專利名稱：一種操縱磁珠分離目標分子的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種操縱磁珠分離目標分子的方法。
背景技術：
大量的生物實驗及臨床診斷離不開樣品制備，而生物分子的提取及純化技術在樣品制備中有著廣泛應用。隨著相關技術的發(fā)展，臨床診斷及生物實驗所處理的樣品數量也越來越大。磁珠操縱是樣品制備常用的一種技術。目前磁珠混勻及分離技術，主要有兩類一類是通過磁棒和磁套的相對運動實現磁珠收集、釋放、轉移，進而完成生物分子的提取。這種方法所采用的機械結構相對復雜，存在實現自動化成本高的問題，并且磁套作為耗材，價格較高。同時，由于磁套與樣品充分接觸，存在污染樣品的風險，且在磁珠轉移過程中存在磁珠損耗的問題。此外，由于磁套的運動較為劇烈，無法保證提純后生物分子的完整性。另外一類是槍頭抽吸方式，即用槍頭吹吸混勻，磁鐵吸附磁珠，以做磁珠分離。這種方法實現自動化的成本高，需要數個機器臂和泵，結構復雜。此外，還存在一次性處理樣品數量受限于機械臂的問題。總之，需要提高效率和一次性處理樣品數量等諸多因素，以滿足低耗材、高效率的生物分子提取及純化要求。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種操縱磁珠將目標分子從溶液中分離出來的方法，具體是一種使結合、洗滌和分離更充分，使得到的目標分子純度和得率更高的磁珠分離方法。本發(fā)明的利用磁珠將目標分子從溶液中分離的方法，包括如下步驟(1)結合將磁珠、含有目標分子的溶液和結合緩沖液置于容器中混合，將所述容器置于磁場的磁力范圍中且使所述容器中的磁珠所受磁場力的方向和/或大小處于連續(xù)變化狀態(tài)，以使所述容器中的所有物質相互間充分接觸，磁珠與目標分子結合形成復合物； 去除雜質，保留復合物在所述容器中；(2)洗滌向所述容器中加入洗滌緩沖液，使洗滌緩沖液與所述復合物混合，將所述容器置于磁場的磁力范圍中且使所述容器中的磁珠所受磁場力的方向和/或大小處于連續(xù)變化狀態(tài)，以使所述容器中的所有物質相互間充分接觸；去除雜質，保留復合物在所述容器中；(3)洗脫向所述容器中加入洗脫緩沖液，使洗脫緩沖液與所述復合物混合，將所述容器置于磁場的磁力范圍中且使所述容器中的磁珠所受磁場力的方向和/或大小處于連續(xù)變化狀態(tài)，以使所述容器中的所有物質相互間充分接觸；再將所述容器脫離磁場，孵育，以使所述磁珠與所述目標分子分離，收集目標分子。上述過程中，所述步驟(1)、(2)或(3)中，所述使磁珠所受磁場力的方向和/或大小處于連續(xù)變化狀態(tài)的方法具體可為如下I、II或III所示，但不排除其它的方法；I、使所述容器與所述磁場相對運動，其中產生磁場的磁鐵是永磁鐵；
II、改變磁場力的大小和/或方向，其中產生磁場的磁鐵是電磁鐵；具體可以通過改變電磁鐵的電流的大小，使磁力大小改變；改變電磁鐵的電流方向，使N\S極改變。III、改變磁場力的大小和/或方向和使所述容器與所述磁場相對運動，其中產生磁場的磁鐵是電磁鐵。上述過程中，所述使所述容器與所述磁場相對運動的方法具體可為如下1)、2)或 3)所示1)所述容器在相對的兩排磁鐵之間做運動；2)所述容器繞著所述磁鐵運動；3)所述磁鐵繞著所述容器運動。上述過程中，所述1)、幻或幻中，所述運動可為圓周運動、勻速運動或勻速圓周運動。上述過程中，所述勻速圓周運動的速度為8rpm-75rpm，優(yōu)選為12rpm-30rpm或 15rpm_30rpm,具體為 15rpm、19rpm、23rpm 或 30rpmo如果運動速度太快會讓磁珠還來不及在管內運動，又回到了原來的位置，不但不能讓其在管內充分運動，還有可能會毀掉原來生物分子的完整性；如果運動速度太慢，效率又會很低并且不能讓磁珠充分散開接觸到液體。上述過程中，所述容器在相對的兩排磁鐵之間做運動中，所述容器為由若干個單獨的管連接而成的排管，且所述排管呈一條直線。上述過程中，為了使各個管內的效果一致，最好保持所述排管中各單獨的管在同一時刻所受磁場力均一致。上述過程中，使所述排管中各單獨的管在同一時刻所受磁場力均一致的方法具體可為如下，但不限于此方法每排磁鐵均由若干個長方體狀永磁鐵依次連接而成，永磁鐵連接方向呈直線且垂直于永磁鐵自身的N極與S極連線方向，相鄰的兩個永磁鐵的磁極方向相反；兩排磁鐵之間相對的兩個永磁鐵邊緣連線呈矩形或正方形，且相對的兩個永磁鐵的磁極相同；排管與兩排磁鐵均保持平行，每個長方體狀永磁鐵沿其自身N極與S極連線方向的切面的寬度等于每個單管沿磁鐵的N極與S極連線方向的切面的最寬處的寬度；且排管在兩排磁鐵的非邊緣效應區(qū)域運動，所述邊緣效應是每排磁鐵的兩端產生的邊緣效應。上述過程中，所述單獨的管為試管或離心管；所述由若干個單獨的管連接而成的排管為八連排離心管。上述過程中，所述目標分子為生物分子；或所述生物分子為DNA、RNA、碳水化合物或蛋白質。本發(fā)明方法通過改變磁珠所受磁場力的大小和方向，使磁珠與目標分子更充分的結合或分離，最終獲得目標分子。具體來說，可分別采取如下四種方式來改變磁珠所受磁場力的大小和方向1)磁鐵固定，而磁珠體系運動；幻磁珠體系固定，而磁鐵運動；幻磁珠體系和磁鐵都運動；4)采用電磁鐵變換磁力大小和方向。所述磁鐵可以是電磁鐵，也可以是永磁鐵。所述永磁鐵主要是用來提供磁場，并通過調節(jié)與樣品之間的距離和方向以控制磁珠的運動，從而改變磁珠體系所受的磁場力大小和方向。所述電磁鐵主要是通過調節(jié)自身電流大小和方向，并結合調節(jié)與樣品之間的距離和方向，從而改變磁珠體系所受的磁場力大小和方向。本發(fā)明方法中，使磁珠受磁場力的大小和方向改變的作用具體如下1、結合使裝有磁珠體系的容器相對于磁鐵的距離和/或位置處于連續(xù)變化狀態(tài)，使磁珠在變化的磁場力的作用下在體系中充分運動，進而使磁珠與生物分子充分混勻和接觸，形成磁珠與生物分子的復合物。2、洗滌容器貼近磁鐵一段時間，去除多余液體后，將洗滌液加入結合好的磁珠中，使裝有磁珠體系的容器相對于磁鐵的距離和/或位置處于連續(xù)變化狀態(tài)，使磁珠在變化的磁場力的作用下在體系中充分運動，進而使復合物與洗滌液充分混勻和充分接觸，從而使其得到充分洗滌。3、洗脫容器貼近磁鐵一段時間，去除多余液體后，將洗脫液加入洗滌好的磁珠中，使裝有磁珠體系的容器相對于磁鐵的距離和/或位置處于連續(xù)變化狀態(tài)，控制磁珠在洗脫液中運動，使磁珠在變化的磁場力的作用下在體系中充分運動，使復合物與洗脫液充分混勻和接觸，從而利于洗脫，從而得到高濃度、高純度的目標分子。本發(fā)明由于采取以上技術方案，其具有以下優(yōu)點1)由于離心管采用較慢的運動速度，目標生物分子所受的剪切力較小，且不易產生氣泡，保證提純后的生物分子完整性。2)操縱過程中無液體外濺現象，降低了交叉污染可能性。3)混勻過程無其它實驗耗材介入，在降低成本的同時減少了可能的污染。4)可將多個樣品至于磁場中進行混勻，提高了生物分子提取及純化的通量。5)僅需要調節(jié)磁鐵與磁珠體系的相對位置，或變換電磁鐵的磁力大小，運動相對簡單，故易于實現自動化，且成本低。6)不需要特殊容器，僅需要普通耗材，實用性非常強7)整個過程不進行磁珠轉移，降低了磁珠損耗。實驗證明，本發(fā)明方法的生物分子提取得率高于傳統(tǒng)抽吸方式，并且多管間的一致性比傳統(tǒng)抽吸方式好。因此，本發(fā)明方法在生物分子的樣品制備領域將有廣闊的應用前
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圖1為本發(fā)明實施例--的示意圖。
圖2為本發(fā)明實施例--的示意圖。
圖3為本發(fā)明實施例二二的示意圖。
圖4為本發(fā)明實施例二二的示意圖。
圖5為本發(fā)明實施例三Ξ的示意圖。
圖6為本發(fā)明實施例三Ξ的示意圖。
圖7為本發(fā)明實施例三Ξ的示意圖。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
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附圖中，各標記如下1、磁珠體系；2、磁鐵。下述實施例中的緩沖液GD、漂洗液PW、洗脫液TB、磁珠懸液B均為磁珠法基因組 DNA提取試劑盒中產品。磁珠法基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，產品目錄號為DP329。實驗中各步驟需要加入的溶液的種類及用量根據磁珠法基因組DNA提取試劑盒的說明書進行操作。下述實施例1、2、3、4使用的PCR產物是相同的同一批PCR產物，實施例5使用的是另一批PCR產物。PCR產物中均含有與磁珠結合的DNA (即待分離的DNA)。實施例1、利用磁珠將目標分子從溶液中分離的方法-容器繞著磁鐵運動一個離心管與一塊磁鐵為一組，磁鐵固定，離心管圍繞著磁鐵做勻速圓周運動。磁鐵為單塊永磁鐵，單塊永磁鐵為長方體狀(圖1和幻。離心管在運動過程中均處在磁鐵產生的磁場的磁力范圍內。一、結合1、制備體系1)向3組離心管的各管中加入40 μ L的PCR產物；2)再向各管中加入10 μ L緩沖液⑶；3)向各管中加入110 μ L PW和20 μ L無水乙醇的混合液，渦旋混勻；4)三組離心管中分別加入5 μ L、10 μ L或15 μ L磁珠懸液B ；2、結合操作將單個離心管以15rpm的速度繞永磁鐵做勻速圓周運動(如圖1、2所示)，在此過程中磁珠與目標分子充分接觸而形成復合物，運動2至3分鐘后，靠近磁鐵停下，停留30秒后復合物被磁鐵吸附到容器的管壁上，用移液槍將液體移走，保留復合物；二、洗滌1、第一次洗滌向步驟一得到的裝有復合物的離心管中加入200μ L緩沖液⑶，將離心管以15rpm 的速度繞永磁鐵做勻速圓周運動，在此過程中磁珠與緩沖液GD充分接觸，運動2至3分鐘后，靠近磁鐵停下，停留30秒后復合物被磁鐵吸附到管壁上，用移液槍將液體移走，保留復合物；2、第二次洗滌向步驟1的離心管中加入200 μ L漂洗液PW，將離心管以15rpm的速度繞永磁鐵做勻速圓周運動，運動2至3分鐘后，靠近磁鐵停下，停留30秒后復合物被磁鐵吸附到耗材的管壁上，用移液槍將液體移走，保留復合物；室溫晾干5分鐘。三、洗脫向步驟二的離心管中加入50 100 μ L的洗脫液ΤΒ，將離心管以15rpm的速度繞永磁鐵做勻速圓周運動，運動2至3分鐘后，將離心管移開磁場(即離開磁場的磁力范圍)， 再將離心管置于56°C孵育10分鐘。再將離心管靠近磁鐵停下，停留30秒后，磁珠被磁鐵吸附到管壁上，而目標分子存在分離緩沖液中(即為目標分子溶液)，將目標分子溶液轉移至新管。四、回收量的檢測方法
方法用分光光度計進行核酸濃度測試，測試前注意需要用Tip頭將核酸混勻。實施例2、利用磁珠將目標分子從溶液中分離的方法-磁鐵繞著容器運動方法與實施例1基本相同，不同的是在結合、洗滌和洗脫步驟中，離心管與永磁鐵的相對運動方式不同，具體為永磁鐵以15rpm的速度繞離心管做勻速圓周運動(如圖3、4 所示)。具體為一個離心管與一塊磁鐵為一組，離心管固定，磁鐵圍繞著離心管做勻速圓周運動。磁鐵為單塊永磁鐵，單塊永磁鐵為長方體狀(圖3和4)。磁鐵在運動過程中需保證離心管處在磁鐵產生的磁力的范圍內。實施例3、利用磁珠將目標分子從溶液中分離的方法-容器在兩排磁鐵之間運動方法與實施例1基本相同，不同的是在結合、洗滌和洗脫步驟中，離心管與永磁鐵的相對運動方式不同，具體如下兩排相對且平行的永磁鐵和一排離心管為一組。一排離心管由8個單獨的離心管呈一條直線連接而成的。兩排相對的磁鐵位置固定，八個離心管作為一個整體在兩排磁鐵之間以15rpm的速度做勻速圓周運動(圖5、6、7)。勻速圓周運動可通過現有技術實現，如將八個離心管置于一個相應的轉子中，轉子由電機驅動進行勻速圓周運動，從而八個離心管也做勻速圓周運動，在整個運動過程中，八個離心管與轉子的相對位置是不變的。一排離心管在運動過程中均處在兩排磁鐵產生的磁力范圍內。磁鐵為永磁鐵，單塊磁鐵為長方體狀；每排磁鐵是由同樣大小的單塊永磁鐵依次緊挨著排列而成。為了保證八個離心管中各管在同一時刻的受力一致性(即各管所受磁場力的大小和方向一致)，按照如下方式設置磁鐵結構、且使八個離心管按照如下方式運動將單塊磁鐵依次緊挨著排列成一排，單塊磁鐵排列方向呈直線且垂直于單塊磁鐵自身的N極與S極連線方向，相鄰的兩個單塊磁鐵的磁極方向相反；兩排磁鐵之間相對的兩個單塊磁鐵邊緣連線呈矩形，且相對的兩個單塊磁鐵的磁極相同；無論在排管的起始放置時刻還是在排管的運動過程中，均保持排管與兩排磁鐵相對平行；每個長方體狀永磁鐵沿其自身N極與S極連線方向的切面的寬度等于每個單管沿磁鐵的N極與S極連線方向的切面的最寬處的寬度；還要使排管在兩排磁鐵間的非邊緣效應區(qū)域運動(以避免兩排磁鐵的兩端產生的邊緣效應使管的受力不均)，所述邊緣效應是指每排磁鐵的兩端產生的邊緣效應。如此設置的兩排磁鐵在非邊緣效應區(qū)域內，沿著與磁鐵平行的方向上各點的磁場強度雖然不完全相同(一般兩塊磁鐵的相連處的磁場強度要強于磁鐵的非連接處)，但由于每個管的縱切面的最寬處與磁鐵的縱切面的寬度是相等的，所以無論排管運動到哪，其在同一時刻各管的受力情況是相同的。避免上述邊緣效應可通過現有技術實現，具體可如每排磁鐵的單塊磁鐵數目遠多于排管中各單管的數目，且使排管在每排磁鐵的中間區(qū)域運動，而不接近每排磁鐵的兩端。如此設置，就保證了八個離心管中各管在同一時刻所受的磁場力大小和方向均相同，從而保證了管間一致性。另外，實驗表明，當每排磁鐵中各單塊磁鐵互相間隔一段距離時，各離心管中的磁珠的分散度明顯不同，說明此種情況下各管在同一時刻所受磁場強度不一樣，因此，管間一致性不如上述緊挨著放置好。
實驗還表明，當每排磁鐵中相鄰的兩個單塊磁鐵的磁極方向相同時，各離心管中的磁珠的分散度明顯不同，說明此種情況下各管在同一時刻所受磁場強度不一樣，因此，管間一致性不如上述相鄰磁鐵磁極方向相反放置好。上述實施例中均設了 3組實驗，實際應用中可以根據需求有N(N彡1)組同樣的反應，提高效率。實施例4、對照(傳統(tǒng)方式)1、向3組離心管排管的各管中加入40 μ L的PCR產物(與實施例1_3中所述PCR 產物相同，為同批)2、再向各管中加入10 μ L緩沖液⑶；3、向各管中加入110 μ L PW和20 μ L無水乙醇的混合液，渦旋混勻；4、三組離心管中分別加入5 μ L、10 μ L、15 μ L磁珠懸液B ；5、將離心管放置于磁力架上靜置30秒，待磁珠完全吸附時小心去除液體；6、將離心管從磁力架上取下來，加入200 μ L漂洗液⑶，渦旋混勻。7、將離心管放置于磁力架上靜置30秒，待磁珠完全吸附時小心去除液體。8、加入200 μ L漂洗液PW，渦旋混勻。9、將離心管放置于磁力架上靜置30秒，待磁珠完全吸附時小心去除液體，室溫晾干5分鐘。10、加入50 100 μ L的洗脫液ΤΒ，按照步驟5的方式混勻，56°C孵育10分鐘。11、將離心管貼近磁鐵30秒，待磁珠完全吸附時小心將DNA溶液轉移至新管，并進行測量。結果如表1所示。表1、產物回收結果
權利要求
1.一種利用磁珠將目標分子從溶液中分離的方法，包括如下步驟(1)結合將磁珠、含有目標分子的溶液和結合緩沖液置于容器中混合，將所述容器置于磁場的磁力范圍中且使所述容器中的磁珠所受磁場力的方向和/或大小處于連續(xù)變化狀態(tài)，以使所述容器中的所有物質相互間充分接觸，磁珠與目標分子結合形成復合物；去除雜質，保留復合物在所述容器中；(2)洗滌向所述容器中加入洗滌緩沖液，使洗滌緩沖液與所述復合物混合，將所述容器置于磁場的磁力范圍中且使所述容器中的磁珠所受磁場力的方向和/或大小處于連續(xù)變化狀態(tài)，以使所述容器中的所有物質相互間充分接觸；去除雜質，保留復合物在所述容器中；(3)洗脫向所述容器中加入洗脫緩沖液，使洗脫緩沖液與所述復合物混合，將所述容器置于磁場的磁力范圍中且使所述容器中的磁珠所受磁場力的方向和/或大小處于連續(xù)變化狀態(tài)，以使所述容器中的所有物質相互間充分接觸；再將所述容器脫離磁場，孵育，以使所述磁珠與所述目標分子分離，收集目標分子。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(1)、(2)或C3)中，所述使磁珠所受磁場力的方向和/或大小處于連續(xù)變化狀態(tài)的方法為如下I、II或III所示I、使所述容器與所述磁場相對運動，其中產生磁場的磁鐵是永磁鐵；II、改變磁場力的大小和/或方向，其中產生磁場的磁鐵是電磁鐵；III、改變磁場力的大小和/或方向和使所述容器與所述磁場相對運動，其中產生磁場的磁鐵是電磁鐵。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述使所述容器與所述磁場相對運動的方法為如下1)、2)或3)所示1)所述容器在相對的兩排磁鐵之間做運動；2)所述容器繞著所述磁鐵運動；3)所述磁鐵繞著所述容器運動。
4.根據權利要求1或2或3所述的方法，其特征在于所述1)、幻或幻中，所述運動為圓周運動、勻速運動或勻速圓周運動。
5.根據權利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述勻速圓周運動的速度為 8rpm_75rpm，優(yōu)選為 12rpm_30rpm 或 15rpm_30rpm，具體為 15rpm、19rpm、23rpm 或 30rpmo
6.根據權利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述容器在相對的兩排磁鐵之間做運動中，所述容器為由若干個單獨的管連接而成的排管，且所述排管呈一條直線。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于所述排管中各單獨的管在同一時刻所受磁場力均一致。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于使所述排管中各單獨的管在同一時刻所受磁場力均一致的方法為每排磁鐵均由若干個長方體狀永磁鐵依次連接而成，永磁鐵連接方向呈直線且垂直于永磁鐵自身的N極與S極連線方向，相鄰的兩個永磁鐵的磁極方向相反；兩排磁鐵之間相對的兩個永磁鐵邊緣連線呈矩形或正方形，且相對的兩個永磁鐵的磁極相同；排管與兩排磁鐵均保持平行，每個長方體狀永磁鐵沿其自身N極與S極連線方向的切面的寬度等于每個單管沿磁鐵的N極與S極連線方向的切面的最寬處的寬度；且排管在兩排磁鐵的非邊緣效應區(qū)域運動，所述邊緣效應是每排磁鐵的兩端產生的邊緣效應。
9.根據權利要求1-8中任一所述的方法,其特征在于所述單獨的管為試管或離心管； 所述由若干個單獨的管連接而成的排管為八連排離心管。
10.根據權利要求1-9中任一所述的方法，其特征在于所述目標分子為生物分子；或所述生物分子為DNA、RNA、碳水化合物或蛋白質。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種操縱磁珠分離目標分子的方法。該方法包括如下步驟(1)結合將磁珠、含有目標分子的溶液和結合緩沖液置于容器中混合，磁珠與目標分子結合形成復合物；去除雜質，保留復合物在所述容器中；(2)洗滌向所述容器中加入洗滌緩沖液，使洗滌緩沖液與所述復合物混合，去除雜質，保留復合物在所述容器中；(3)洗脫向所述容器中加入洗脫緩沖液，使洗脫緩沖液與所述復合物混合；再將所述容器脫離磁場，孵育以使所述磁珠與所述目標分子分離，收集目標分子。實驗證明，本發(fā)明方法的得率高于傳統(tǒng)抽吸方式的得率，并且離心管之間的一致性優(yōu)于傳統(tǒng)抽吸方式。因此，本發(fā)明方法在生物分子的分離和純化領域將有廣闊的應用前景。
文檔編號C07K1/14GK102586225SQ20111000788
公開日2012年7月18日 申請日期2011年1月14日 優(yōu)先權日2011年1月14日
發(fā)明者周晶琳, 李航, 王東, 王小龍, 謝秉霖, 項光新 申請人:博奧生物有限公司, 清華大學