本發(fā)明涉及對可能存在于人或者動物的血液中的病原體的識別。本發(fā)明具體地涉及對在血液樣品中發(fā)現(xiàn)的危險的病原體的快速的現(xiàn)場識別。
技術實現(xiàn)要素:
根據(jù)本發(fā)明的第一方面,提供了一種設備,用于實施對病原體的快速現(xiàn)場識別,該設備包括:
·散熱模塊(HRM);
·玻爾貼單體(熱電單體)(TEC),玻爾貼單體的基板與HRM相鄰并且優(yōu)選與HRM連接;
·容納傳熱套管的反應容器,該傳熱套管與TEC的工作面相鄰并且優(yōu)選與TEC的工作面連接;
·保持裝置,布置成用于將反應容器保持在套管中;
·用于驅(qū)動TEC的裝置;以及
·光學裝置,布置成用于監(jiān)測反應容器中的反應;
·以及設備被布置成用于使用微滴定反應容器和其支架進行操作的,所述支架被形成來保持反應容器以及容納套管并且保持地裝配于保持裝置。
優(yōu)選的微滴定反應容器是一個由碳載塑料材料形成的容器。使用這樣的反應容器,熱量可以迅速地傳入和傳出反應腔。這樣的微滴定容器可以具有2cm整體長度的數(shù)量級,并且按從上往下的順序可以包括:帽容納邊緣,填料部分,具有基部的反應腔。填料部分可具有7-8mm的最大外徑和大約4-5mm的深度,并且反應腔從3mm直徑向下逐漸變細為2.5mm直徑,整個具有0.8mm數(shù)量級的壁厚。因此,反應容器可基本上是毛細管尺寸的,以最大化熱傳遞的速率。反應容器將通常具有可密封反應容器的透明的蓋子。
因為微滴定容器的操縱對于戴手套的手工工人來說是繁瑣的,所以優(yōu)選地為單獨的支架裝配提供以頂帽形式的東西,并且布置成在與設備的較熱部分分離的平坦的表面上是可放置的,用于為過程裝料或者卸料。這一單獨的支架可具有形成在其上的附屬物,用于承載可移除的容器蓋子。因此蓋子的保持和裝配都是很方便的。井由塑料材料形成,而靜止地保持在其中的反應容器可以在識別過程完成時易于被丟棄。
優(yōu)選的熱循環(huán)設備包括金屬套管,該金屬套管以這樣的方式適于緊密地包圍反應容器的反應腔,該方式在金屬套管的整個長度上與反應腔相鄰,并且在套管的底座處與套管形成整體的是傳熱腳。傳熱腳有利地連接至玻爾貼單體的工作面,其底面連接至布置用于在中間溫度附近操作的散熱模塊(HRM),該溫度通常在普通DNA的退火溫度附近。頂帽有利地容納套管。在套管的底座中,鄰近TEC,可以是熱敏電阻器,使得過程的溫度能夠被連續(xù)地監(jiān)測和控制。套管可以由既是良好的熱導體又相對耐腐蝕的金屬形成,諸如黃銅。為了最小化玻爾貼單體本身的分層或者它從HRM或者傳熱腳上剝離的可能性,該連接可通過柔性焊料(諸如鉛錫焊料183)來實現(xiàn)。
散熱模塊(HRM)可以是布置成為向所述散熱模塊(HRM)提供的傳熱液體在恒定的溫度從所述散熱模塊(HRM)中流過的設備。在現(xiàn)場的上下文中,為了簡化,該液體可以是水??梢杂袃σ浩饕约跋嚓P聯(lián)的泵,儲液器包含被布置用于保持冷卻劑在恒定溫度的加熱元件和/或風扇。
可以有固定塊,該固定塊被布置來包圍并且保護TEC和套管,并且還充當反應容器支架的底座。此布置可以因此使得“帶上頂帽”保持地裝配支架到固定塊,并且將反應容器帶入套管中的緊密裝配中。
設備還可以包括純水注入站,該純水注入站被布置用于在反應容器包含凍干材料時分配一定量的純水進入反應容器。同樣地或者可替代地,可以有被布置用于分配非凍干的這樣的試劑的試劑分配器。
根據(jù)本發(fā)明的另外的方面,提供了微滴定反應容器和微滴定反應容器的支架,支架被形成來保持反應容器以及容納套管并且保持地裝配于固定塊。
具體對于微滴定的內(nèi)容,光學布置也盡可能地小型化。光學布置通常包括被布置用來在反應腔中激發(fā)熒光的激發(fā)光源,以及收集發(fā)出的熒光并且輸送其至分光光度計的收集器。激發(fā)光源以及或許激發(fā)光收集器可以相鄰或者靠近反應容器的蓋子。收集器優(yōu)選是光纖。在一個可替代的實施例中,光纖可以是分叉的或者具有兩個或多個核,一個核被布置來用于激發(fā),另一個被布置來用于收集。
光源可包括激光二極管或者發(fā)光二極管(LED)或者過濾為所要求的發(fā)射波長的廣譜源鹵素燈。優(yōu)選的光學讀取器是分光光度計,但是也可以使用光電二極管。
通常地,包括HRM、TEC、套管和固定塊的站可以是陣列中的一個站。對于快速現(xiàn)場操作,該站有利地還具有包括源和收集器的光學單元。該光學單元特別優(yōu)選布置成可在操作位置與存取(access)位置之間移動??蔀榇颂峁┿q鏈裝置,該鉸鏈裝置被有利地組織從而最小化光路的中斷,光路的中斷包括一個或多個光纖的彎折。光學單元還可具有保持裝置(例如磁體)以確保在操作位置和存取位置的鎖定的程度。在操作位置,保持裝置優(yōu)選用于保持該單元緊靠反應容器蓋子,并且可包括蓋子加熱器。
對于現(xiàn)場操作,陣列可包括八個站,并且相應地被連接至病原體檢測單元上的現(xiàn)場操作板上,該病原體檢測單元還可包括電源供給和控制以及光學系統(tǒng)。該陣列優(yōu)選組織成為對每個站進行單獨控制,而HRM通過共同的加熱器和泵互相聯(lián)通。該單元也被優(yōu)選構(gòu)造,從而昂貴的電子器材和光學器材被密封在容器中,該容器的外部可被重復地、徹底地和安全地滅菌而不會有害地影響其中的內(nèi)容物。
這種布置的優(yōu)點是,它可以容易地攜帶并且使用四輪驅(qū)動車輛例如陸虎的輔助的12V電池操作。
根據(jù)本發(fā)明的第二個方面,用于生物液體樣品中遺傳物質(zhì)的識別的過程包括如下步驟:
·將生物液體樣品注入包含PCR試劑和標記的引物的反應容器中;
·如果必要,在所述反應容器中,使反應容器內(nèi)容物經(jīng)受細胞破碎過程;
·在反應容器的內(nèi)容物上進行病原體特異性聚合酶鏈反應(PCR);
·監(jiān)測PCR并且由此確定特定的遺傳物質(zhì)的存在。
優(yōu)選地,反應容器包含凍干形式的PCR試劑和標記的引物,并且過程的第一步包括在容器中放置足夠的純水以溶解該試劑和引物。優(yōu)選地還使用熒光實時地執(zhí)行監(jiān)控。
理想地,反應容器具有微滴定的比例。這具有特別的優(yōu)點,例如當血液樣品是使用固定容量的抽吸器/分配器例如“MICROSAFE”收集的,則恰好所需量的血液可以被輸送至反應容器。不僅如此,并且隨后收集和輸送可由穿著防護服的衛(wèi)生工作人員很容易地進行。
相應地應當理解,本發(fā)明具體旨在輔助極度危險的病原體(諸如埃博拉病毒)的快速識別。
細胞破碎過程可以包括冷凍然后解凍樣品與煮沸然后冷卻樣品中的一者或者兩者,從而其中的遺傳物質(zhì)細胞被破開。這種循環(huán)操作可以執(zhí)行多次,例如多至五個循環(huán)。
根據(jù)本發(fā)明的一個特征,細胞破碎和PCR可使用相同的反應容器和加熱/冷卻裝置來實施。合適的加熱/冷卻裝置包括玻爾貼單體,下文中被稱作TEC(熱電單體),玻爾貼單體被布置成針對恒定的溫度操作,該恒定的溫度有利地是樣品的冷凍溫度和沸騰溫度中間的一個溫度。典型地,所述中間溫度在普通DNA的退火溫度附近。該中間的恒定的溫度可通過上述的散熱模塊(HRM)來提供。
與TEC的工作面相鄰的可以是傳熱套管,該傳熱套管被布置來緊密地容納反應容器。
監(jiān)測PCR過程優(yōu)選由包括光學布置的讀取器裝置來執(zhí)行,該光學布置優(yōu)選結(jié)合依靠LED激發(fā)和CCD探測的分光光度計。該過程可隨后包括將所得的光譜與目標DNA的光譜的比較。
通常地,該設備的尺寸為50mm數(shù)量級的長度和55mm的直徑。這一方面符合穿防護服的操作者的方便手工處理,另一方面符合用于一次性使用的廉價的生產(chǎn)。用于這樣的設備的合適的玻爾貼單體尺寸為9平方毫米。
根據(jù)本發(fā)明的設備和過程的特別重要的特征是該過程可在10分鐘內(nèi)完成,換言之,患者立等可取。
附圖說明
現(xiàn)在將參考附圖通過示例來描述過程和設備的實施例,該附圖中:
圖1是設備的分解圖;
圖2是微滴定反應容器和其支架的截面;
圖3是組裝的設備的截面;
圖4是八站陣列單元的等距視圖;
圖5和圖6是八站陣列單元的分解圖;
圖7、圖8和圖9示出了光學單元;以及
圖10示出了陣列單元控制面板和屏幕。
具體實施方式
如圖所示,用于病原體的識別的設備包括散熱模塊HRM、玻爾貼單體TEC、傳熱套管30、保持裝置40、微滴定反應容器50和容器支架60。
散熱模塊HRM包括容器10和至容器10的可密封的蓋子11。容器10具有液體入口12和出口13,蓋子具有用于準確和經(jīng)濟地容納TEC的凹陷14。
TEC具有在凹陷14內(nèi)連接至蓋子11的基面20,以及工作面21。
套管30由黃銅形成并且包括容納部31和熱傳輸腳32。容納部31適于緊密地容納反應容器50的反應腔部分51。用與腳32連接的TEC工作面21的寬度相同的底直徑來形成腳32。連接至套管30的是熱敏電阻器33。
安裝至蓋子11的PCB 15將TEC和熱敏電阻器33連接,以提供電路和控制電路。
保持裝置40包括基板41和連接至基板41的蓋42?;?1連接至HRM蓋子11。保持裝置40的功能是收容和保護套管30以及容納反應容器50及反應容器50的支架60。
反應容器50是由碳載塑料材料形成的微滴定容器,具有2cm的整體長度。它包括,從上往下的順序,帽容納邊緣51,填料部分52,以及具有基部54的反應腔53。填料部分52具有7mm的最大外徑和5mm的深度。反應腔53從3mm向下逐漸變細為2.5mm,整體具有0.8mm的壁厚。因此反應腔50大致具有毛細管尺寸。
支架60容納和保持反應腔50。它的形狀為頂帽,并且因此容納套管30。形成在支架60上的是柔性附屬物61,在柔性附屬物61的遠端承載透明的蓋子62,蓋子62可密封反應容器50的邊緣51。
如圖2所示,容器50適于從固定容量的毛細管抽吸器/分配器(MICROSAFE)70接收樣品。這繼而可以從標準的血液提取設備接收它的樣品。
在圖4至圖10中示意性地示出了圖1至圖3中所描繪的識別設備的陣列的一個實施例。裝配于陣列板80的是八個這樣的設備。在裝配時,保持裝置的蓋42或者支架60可在板80以上被看到。在板80下是HRM。HRM的入口12和出口13與其它設備的入口和出口聯(lián)通,也與加熱器兼泵單元81聯(lián)通,從而液體可以以恒定的溫度通過設備的HRM連續(xù)地循環(huán)。板80安裝至殼體90。
光學布置包括在位置83處鉸接到安裝在陣列板80上的支柱84的光學單元82,以及安裝在殼體90中的分光光度計。光學單元82在圖7至圖9中具體地示出,并且包括分叉光纖電纜85,其中一個芯體是激發(fā)光纖而另一個是收集器。鉸接部的位置83在最小化線纜85的干擾的位置。
光學單元82能夠在操作位置和存取位置之間通過切換件86移動。光學單元82具有保持磁體87和88,保持磁體87和88布置為分別在存取位置和操作位置保持單元82。支柱84上的對應的磁體87a和88a用于留住磁體87和88。單元82還結(jié)合一個蓋子加熱器89和相關聯(lián)的傳感器,從而在操作位置,保持裝置用于保持蓋加熱器89緊靠蓋子62,以防止蓋子62起霧。
在殼體90內(nèi)是密封的盒子91,密封的盒子91包含設備電子器材、光源和收集的光的讀取器。因此這些被保護防止溢出的病原體的進入,而盒子91的外部可被消毒。柔性管92在密封的盒子91和光學單元83之間連通,柔性管92對二者中每一者密封,并且包含用于加熱器89和光纜85的電輸入。
在一個可替代的實施例中,光源和/或光傳感器安裝在單元82中。在另一個可替代的實施例中,該設備結(jié)合了布置為用于輸送一定量的純水至反應容器中的站,從而液化凍干試劑。在另一個實施例中,該設備結(jié)合了布置成將試劑輸送至反應容器中的站。
殼體90上安裝有具有觸摸屏94的顯示面板93。觸摸屏94包括操作者用于啟動和控制任何一個設備中的過程并且觀察過程的結(jié)果的裝置。顯示面板包括每個設備的一個LED單元,并且提供簡單的指示,該指示是特定的設備在使用中以及其中的過程的進展。
用于血液樣品中遺傳物質(zhì)的識別并且使用該設備的過程包括如下步驟:
·向上述的包含凍干的PCR試劑和標記的引物的微滴定反應容器中注入足夠量的純水;
·向反應容器中注入生物液體樣品;
·如果必要,在所述反應容器中使反應容器內(nèi)容物經(jīng)受細胞破碎過程;
·在反應容器中,在反應容器的內(nèi)容物上實施病原體特異性聚合酶鏈反應(PCR);以及
·監(jiān)控PCR并且由此確定特定的遺傳物質(zhì)的存在。
血液樣品將采用固定容量的毛細管抽吸器/分配器(如“MICROSAFE”)來收集,從而恰好所需量的血液可被輸送至反應容器。采用本文所述的設備,該收集和輸送可方便地由穿著防護服的衛(wèi)生工作人員來執(zhí)行。
對于血液,細胞破碎過程包括煮沸然后冷卻樣品,從而其中的遺傳物質(zhì)細胞被破開。此循環(huán)操作可執(zhí)行多次,例如多至五次。
由于TEC 14的基面20保持在稍微高于普通DNA/RNA的退火溫度的恒定的溫度,至工作面21的正電流引起該面21加熱至高于基面20的溫度的一個溫度。提供給工作面21的負電流引起其溫度下降至低于基面20的溫度。
PCR過程被讀取器裝置監(jiān)控,該讀取器裝置包括光學布置,該光學布置典型地結(jié)合依靠LED激發(fā)和CCD探測的分光光度計。得到的光譜然后與目標DNA/RNA的光譜比較,并且因此確定樣品是否包含目標DNA。
一旦任何特定設備中的過程完成,承載密封的反應容器50的支架60可從板80/設備上被移除并且被丟棄,優(yōu)選被焚化。
設備的典型尺寸是40mm的長度和55mm的直徑。這一方面符合穿防護服的操作者方便手工處理,另一方面符合用于一次性使用的廉價的生產(chǎn)。這意味著支架60可以是大約55mm的直徑和2cm的深度。用于這樣的設備的合適的玻爾貼單體尺寸為9平方毫米。殼體90的整體尺寸(包括光學單元)為55cm長×45cm寬×35cm深。
盡管該設備和過程被描述為適合于檢測血液中的目標DNA/RNA,它們也可方便地用于檢測尿液或唾液中目標DNA/RNA。