本申請是申請日為2015年11月4日，名稱為“一種基于下一代測序技術(shù)檢測EGFR/KRAS/BRAF基因突變位點的多重PCR引物和方法及應(yīng)用”的中國專利申請201510740906.1的分案。
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及一種基于下一代測序技術(shù)檢測EGFR、KRAS和/或BRAF基因突變位點的多重PCR引物和方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：表皮生長因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)是位于7號染色體短臂上的原癌基因C-erbB-1(HER-1)的表達(dá)產(chǎn)物，是表皮生長因子受體家族(HER)中的4個成員之一，HER家族在細(xì)胞生理過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。EGFR酪氨酸激酶區(qū)域的突變主要發(fā)生在18～21號外顯子，其中19和21號外顯子突變占總突變的90％。EGFR信號傳導(dǎo)的異常是導(dǎo)致多種腫瘤發(fā)生的原因。研究表明，EGFR在多種腫瘤中都有表達(dá)，如結(jié)直腸癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌和非小細(xì)胞肺癌等。K-ras基因是一種原癌基因，長約35kb，位于12號染色體短臂上，是ras基因家族成員之一，編碼KRAS蛋白。K-ras基因常見的突變位點位于2號外顯子的12號密碼子和13號密碼子上、3號外顯子的6l號密碼子，其中有7個突變熱點：G12C、G12R、G12S、G12V、G12D、G12A、G13V/D，占K-ras基因總突變的98％以上。研究表明體細(xì)胞K-ras基因突變與多種人類惡性腫瘤，如肺癌、白血病、黏蛋白腺癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌有關(guān)，而生殖細(xì)胞K-ras基因突變與努南綜合征和心臟-面部-皮膚(cardio-facio-cutaneous，CFC)綜合征相關(guān)。BRAF基因是一種原癌基因，定位于7號染色體上，編碼絲/蘇氨酸特異性激酶。約90％的BRAF基因突變發(fā)生在外顯子15的1799位核苷酸上，T突變?yōu)锳，導(dǎo)致纈氨酸被谷氨酸取代(V600E)。BRAF基因突變在黑色素瘤、結(jié)直腸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肉瘤、卵巢癌、乳腺癌以及肺癌等腫瘤細(xì)胞系中的發(fā)生率依次為59％、18％、11％、9％、14％、2％、3％；此外，BRAFV600E在甲狀腺乳頭狀癌中的發(fā)生率高達(dá)35.8％。BRAF基因突變是晚期及復(fù)發(fā)性結(jié)直腸癌最重要的預(yù)后指標(biāo)之一，與患者較差的總體生存期密切相關(guān)。目前常見的檢測這三個基因突變的方法有Sanger測序法和熒光定量PCR法。Sanger測序法中，單對引物可檢測多個突變，但對多個基因、或同一基因的不同外顯子上的突變位點就需分別進(jìn)行擴(kuò)增測序，操作繁瑣，并且靈敏度較低約20％，假陰性率較高。熒光定量PCR法雖然靈敏度高，但每對引物只能檢測一種突變，且每種突變需單獨建立一個PCR反應(yīng)體系，同時檢測多個樣本多個突變位點操作繁瑣。這兩種方法對樣本的需要量都較大，不適合同時檢測多個基因突變位點。技術(shù)實現(xiàn)要素：鑒于此，本發(fā)明提供了一種多重PCR引物及應(yīng)用。第一方面，本發(fā)明提供了一種多重PCR引物。該多重PCR引物由以下引物對組成：SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示引物對，SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示引物對，SEQIDNO:11和SEQIDNO:12所示引物對，以及SEQIDNO:17和SEQIDNO:18所示引物對。發(fā)明人基于目標(biāo)序列特點多次設(shè)計，以及多次組合試驗篩選，確定了這一組多重PCR引物，利用該多重PCR引物，能夠一次性高效擴(kuò)增獲得EGFR上的多個外顯子區(qū)域序列，繼而能夠用于檢測EGFR上的多個外顯子上的基因突變位點。其中的SEQIDNO:3和SEQIDNO:4引物對能夠在同一反應(yīng)體系中不受其它引物對影響地實現(xiàn)EGFR基因的外顯子18的區(qū)域的擴(kuò)增，SEQIDNO:7和SEQIDNO:8引物對能夠在同一反應(yīng)體系中不受其它引物對影響地實現(xiàn)EGFR基因的外顯子19的區(qū)域的至少一部分的擴(kuò)增，SEQIDNO:11和SEQIDNO:12引物對能夠在同一反應(yīng)體系中不受其它引物對影響地實現(xiàn)EGFR基因的外顯子20的區(qū)域的至少一部分的擴(kuò)增，SEQIDNO:17和SEQIDNO:18引物對能夠在同一反應(yīng)體系中不受其它引物對影響地實現(xiàn)EGFR基因的外顯子21的區(qū)域的至少一部分的擴(kuò)增。根據(jù)本發(fā)明的實施例，上述多重PCR引物還可以進(jìn)一步包括如下附加技術(shù)特征至少之一：根據(jù)本發(fā)明的實施例，該多重PCR引物還包括以下引物對中的至少一對：SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示引物對，SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示引物對，SEQIDNO:9和SEQIDNO:10所示引物對，SEQIDNO:13和SEQIDNO:14所示引物對，SEQIDNO:15和SEQIDNO:16所示引物對，SEQIDNO:19和SEQIDNO:20所示引物對，SEQIDNO:21和SEQIDNO:22所示引物對，SEQIDNO:23和SEQIDNO:24所示引物對，SEQIDNO:25和SEQIDNO:26所示引物對以及SEQIDNO:27和SEQIDNO:28所示引物對。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該多重PCR引物還包括以上所列引物對中的兩對、三對、五對或者全部十對。其中，SEQIDNO:1和SEQIDNO:2引物對能夠在同一反應(yīng)體系中不受其它引物對影響地實現(xiàn)EGFR基因的外顯子18的區(qū)域的至少一部分的擴(kuò)增，SEQIDNO:5和SEQIDNO:6引物對能夠在同一反應(yīng)體系中不受其它引物對影響地實現(xiàn)EGFR基因的外顯子19的區(qū)域的至少一部分的擴(kuò)增，SEQIDNO:9和SEQIDNO:10引物對以及SEQIDNO:13和SEQIDNO:14引物對能夠在同一反應(yīng)體系中不受其它引物對影響地實現(xiàn)EGFR基因的外顯子20的區(qū)域的至少一部分的擴(kuò)增，SEQIDNO:17和SEQIDNO:18引物對以及SEQIDNO:19和SEQIDNO:20引物對能夠在同一反應(yīng)體系中不受其它引物對影響地實現(xiàn)EGFR基因的外顯子21的區(qū)域的至少一部分的擴(kuò)增，SEQIDNO:21和SEQIDNO:22引物對能夠在同一反應(yīng)體系中不受其它引物對影響地實現(xiàn)KRAS基因的外顯子2的區(qū)域的至少一部分的擴(kuò)增，SEQIDNO:23和SEQIDNO:24引物對能夠在同一反應(yīng)體系中不受其它引物對影響地實現(xiàn)KRAS基因的外顯子2的區(qū)域的至少一部分的擴(kuò)增，SEQIDNO:25和SEQIDNO:26引物對能夠在同一反應(yīng)體系中不受其它引物對影響地實現(xiàn)BRAF基因的外顯子15的區(qū)域的至少一部分的擴(kuò)增，SEQIDNO:27和SEQIDNO:28引物對能夠在同一反應(yīng)體系中不受其它引物對影響地實現(xiàn)BRAF基因的外顯子15的區(qū)域的至少一部分的擴(kuò)增。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述多重PCR引物中，至少包括擴(kuò)增EGFR、KRAS和BRAF基因中任意兩個基因的引物對，所述引物對能夠用于擴(kuò)增所述基因的至少一個外顯子區(qū)域。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，若多次設(shè)計摸索以及多次試驗篩選確定的多重PCR引物組能夠在同一反應(yīng)體系中、同時互不干擾地實現(xiàn)目標(biāo)片段的擴(kuò)增，其中的任一部分引物組合也能于同一反應(yīng)體系中發(fā)揮各自的功能，即互不影響地同時實現(xiàn)相應(yīng)目標(biāo)區(qū)域的擴(kuò)增。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述多重PCR引物為SEQIDNO:1～SEQIDNO:28所示的核苷酸序列組成的引物組。一次性獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物可全面覆蓋EGFR18～21號外顯子、KRAS2號外顯子和BRAF15號外顯子區(qū)域。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，若多次設(shè)計摸索以及多次試驗篩選確定的多重PCR引物組(比如，SEQIDNO:1～SEQIDNO:28所示的核苷酸序列組成的引物組)獲得了較佳的擴(kuò)增效果，一般情況下，設(shè)計引物的時候，適當(dāng)?shù)膶⒍嘀豍CR引物組中任一一條引物的長度延長或截短0～3個堿基，也可以獲得不錯的多重PCR擴(kuò)增效果，也應(yīng)納入本發(fā)明保護(hù)范圍。第二方面，本發(fā)明提供了前面本發(fā)明一方面或者任一實施例中的多重PCR引物在獲得和/或檢測EGFR、KRAS和/或BRAF基因序列中的用途。上述對本發(fā)明一方面或者任一實施例中的多重PCR引物的技術(shù)特征和效果的描述，同樣適用本發(fā)明這一方面的用途，在此不再贅述。第三方面，本發(fā)明提供了一種試劑盒。該試劑盒包含前面本發(fā)明一方面或者任一實施例中的多重PCR引物。上述對本發(fā)明一方面或者任一實施例中的多重PCR引物的技術(shù)特征和效果的描述，同樣適用本發(fā)明這一方面的試劑盒，在此不再贅述。第四方面，本發(fā)明提供了前面任一實施例中的試劑盒在獲得和/或檢測EGFR、KRAS和/或BRAF基因序列中的用途。第五方面，本發(fā)明提供了一種擴(kuò)增基因序列目標(biāo)區(qū)域的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述方法包括利用前面所述的多重PCR引物進(jìn)行所述擴(kuò)增。根據(jù)本發(fā)明的實施例，上述方法還可以進(jìn)一步包括如下附加技術(shù)特征至少之一：根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，所述多重PCR反應(yīng)的體系中，各引物等摩爾混合。根據(jù)本發(fā)明的再一具體實施例，所述多重PCR反應(yīng)的體系中，模板量為50ng～1μg/50μl體系。根據(jù)本發(fā)明的再一具體實施例，所述多重PCR反應(yīng)的程序為：上述程序具體為：95℃預(yù)變性15min，95℃變性15s，60℃退火2min，72℃延伸3min，循環(huán)30～40次(優(yōu)選為35次)，最后72℃后延伸10min。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，所述多重PCR反應(yīng)結(jié)束后，電泳，割膠回收片段長度為150bp的DNA片段。第六方面，本發(fā)明提供了一種EGFR、KRAS和/或BRAF基因檢測的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述方法包括：(1)利用前面所述的方法對待樣品中的至少一部分核酸進(jìn)行擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；(2)分析所述擴(kuò)增產(chǎn)物，以獲得EGFR、KRAS和/或BRAF基因檢測結(jié)果。根據(jù)本發(fā)明的實施例，上述EGFR、KRAS和/或BRAF基因檢測的方法還可以進(jìn)一步包括如下附加技術(shù)特征至少之一：根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述核酸為DNA和/或RNA。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述RNA為(優(yōu)選采用RNA試劑盒)提取人外周血單個核細(xì)胞獲得的總RNA。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述核酸為RNA，步驟(1)包括：(1-1)利用所述多重PCR引物中的上游或下游引物將所述RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA；以及(1-2)利用所述多重PCR引物中相應(yīng)的下游或上游引物對所述cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，當(dāng)所述核酸為RNA，步驟(1)包括：先以下游引物組為反轉(zhuǎn)錄引物合成cDNA；然后以合成的cDNA為模板，加入上游引物組，進(jìn)行多重PCR，擴(kuò)增cDNA，獲得多重PCR產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明的再一具體實施例，當(dāng)所述核酸為RNA，步驟(1)包括：先以上游引物組為反轉(zhuǎn)錄引物合成cDNA；然后以合成的cDNA為模板，加入下游引物組，進(jìn)行多重PCR，擴(kuò)增cDNA，獲得多重PCR產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明的實施例，步驟(2)包括：(2-1)對所述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序；以及(2-2)將測序結(jié)果分別與EFGR、KRAS和/或BRAF基因野生型序列比對，以確定EFGR、KRAS和/或BRAF基因突變位點。如本發(fā)明所述的，所述“EGFR、KRAS和/或BRAF基因突變位點”或“EGFR/KRAS/BRAF基因突變位點”表示EGFR、KRAS、BRAF三個基因中的一個或多個。第八方面，本發(fā)明提出了一種檢測癌癥的方法，根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述方法包括：利用前面所述的EGFR、KRAS和/或BRAF基因檢測的方法進(jìn)行EFGR、KRAS和/或BRAF基因檢測，獲得檢測結(jié)果，所述待測樣品來自受檢者；以及依據(jù)檢測結(jié)果，評估受檢者的患癌風(fēng)險。根據(jù)本發(fā)明的實施例，上述檢測癌癥的方法還可以進(jìn)一步包括如下附加技術(shù)特征至少之一：根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述檢測結(jié)果包含以下突變中的至少之一：EGFRc.2156G>A、EGFRc.2235_2249del15、EGFRc.2240_2257del18、EGFRc.2369C>T、EGFRc.2573T>G、EGFRc.2582T>A、EGFRc.34G>T、KRASc.34G>T、KRASc.34G>A、KRASc.34G>C、KRASc.35G>T、KRASc.35G>A、KRASc.35G>C、KRASc.38G>A和BRAFc.1799T>A，則指示受檢者患有癌癥。上述突變是根據(jù)HGVS等命名法標(biāo)注該位點在參考cDNA上的位置來表示的，一個突變位點還可以有其它表示方式，如GenBankSNP數(shù)據(jù)庫的命名方法，是以“rs”開頭的SNP位點表示方式，rs671與ALDH2基因c.1510G>A(G1510A)表示同一個位點。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道，采用其它命名方式比如以該突變在參考gDNA上的位置來標(biāo)注指代與本發(fā)明一樣的突變也屬于本發(fā)明范圍。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述癌癥包括選自結(jié)直腸癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌、白血病、黏蛋白腺癌、黑色素瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肉瘤、卵巢癌和乳腺癌的至少之一。本發(fā)明提供的基于下一代測序技術(shù)檢測EGFR/KRAS/BRAF基因突變位點的多重PCR引物及方法的有益效果為：本發(fā)明提供了檢測EGFR、KRAS和BRAF基因突變位點的多重PCR引物，包含了分別擴(kuò)增這三個基因的一個或多個外顯子區(qū)域的引物對，能夠覆蓋EGFR18～21號外顯子、KRAS2號外顯子和BRAF15號外顯子，包括了EGFR、KRAS和BRAF基因的主要突變位點。所設(shè)計的目標(biāo)序列在每個DNA樣品中均得到有效的擴(kuò)增，在所設(shè)計的KRAS、EGFR和BRAF基因的各個外顯子中均能真實的檢測出突變，從而反映出所提供的檢測方案具有較好的特異性和適用性。本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。附圖說明本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點從結(jié)合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中：圖1為本發(fā)明實施例提供的單獨引物PCR的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖2為本發(fā)明實施例提供的多重PCR的瓊脂糖凝膠電泳圖；以及圖3為本發(fā)明實施例提供的測序深度的生物信息學(xué)分析結(jié)果。具體實施方式下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標(biāo)號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。材料及試劑說明：癌癥(如肺癌、結(jié)直腸癌等)患者：來源于深圳第六人民醫(yī)院，患者知情同意。非特殊說明，本發(fā)明實施例采用的試劑均為市售商品，本發(fā)明實施例采用的數(shù)據(jù)庫均為公開的在線數(shù)據(jù)庫。具體地，本發(fā)明引物如表1所示。表1：多重PCR引物序列設(shè)計引物：采用Oligo7.0和MFEprimer-2.0對引物二聚體以及莖環(huán)錯配進(jìn)行分析，在包含突變位點的外顯子兩端設(shè)計引物，擴(kuò)增的序列平均長度在150bp左右，且14對引物的退火溫度基本一致。本實施例提供的引物組覆蓋了EGFR18～21號外顯子、KRAS2號外顯子和BRAF15號外顯子基因突變位點。由于很小的序列變化將導(dǎo)致引物擴(kuò)增效果顯著降低，發(fā)明人分別針對不同目的區(qū)域的不同區(qū)段設(shè)計了多組多重PCR引物組，在經(jīng)過預(yù)實驗篩選后，綜合產(chǎn)物片段長度和點突變覆蓋范圍，本發(fā)明選取了擴(kuò)增效果最佳的引物組，如上表1所示。表1各對引物單獨PCR結(jié)果如圖1所示。其中，表1中14對引物分別進(jìn)行擴(kuò)增驗證的PCR體系及PCR參數(shù)如下：反應(yīng)體系如表2所示：參照QIAGEN公司MultiplexPCR試劑盒(貨號：206143)配置。表2：多重PCR緩沖液(MultiplexBuffer,2×)25μlQ溶劑(Qsolution,5×)10μl引物5μlDNA10μlTotal50μl循環(huán)參數(shù)：實施例1本發(fā)明實施例1提供了一種待測DNA樣品的制備方法，包括如下步驟：從醫(yī)院獲取包含癌細(xì)胞的組織，采用QIAampDNAMiniKit(51304)試劑盒提取基因組DNA，并用Nanodrop2000(Thermo)測定DNA的濃度及純度，然后保存基因組DNA。實施例2本發(fā)明實施例2提供了一種采用檢測EGFR/KRAS/BRAF基因突變位點的多重PCR引物構(gòu)建EGFR/KRAS/BRAF基因突變測序文庫的方法，包括如下步驟：1、多重PCR：以實施例1所得基因組DNA為擴(kuò)增模板采用SEQIDNO:1～SEQIDNO:28所示14對引物對，再采用QIAGEN公司MultiplexPCR試劑盒(貨號：206143)，按試劑盒說明書配置兩管多重PCR體系，多重PCR體系如表3所示。表3：反應(yīng)體系：多重PCR緩沖液(MultiplexBuffer,2×)25μlQ溶劑(Qsolution,5×)10μl引物5μlDNA10μlTotal50μl各引物分兩組進(jìn)行等摩爾混合，引物總濃度是10微摩爾。第一組引物包括：引物編號1、2、5、6、9、10、13、14、15、16、21、22、25和26；第二組引物包括：引物編號3、4、7、8、11、12、17、18、19、20、23、24、27和28。模板量可以調(diào)整，本實施例中采用200ng。再按下述多重PCR的條件設(shè)置PCR儀器程序，進(jìn)行多重PCR：PCR結(jié)束后，4℃保存PCR產(chǎn)物并電泳檢測，在紫外下切下約150bp左右的目的片段。將第一組引物和第二組引物的PCR產(chǎn)物合在一起回收，得到32uL純化后的產(chǎn)物，膠回收步驟采用QIAGEN公司QIAquick膠純化試劑盒，按常規(guī)實驗室操作進(jìn)行。2、加尾：取純化后的PCR產(chǎn)物，在產(chǎn)物3’末端加A尾，配置體系如表4所示(其中，Klenowexo-購自NEB，貨號：M0212)：表4：10×NEB2BUFFER5μldATP(1mM)10μlKlenowexo-3μlDNA32μlTotal50μl將該體系置于37℃下30min。利用QIAGEN公司QIAquick膠純化試劑盒純化加A尾的PCR產(chǎn)物。3、加接頭：在DNA兩端加上測序用的接頭，配置體系如表5所示(其中，Quickligase購自NEB，M2200L)。表5：5×quickligasebuffer10μlAdaptor1μlQuickligase5μl加A尾的PCR產(chǎn)物25μlH2O9μlTotal50μl其中，Adaptor的序列SEQIDNO：29所示：5’-/5Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTC/ideoxyU/ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3’(SEQIDNO：29)。隨后將該體系置于20℃下15min。然后加入3μL的USER，37℃放置15min。最后通過QIAGEN公司QIAquick膠回收試劑盒純化連接產(chǎn)物。4、產(chǎn)物上加入測序用的標(biāo)簽序列，配置體系如表6所示(具體步驟參照illumina高通量測序文庫構(gòu)建說明書)。表6：5×Q5Solutionbuffer10μldNTP(10mM)1μlP1(P5序列+common序列+接頭序列)1μlIndex(P7序列+標(biāo)簽序列Index+接頭序列)1μlQ5酶0.5μl純化后的連接產(chǎn)物36.5ulTotal50μl將配置的體系按下述程序進(jìn)行PCR反應(yīng)：PCR結(jié)束后，用1.5％瓊脂糖凝膠電泳驗證PCR產(chǎn)物富集片段的大小，選取270bp的目的片段進(jìn)行切膠回收，并純化至30μL。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖2所示。在圖2中，S1～S4(分別代表不同的樣本)泳道可以明顯看到在250bp-300bp之間有一條帶，為加上接頭的片段(270bp)，與理論相符。5、將步驟4獲得的純化產(chǎn)物直接用Miseq平臺測序進(jìn)行測序。測序結(jié)果是fastq格式的數(shù)據(jù)，通過生物信息學(xué)分析獲得EGFR、BRAS和KRAF三個基因多突變位點情況。測序深度見圖3。本實施例使用PE150試劑盒進(jìn)行測序，即片段兩端各測序150bp。生物信息學(xué)分析測序深度如圖3所示，橫坐標(biāo)是EGFR、BRAS和KRAF每對引物得到的擴(kuò)增產(chǎn)物，縱坐標(biāo)是測序深度。由圖3可知，本實施例測序結(jié)果中覆蓋了所有引物對的擴(kuò)增產(chǎn)物，并且分布比較平均。效果實施例1參照實施例2的方法，對100例肺癌癌癥樣品(包含癌細(xì)胞的樣品)分別進(jìn)行多重PCR、加A尾、加接頭、加標(biāo)簽序列、高通量測序及生物信息學(xué)分析，獲得如下結(jié)果，如表7所示：表7：癌癥樣品基因突變位點檢測如表7所示，在測試的100例癌癥樣品中，三個基因的主要突變位點均有檢測到。特別值得注意的是，經(jīng)過對樣品測序的數(shù)據(jù)分析，證實所設(shè)計的目標(biāo)序列在每個DNA樣品中均得到有效的擴(kuò)增，從突變結(jié)果中也可看出，在所設(shè)計的KRAS、EGFR和BRAF基因的各個外顯子中均檢測到了突變，從而反映出所提供的檢測方案具有較好的特異性和適用性。在本發(fā)明的描述中，除非另有說明，“多個”的含義是兩個或兩個以上。在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個實施例”、“一些實施例”、“示意性實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點包含于本發(fā)明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術(shù)語的示意性表述不一定指的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點可以在任何的一個或多個實施例或示例中以合適的方式結(jié)合。盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解：在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對這些實施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限定。SEQUENCELISTING<110>深圳市瀚海基因生物科技有限公司<120>同時獲取以及檢測多個目標(biāo)區(qū)域序列的引物、試劑盒和方法<130>PI2015017_3<160>29<170>PatentInversion3.3<210>1<211>20<212>DNA<213>Artificial<220><223>多重PCR引物（EGFR-18-No.1-F）<400>1cccttgtctctgtgttcttg20<210>2<211>19<212>DNA<213>Artificial<220><223>多重PCR引物（EGFR-18-No.1-R）<400>2cttatacaccgtgccgaac19<210>3<211>20<212>DNA<213>Artificial<220><223>多重PCR引物（EGFR-18-No.2-F）<400>3gagaagctcccaaccaagct20<210>4<211>18<212>DNA<213>Artificial<220><223>多重PCR引物（EGFR-18-No.2-R）<400>4agaccatgagaggccctg18<210>5<211>19<212>DNA<213>Artificial<220><223>多重PCR引物（EGFR-19-No.3-F）<400>5gcagcatgtggcaccatct19<210>6<211>20<212>DNA<213>Artificial<220><223>多重PCR引物（EGFR-19-No.3-R）<400>6ttccttgttggctttcggag20<210>7<211>20<212>DNA<213>Artificial<220><223>多重PCR引物（EGFR-19-No.4-F）<400>7tctctctgtcatagggactc20<210>8<211>21<212>DNA<213>Artificial<220><223>多重PCR引物（EGFR-19-No.4-R）<400>8cacagcaaagcagaaactcac21<210>9<211>20<212>DNA<213>Artificial<220><223>多重PCR引物（EGFR-20-No.1-F）<400>9atgcgaagccacactgacgt20<210>10<211>18<212>DNA<213>Artificial<220><223>多重PCR引物（EGFR-20-No.1-R）<400>10gatgagctgcacggtgga18<210>11<211>18<212>DNA<213>Artificial<220><223>多重PCR引物（EGFR-20-No.2-F）<400>11ctccctccaggaagccta18<210>12<211>21<212>DNA<213>Artificial<220><223>多重PCR引物（EGFR-20-No.2-R）<400>12attgtctttgtgttcccggac21<210>13<211>17<212>DNA<213>Artificial<220><223>多重PCR引物（EGFR-20-No.3-F）<400>13gcagctcatgcccttcg17<210>14<211>21<212>DNA<213>Artificial<220><223>多重PCR引物（EGFR-20-No.3-R）<400>14cgtatctcccttccctgatta21<210>15<211>20<212>DNA<213>Artificial<220><223>多重PCR引物（EGFR-21-No.1-F）<400>15tgaactacttggaggaccgt20<210>16<211>20<212>DNA<213>Artificial<220><223>多重PCR引物（EGFR-21-No.1-R）<400>16ccttactttgcctccttctg20<210>17<211>20<212>DNA<213>Artificial<220><223>多重PCR引物（EGFR-21-No.2-F）<400>17aaacaccgcagcatgtcaag20<210>18<211>21<212>DNA<213>Artificial<220><223>多重PCR引物（EGFR-21-No.2-R）<400>18aaatgctggctgacctaaagc21<210>19<211>21<212>DNA<213>Artificial<220><223>多重PCR引物（EGFR-21-No.4-F）<400>19attcggatgcagagcttcttc21<210>20<211>19<212>DNA<213>Artificial<220><223>多重PCR引物（EGFR-21-No.4-R）<400>20gatcttgacatgctgcggt19<210>21<211>20<212>DNA<213>Artificial<220><223>多重PCR引物（KRAS-2-No.1-F）<400>21cgtcaaggcactcttgccta20<210>22<211>21<212>DNA<213>Artificial<220><223>多重PCR引物（KRAS-2-No.1-R）<400>22ggtactggtggagtatttgat21<210>23<211>20<212>DNA<213>Artificial<220><223>多重PCR引物（KRAS-2-No.4-F）<400>23ggtcctgcaccagtaatatg20<210>24<211>25<212>DNA<213>Artificial<220><223>多重PCR引物（KRAS-2-No.4-R）<400>24aatataaacttgtggtagttggagc25<210>25<211>22<212>DNA<213>Artificial<220><223>多重PCR引物（BRAF-15-No.1-F）<400>25gactttctagtaactcagcagc22<210>26<211>21<212>DNA<213>Artificial<220><223>多重PCR引物（BRAF-15-No.1-R）<400>26cagtgaaatctcgatggagtg21<210>27<211>23<212>DNA<213>Artificial<220><223>多重PCR引物（BRAF-15-No.2-F）<400>27ccagacaactgttcaaactgatg23<210>28<211>22<212>DNA<213>Artificial<220><223>多重PCR引物（BRAF-15-No.2-R）<400>28gctctgataggaaaatgagatc22<210>29<211>65<212>DNA<213>Artificial<220><223>adaptor序列<220><221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>磷酸化修飾<220><221>misc_feature<222>(32)..(32)<223>脫氧修飾<220><221>misc_feature<222>(65)..(65)<223>硫代磷酸酯修飾<400>1gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcuacactctttccctacacgacgctcttcc60gatct當(dāng)前第1頁1 2 3