本發(fā)明涉及一種用磁珠從血清、血漿等無細胞體液中分離游離DNA的方法及分離試劑盒。

背景技術(shù)：

游離核酸最早是20世紀40年代兩位法國科學家Mandel和Metais最早發(fā)現(xiàn)的。他們的研究發(fā)表在1947年DE BIOLOGIE DE STRASBOURG雜志上。1997年，YMD Lo等在國際著名醫(yī)學期刊《柳葉刀》(Lancet)上，報道了在懷有男胎孕婦的外周血中檢測到了Y染色體存在，從而證明了孕婦外周血中存在胎兒的游離DNA。隨后，相關(guān)研究又發(fā)現(xiàn)胎兒游離DNA在孕婦外周血中的檢出時間，主要與胎齡有關(guān)，胎齡越早胎兒成分相對越少。這一發(fā)現(xiàn)對孕婦進行無創(chuàng)產(chǎn)前檢測具有重要的診斷意義。這對無創(chuàng)診斷提供了一種有效的途徑。但血漿中母體來源的DNA占總DNA的比例非常高，一定程度上提高了檢測胎兒DNA的難度。目前，游離DNA在臨床上主要用于對父源性DNA檢測，如SRY基因型鑒定胎兒性別、檢測RhD血型及其它父源性遺傳性疾病檢測。產(chǎn)前診斷最常見的是21三體等非整倍體疾病檢測，它要求對染色體拷貝數(shù)量進行精確定量，這對于游離DNA來說是個挑戰(zhàn)。

目前，提取核酸的商品化的方法主要有硅膜離心柱吸附法和磁珠吸附法。硅膜離心柱吸附方法原理是通過核酸吸附到二氧化硅表面，其它物質(zhì)如化學物、糖類、蛋白等雜質(zhì)用洗滌液快速洗去，然后用洗脫液洗脫核酸，該方法簡單快速，能有效的去除樣本中的各種雜質(zhì)，獲得較純度較高的DNA，但成本較高，需要多步高速離心，更換離心管，沒有高通量的儀器配套，不適合臨床大規(guī)模樣本檢測。磁珠法提取核酸是近幾年才發(fā)展起來的核酸提取方法。其主要原理是在磁珠(主要為鐵氧體)表面通過共聚合和表面修飾等引入活性基團，這些活性基團有羥基，羧基，氨基、巰基等，制備成具有磁性的親和吸附劑，然后與核酸共同孵育后，通過疏水作用、靜電作用、離子吸附等原理，使核酸吸附到磁珠表面，經(jīng)過簡單的洗滌，磁分離，得到表面結(jié)合有核酸的磁珠復合物，改變試劑pH值等條件可以把核酸從磁珠上洗脫下來。該方法操作簡便、快速，獲得的核酸純度高，產(chǎn)量大，目前已有多家公司開發(fā)出配套的自動化系統(tǒng)，可以有效地提高工作效率。

目前，商品化的磁珠法游離核酸提取試劑盒操作復雜，需要使用蛋白酶K在37-56℃孵育樣本10-30分鐘，然后冷卻至室溫后加入無水乙醇或異丙醇，加入磁珠懸浮液進行混勻，靜置5-10分鐘，經(jīng)過一系列漂洗步驟后置于室溫晾干10-15分鐘。步驟的繁瑣性導致其自動化操作程度低，儀器普適性差。因此迫切需要開發(fā)操作簡便、穩(wěn)定高效的磁珠法游離核酸提取試劑盒。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明申請內(nèi)容涉及生物醫(yī)學領(lǐng)域，擬申請一種從血清、血漿等無細胞體液中分離游離DNA的方法及提取試劑。

本發(fā)明的提取方法步驟包括：1)釋放游離核酸并在特定條件下吸附于磁珠表面；2)洗滌去除化學物質(zhì)和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)；3)洗脫得到DNA。

本發(fā)明提供的游離DNA提取方法，其特征在于：

1)釋放核酸所用裂解結(jié)合液中含有高濃度的胍鹽，可以是鹽酸胍、異硫氰酸胍中的一種或兩種,胍鹽的濃度是1-6M。

2)釋放核酸所用裂解結(jié)合液中含有1-20％的表面活性劑，該表面活性劑可以是Triton X-100、Tween 20、SDS、SLS、NP-40中的一種或幾種；

3)釋放核酸所用裂解結(jié)合液中含有高濃度的醇類，可以是乙醇、異丙醇、聚乙二醇的一種或多種,醇的濃度是10％-100％；

4)吸附介質(zhì)是表面修飾的磁珠，修飾基團是羥基，羧基，氨基中的一種或兩種；

5)洗滌液中含有高濃度的醇類，可以是乙醇、異丙醇中的一種或兩種；醇的濃度是50％-100％

6)洗滌液中含有高濃度的鹽，可以是鹽酸胍、異硫氰酸胍、氯化鋰、檸檬酸鈉中的一種或多種；濃度是0.5-5M

7)洗脫時所用洗脫液可以是水，還可以是含有低濃度鹽離子的水。鹽的濃度是1mM-100mM

本發(fā)明提供的提取試劑盒，包括以下幾種組份：裂解結(jié)合液、洗滌液、洗脫液I、洗滌液II、磁珠、使用說明書。

本發(fā)明提供的提取試劑盒，其特征在于：

1)釋放核酸所用裂解結(jié)合液中含有高濃度的胍鹽，可以是鹽酸胍、異硫氰酸胍中的一種或兩種,胍鹽的濃度是1-6M。

2)釋放核酸所用裂解結(jié)合液中含有1-20％的表面活性劑，該表面活性劑可以是Triton X-100、Tween 20、SDS、SLS、NP-40中的一種或幾種；

3)釋放核酸所用裂解結(jié)合液中含有高濃度的醇類，可以是乙醇、異丙醇、聚乙二醇的一種或多種,醇的濃度是10％-100％；

4)吸附介質(zhì)是表面修飾的磁珠，修飾基團是羥基，羧基，氨基中的一種或兩種；

5)洗滌液中含有高濃度的醇類，可以是乙醇、異丙醇中的一種或兩種；醇的濃度是50％-100％

6)洗滌液中含有高濃度的鹽，可以是鹽酸胍、異硫氰酸胍、氯化鋰、檸檬酸鈉中的一種或多種；濃度是0.5-5M

7)洗脫時所用洗脫液可以是水，還可以是含有低濃度鹽離子的水。鹽的濃度是1mM-100mM

本發(fā)明所提供的游離DNA提取方法及試劑盒具有簡便、快速、得率高、產(chǎn)物純度高、便宜等優(yōu)勢，適用于從血清、血漿等無細胞體液中快速分離DNA，所得DNA可以直接應用于聚合酶鏈式反應等分子生物學實驗。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例的技術(shù)方案，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為本發(fā)明實施例的流程圖；

圖2為本發(fā)明實施例的操作步驟示意圖。

具體實施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

盡管本發(fā)明的內(nèi)容是結(jié)合本實例進行說明，但是不能認為是對本發(fā)明專利的限制，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求書限定。另外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在所附權(quán)利要求書限定

的范圍內(nèi)對本發(fā)明進行各種改動或修飾，這些改動或修飾形式同樣屬本發(fā)明的保護范圍。

實施例1試劑成分

裂解結(jié)合液：2.8M GuSCN，50mM Tris(pH 7.5)，5％Triton X-100,30％IPA；

洗滌液I：5M LiCl，40％乙醇

洗滌液II：80％乙醇

洗脫液：5mM Tris(pH 8.0),0.5EDTA，DEPC水

實施例2游離RNA提取方法

1)取1.5mL離心管，加入200μL新鮮分離的血漿或血清，加入600μL裂解結(jié)合液，加入1mg磁珠振蕩混勻。

2)室溫放置10min。

3)磁分離，吸去上清。

4)加入800μL洗滌液I，渦旋混勻。

5)磁分離，吸去上清。

6)加入800μL洗滌液II，渦旋混勻。

7)磁分離，吸去上清。

8)開蓋，室溫干燥5min。

9)加入50μL洗脫液，渦旋混勻。

10)磁分離，收集上清，-20℃或-80℃保存。

在上述實施例中，對各個實施例的描述都各有側(cè)重，某個實施例中沒有詳細描述的部分，可以參見其他實施例的相關(guān)描述。

以上對本發(fā)明實施例所提供的內(nèi)容下載方法及相關(guān)設(shè)備、系統(tǒng)進行了詳細介紹，本文中應用了具體個例對本發(fā)明的原理及實施方式進行了闡述，以上實施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想；同時，對于本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員，依據(jù)本發(fā)明的思想，在具體實施方式及應用范圍上均會有改變之處，綜上所述，本說明書內(nèi)容不應理解為對本發(fā)明的限制。