膠原酶30-50份、DNA酶0.1-0.8份。優(yōu)選的，所述組織消化酶還包括抗生素。優(yōu)選的，所述抗生素包括青霉素4-10份、鏈霉素15-23份。優(yōu)選的，所述組織消化酶包括膠原酶40份、DNA酶0.4份、青霉素6份、鏈霉素20份。一種人脂肪組織消化酶的制備方法，方法步驟如下：S1：在無菌安全柜內(nèi)稱取膠原酶，加入DMEM培養(yǎng)基中；S2：稱取DNA酶加入S1制得的培養(yǎng)基中；S3：稱取青霉素和鏈霉素加入S2制得的培養(yǎng)基中；S4：將S3制得的培養(yǎng)基經(jīng)過0.22μm的濾網(wǎng)過濾，放置于4℃?zhèn)溆?。進(jìn)一步的，所述DMEM培養(yǎng)基為低糖型。一種人脂肪組織消化酶可應(yīng)用于分離脂肪干細(xì)胞。脂肪組織中含有血管和纖維組織以及大量的干細(xì)胞。膠原酶的化學(xué)名為膠原蛋白水解酶(Collagenase)，它能在生理pH和溫度條件下特異性地水解天然膠原蛋白的三維螺旋結(jié)構(gòu)，而不損傷其它蛋白質(zhì)和組織。膠原酶的化學(xué)本質(zhì)是一種蛋白質(zhì)。在臍帶消化酶中添加膠原酶就是為了特異性的水解臍帶組織中的蛋白質(zhì)，使間充質(zhì)干細(xì)胞充分的暴露出來。在膠原酶中添加了DNA酶，DNA酶防止分離細(xì)胞時，細(xì)胞黏附聚集。抗生素是青霉素與鏈霉素，自然環(huán)境下(不考慮人為產(chǎn)生的抗藥性)，對青霉素不敏感的微生物絕大多數(shù)對鏈霉素敏感，反之亦然。兩種抗生素搭配可以控制幾乎全部常見細(xì)菌。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的有益效果在于：本發(fā)明提出的一種人脂肪組織消化酶，在膠原酶中添加了DNA酶，DNA酶防止分離細(xì)胞時細(xì)胞黏附聚集，可有效降低消化粘稠度，縮短了脂肪組織的消化時間，分離得到的脂肪干細(xì)胞具有優(yōu)良的增殖活性和分化能力；此外本發(fā)明的組織消化酶中還添加青霉素，可有效防止樣本采集過程中會污染，抑制細(xì)菌滋生。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步解說。實(shí)施例1一種人脂肪組織消化酶，包括按照重量份計(jì)的如下組份：膠原酶30份、DNA酶0.8份、青霉素4份、鏈霉素23份。一種人脂肪組織消化酶的制備方法，方法步驟如下：S1：在無菌安全柜內(nèi)稱取膠原酶，加入DMEM培養(yǎng)基中；S2：稱取DNA酶加入S1制得的培養(yǎng)基中；S3：稱取青霉素和鏈霉素加入S2制得的培養(yǎng)基中；S4：將S3制得的培養(yǎng)基經(jīng)過0.22μm的濾網(wǎng)過濾，放置于4℃?zhèn)溆?。?shí)施例2一種人脂肪組織消化酶，包括按照重量份計(jì)的如下組份：膠原酶50份、DNA酶0.1份、青霉素10份、鏈霉素15份。制備方法同實(shí)施例1。實(shí)施例3一種人脂肪組織消化酶，包括按照重量份計(jì)的如下組份：膠原酶40份、DNA酶0.4份、青霉素6份、鏈霉素20份。制備方法同實(shí)施例1。實(shí)施例4一種人脂肪組織消化酶，包括按照重量份計(jì)的如下組份：膠原酶35份、DNA酶0.3份、青霉素8份、鏈霉素19份。制備方法同實(shí)施例1。實(shí)施例5一種人脂肪組織消化酶，包括按照重量份計(jì)的如下組份：膠原酶45份、DNA酶0.6份、青霉素5份、鏈霉素21份。制備方法同實(shí)施例1。實(shí)施例6一種人脂肪組織消化酶在分離脂肪干細(xì)胞中的應(yīng)用。S1：在無菌安全柜內(nèi)稱量40mg膠原酶融入40mL1xDMEM低糖培養(yǎng)基中；S2：稱量0.4mgDNA酶，加入S1制得的培養(yǎng)基中。S3：稱量6mg青霉素加入S2制得的培養(yǎng)基中。S4：將S3制得的培養(yǎng)基用0.22um濾器，保證無菌，即得所需要的人脂肪組織消化酶。將所得人脂肪組織消化酶加入到30mL的脂肪組織中，在37℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中200r消化60min，觀察沒有大的脂肪塊后，用30mLDMEM終止消化，離心1100rpm，5min。再加入30mLDMEM培養(yǎng)基將沉淀懸起，清洗一次，離心(1100r*5min)去上清；沉淀可以直接接種或凍存，接種密度由組織量決定，10mL組織接種一個15cmBD培養(yǎng)皿，5mL組織接種一個T75培養(yǎng)瓶；接種的細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)三天，三天后全量換液去除雜物，之后每3天半量或全量換液，細(xì)胞長至90％時傳代或凍存；原代細(xì)胞凍存，清洗后的沉淀可以直接加入適量凍存液，分裝凍存，凍存密度可以根據(jù)組織量決定，5mL組織凍存一支，復(fù)蘇時可以直接接種一個T75培養(yǎng)瓶，根據(jù)上述培養(yǎng)方法培養(yǎng)原代細(xì)胞。一、細(xì)胞活力測試實(shí)驗(yàn)方法：采用MTT法。1)細(xì)胞培養(yǎng)：采用實(shí)施例1-5所得的人脂肪組織消化酶分離脂肪干細(xì)胞；2)用96孔板培養(yǎng)，每組設(shè)4個平行樣本取均值，收獲細(xì)胞前4h。3)每孔加入10μL配好的MTT，4h后用吸引器棄培養(yǎng)液，并加入100μL的DMSO，采用排槍加，保證反應(yīng)的一致性，振蕩8min。4)看到紫色結(jié)晶物充分溶解后，置酶標(biāo)儀(要提前開機(jī)預(yù)熱半小時左右)上測各孔光吸收值(OD)，以空白孔調(diào)零，濾過的波長是570nm。5)利用測出的OD值求細(xì)胞存活率，常以存活率為縱軸、時間為橫軸繪制其生存曲線。細(xì)胞存活率(％)＝實(shí)驗(yàn)組OD/對照組OD×100％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：表一細(xì)胞存活率結(jié)果組別實(shí)施例1實(shí)施例2實(shí)施例3實(shí)施例4實(shí)施例5存活率98.6％99.1％98.9％99.3％99.6％實(shí)驗(yàn)結(jié)論：通過表一結(jié)果可知，本發(fā)明所制得的人脂肪組織消化酶能夠保證脂肪干細(xì)胞的存活率在98％以上，使脂肪干細(xì)胞具有優(yōu)良的增殖活性和分化能力。二、細(xì)胞表面抗原的流式檢測實(shí)驗(yàn)方法：1)采用實(shí)施例4所制得的人脂肪組織消化酶進(jìn)行組織消化所獲得的細(xì)胞。2)在每個流式檢測管中加入50uL的稀釋后的一抗；在空白管或同型對照管中加入50uL緩沖液，細(xì)胞濃度范圍2-0.03ug/106細(xì)胞。3)在各管中分別加入50uL細(xì)胞懸液，并輕輕混勻。4)避光冰浴或在4℃冰箱中孵育20分鐘。5)孵育完成后，加入緩沖液(每流式檢測管中加2mL)，4℃下400g離心5分鐘，并棄去上清。6)重復(fù)洗滌過程3次。7)重懸細(xì)胞后上流式儀檢測。8)使用直接標(biāo)記一抗，用500uL緩沖液重懸細(xì)胞后上機(jī)檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：人脂肪干細(xì)胞表型：應(yīng)該表達(dá)的一種表面標(biāo)記CD73、CD90和CD105必須為陽性，陽性率不低于95％；同時為了保證消化酶獲得的干細(xì)胞中沒有混雜其它細(xì)胞，選取一組已知的間充質(zhì)干細(xì)胞不表達(dá)的表型作為輔助。CD34、CD45、CD14、HLA-DR、IgGPE、IgGECD、IgGFITC，陽性率不得超過2％。表1為本發(fā)明的方法得到的細(xì)胞表面抗原的陽性率表面抗原CD34CD45CD14HLA-DRIgGPEIgGECDIgGFITCCD73CD90CD105陽性率0.2％0.3％0.1％0.6％0.2％0.3％0.3％99.96％99.92％99.89％表2為用文獻(xiàn)的方法得到的細(xì)胞表面抗原的陽性率表面抗原CD34CD45CD14HLA-DRIgGPEIgGECDIgGFITCCD73CD90CD105陽性率0.7％1.4％1.0％1.1％0.6％0.7％0.9％98.97％87.45％77.53％實(shí)驗(yàn)結(jié)論：說明本發(fā)明所制得的消化酶，用于消化得到的細(xì)胞純度更高。以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3