本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種快速提取冬蟲(chóng)夏草菌基因組DNA的方法。

背景技術(shù)：

冬蟲(chóng)夏草Ophiocordyceps sinensis是我國(guó)一種傳統(tǒng)的名貴中藥材，是一種昆蟲(chóng)與真菌的結(jié)合體。是我國(guó)一種傳統(tǒng)的珍貴中藥材。野生冬蟲(chóng)夏草僅分布于青藏高原及周邊地區(qū)海拔3000m以上、雪線以下的地區(qū)，在我國(guó)的分布包括西藏、青海、四川、云南、甘肅5省區(qū)的高寒草甸草原?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》自1963年版直到目前的2015年版都對(duì)冬蟲(chóng)夏草進(jìn)行了收錄，2015年版藥典記載其“甘，平。歸肺、腎經(jīng)。補(bǔ)腎益肺，止血化痰。用于腎虛精虧，陽(yáng)痿遺精，腰膝酸痛，久咳虛喘，勞嗽咯血”。

迄今為止，有關(guān)冬蟲(chóng)夏草菌的研究越來(lái)越側(cè)重于人工培育的方法，借助于分子生物學(xué)手段的實(shí)驗(yàn)也越來(lái)越多。在研究其交配型基因的表達(dá)或產(chǎn)物時(shí)首先需要獲得冬蟲(chóng)夏草菌的基因組DNA，才能進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

現(xiàn)有技術(shù)提取冬蟲(chóng)夏草菌的基因組DNA的方法主要為CTAB法，該方法提取的DNA可用于基因擴(kuò)增、全基因組測(cè)序或其他對(duì)基因組DNA要求較高的分子生物學(xué)試驗(yàn)中。但CTAB法耗時(shí)長(zhǎng)，需要的儀器設(shè)備多，設(shè)備要求高，提取成本較高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題為：現(xiàn)有提取冬蟲(chóng)夏草菌基因組DNA的方法耗時(shí)長(zhǎng)、設(shè)備要求高、生產(chǎn)成本高等問(wèn)題。

本發(fā)明解決技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案為：提供一種快速提取冬蟲(chóng)夏草菌基因組DNA的方法。該方法包括以下步驟：

a、冬蟲(chóng)夏草菌菌體培養(yǎng)與收集

將冬蟲(chóng)夏草菌菌種接種于培養(yǎng)基中，培養(yǎng)10～20d后，過(guò)濾，收集菌絲沉淀；

b、冬蟲(chóng)夏草菌基因組DNA的提取

取步驟a所得菌絲沉淀，加入蒸餾水，打碎菌體，離心后棄上清；加入磷酸氫二鉀溶液，離心棄上清；再加入磷酸氫二鉀震蕩成均勻懸浮的菌液，加入混合酶液,混合酶液為蝸牛酶和纖維素酶的混合液,震蕩混勻0.5～3h，煮沸5～30min，再于冰上放置5～30min，離心，上清即為冬蟲(chóng)夏草菌基因組DNA。

其中，上述快速提取冬蟲(chóng)夏草菌基因組DNA的方法中，步驟a中所述的培養(yǎng)基組成為：每升培養(yǎng)基中含馬鈴薯80～300g，葡萄糖20～50g，蛋白胨5～20g,酵母提取物1～10g,磷酸氫二鉀0.1～5g，硫酸鎂0.1～5g，余量為水。

其中，上述快速提取冬蟲(chóng)夏草菌基因組DNA的方法中，步驟a中所述培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為10～25℃，培養(yǎng)時(shí)置于轉(zhuǎn)速為100～250r/min震蕩搖床中進(jìn)行。

其中，上述快速提取冬蟲(chóng)夏草菌基因組DNA的方法中，步驟b中所述的離心是指在6000～10000r/min離心5～10min。

其中，上述快速提取冬蟲(chóng)夏草菌基因組DNA的方法中，步驟b中所述蒸餾水加入量為每0.5～1g菌絲沉淀中加入蒸餾水2～10ml。

其中，上述快速提取冬蟲(chóng)夏草菌基因組DNA的方法中，步驟b中所述的磷酸氫二鉀溶液濃度為0.01～0.1mol/L，加入量為每0.5～1g菌絲沉淀中加入2～10ml。

其中，上述快速提取冬蟲(chóng)夏草菌基因組DNA的方法中，步驟b中所述每毫升混合酶液中含蝸牛酶1～10mg，含纖維素酶1～10mg。

其中，上述快速提取冬蟲(chóng)夏草菌基因組DNA的方法中，步驟b中所述的混合酶液的加入量為每0.5～1g菌絲沉淀中加入1～10ml。

其中，上述快速提取冬蟲(chóng)夏草菌基因組DNA的方法中，步驟b中所述震蕩混勻時(shí)轉(zhuǎn)速為100～250r/min，溫度為25～37℃。

本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明提供了一種專門針對(duì)于冬蟲(chóng)夏草菌基因組DNA的提取方法，該方法專用于冬蟲(chóng)夏草菌，在提取時(shí)可排除其他雜菌的干擾，DNA純度高；相比現(xiàn)有提取DNA的CTAB法，本發(fā)明耗時(shí)短，CTAB法耗時(shí)4-6h，本發(fā)明耗時(shí)僅為1.5h左右；CTAB法會(huì)使用到氯仿，苯酚等有毒試劑，污染環(huán)境且危害操作者健康，本發(fā)明提取DNA所用試劑少，生產(chǎn)成本低，并且試劑安全無(wú)毒，與環(huán)境更友好。

附圖說(shuō)明

圖1所示為用不同方法提取的DNA進(jìn)行PCR后的電泳圖。M為TAKARA DL2000DNA Marker，1為實(shí)施例提取得到的冬蟲(chóng)夏草菌基因組DNA擴(kuò)增得到的18S片段，2為對(duì)比例1提取得到的蛹蟲(chóng)草基因組DNA擴(kuò)增得到的18S片段，3為對(duì)比例2提取得到的冬蟲(chóng)夏草菌基因組DNA擴(kuò)增得到的18S片段，4為對(duì)比例2提取得到的冬蟲(chóng)夏草菌基因組DNA擴(kuò)增得到的18S片段。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供一種快速提取冬蟲(chóng)夏草菌基因組DNA的方法，包括以下步驟：

a、冬蟲(chóng)夏草菌菌體培養(yǎng)與收集

將冬蟲(chóng)夏草菌菌種接種于培養(yǎng)基中，在10～25℃、轉(zhuǎn)速為100～250r/min的震蕩搖床中培養(yǎng)10～20d后，過(guò)濾，收集菌絲沉淀；所述培養(yǎng)基組成為：每升培養(yǎng)基中含馬鈴薯80～300g，葡萄糖20～50g，蛋白胨5～20g,酵母提取物1～10g,磷酸氫二鉀0.1～5g，硫酸鎂0.1～5g，余量為水；

b、冬蟲(chóng)夏草菌基因組DNA的提取

取步驟a所得菌絲0.5～1g,加入蒸餾水2～10ml，分散器打碎菌體，6000～10000r/min離心5～10min后棄上清；加入磷酸氫二鉀溶液，6000～10000r/min離心5～10min后棄上清；再加入磷酸氫二鉀震蕩成均勻懸浮的菌液，加入混合酶液,100～250r/min于25～37℃震蕩混勻0.5～3h，煮沸5～30min，再于冰上放置5～30min,6000～10000r/min離心5～10min，上清即為冬蟲(chóng)夏草菌基因組DNA。

為了調(diào)整pH為冬蟲(chóng)夏草菌生長(zhǎng)的最適溫度，步驟b中所述的磷酸氫二鉀溶液濃度為0.01～0.1mol/L，每0.5～1g菌絲中加入2～10ml磷酸氫二鉀溶液。

為了使冬蟲(chóng)夏草菌細(xì)胞壁充分裂解，使基因組DNA暴露出來(lái)，步驟b中所述的混合酶液為蝸牛酶和纖維素酶的混合液；進(jìn)一步的，每毫升混合酶液中含蝸牛酶1～10mg，含纖維素酶1～10mg。其中，步驟b中所述的混合酶液的加入量為每0.5～1g菌絲中加入混合酶液1～10ml。

下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式做進(jìn)一步的解釋說(shuō)明，但不表示將本發(fā)明的保護(hù)范圍限制在實(shí)施例所述范圍內(nèi)。

實(shí)施例用本發(fā)明方法提取冬蟲(chóng)夏草菌基因組DNA

具體操作步驟如下：

a、取冬蟲(chóng)夏草菌菌種0.5g，加入含有70ml培養(yǎng)基(馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，酵母提取物1g/L,磷酸氫二鉀1g/L，硫酸鎂0.5g/L)的250ml三角瓶中，放入轉(zhuǎn)速為150r/min震蕩搖床中于18℃培養(yǎng)14d，過(guò)濾培養(yǎng)液，收集菌絲沉淀；

b、取1g步驟a得到的菌絲，加入4ml蒸餾水，用分散器打碎菌體，7000r/min離心5min，棄上清；加入0.01mol/L的磷酸氫二鉀溶液4ml，充分震蕩混勻后7000r/min離心5min，棄上清；再加入0.01mol/L的磷酸氫二鉀溶液4ml，充分震蕩混勻成均勻懸浮的菌液，加入2ml混合酶液(每1000μl混合酶液中包含25mg/ml蝸牛酶200μl，10mg/ml纖維素酶500μl，菌液300μl)，200r/min于37℃震蕩混勻1h，再在沸水浴中煮沸5-10min，轉(zhuǎn)入冰上放置5min，7000r/min離心5min，取上清，上清液存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

對(duì)比例1用CTAB法提取冬蟲(chóng)夏草菌菌基因組DNA

具體操作步驟如下：

a、取冬蟲(chóng)夏草菌菌種0.5g，接種于含有70ml液體培養(yǎng)基(馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，酵母提取物1g/L,磷酸氫二鉀1g/L，硫酸鎂0.5g/L)的250ml三角瓶中，放入轉(zhuǎn)速為150r/min震蕩搖床中于18℃培養(yǎng)14d；

b、過(guò)濾培養(yǎng)液，收集菌絲沉淀于2ml離心管中；

c、收集的菌體用無(wú)菌水沖洗3次，8000r/min離心去上清液；

d、將步驟c得到的菌絲樣品放入盛有10～20ml液氮的碾缽中，在液氮揮發(fā)完之前將菌絲碾磨成粉末，移入2ml離心管中；

e、加入700μl含有1％β-巰基乙醇的CTAB緩沖液，混勻，于65℃水浴鍋溫育60min.然后12000rpm 4℃離心15min，上清轉(zhuǎn)移到新的2ml離心管中；

f、加入700μl的飽和苯酚：氯仿：異戊醇＝25：24：1的混合液，充分混勻，12000rpm4℃離心15min。將上清液移入到新的2ml離心管中，加入700μl的氯仿：異戊醇＝24：1的混合液，充分混勻，經(jīng)12000rpm 4℃離心15min，上清轉(zhuǎn)移到新的2ml離心管中；

g、加入1400μl保存于-20℃的無(wú)水乙醇以及70μl 3M NaAc(pH＝5.2),于-20℃放置30min，經(jīng)12000rpm 4℃離心15min；去上清；

h、加入500μl體積分?jǐn)?shù)為70％的酒精洗沉淀，去掉上清后置于濾紙上干燥，直到酒精揮發(fā)完畢，加入20μl無(wú)菌水溶解DNA，保存于-20℃。

對(duì)比例2用本發(fā)明方法提取蛹蟲(chóng)草菌基因組DNA

具體操作過(guò)程如下：

除步驟a中將冬蟲(chóng)夏草菌菌種換成等量的蛹蟲(chóng)草菌菌種外，其余操作同實(shí)施例。

對(duì)比例3用本發(fā)明方法提取蝙蝠蛾擬青霉基因組DNA

具體操作過(guò)程如下：

除步驟a中將冬蟲(chóng)夏草菌菌種換成等量的蝙蝠蛾擬青霉菌種外，其余操作同實(shí)施例。

效果驗(yàn)證

將實(shí)施例和對(duì)比例提取的DNA采用PCR進(jìn)行擴(kuò)增，PCR體系包括：

PCR擴(kuò)增條件為：

94℃3min，25個(gè)循環(huán)：94℃30s，56℃30s，72℃x s(根據(jù)擴(kuò)增的DNA片段長(zhǎng)度確定，每1kb長(zhǎng)度DNA需延伸60s)，72℃10min。

PCR引物為：核苷酸序列為Seq ID No.1的18s-F和核苷酸序列為Seq ID No.2的18s-R。

對(duì)實(shí)施例和對(duì)比例1、2、3所得的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，得到如下圖1所示的結(jié)果。

對(duì)實(shí)施例提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后,得到序列號(hào)為Seq ID No.3核苷酸序列；對(duì)對(duì)比例1提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后,得到序列號(hào)為Seq ID No.4核苷酸序列。

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可看出，本發(fā)明提供的DNA提取方法具有特異性，專用于提取冬蟲(chóng)夏草菌基因組DNA，而對(duì)其他物種無(wú)效；本發(fā)明方法提取的基因組DNA用于PCR時(shí)可以和CTAB法提取的基因組DNA達(dá)到同樣效果，卻比CTAB法簡(jiǎn)便快捷，減少有害試劑苯酚、氯仿的使用，節(jié)約成本，與環(huán)境更友好。

SEQUENCE LISTING

<110> 成都圖徑生物科技有限公司

<120> 快速提取冬蟲(chóng)夏草菌基因組DNA的方法

<130> A170180K

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 上游引物18s-F的核苷酸序列

<400> 1

tcctctaaat gaccaagttt g 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 下游引物18s-R的核苷酸序列

<400> 2

ggaagggrtg tatttattag 20

<210> 3

<211> 958

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 實(shí)施例提取的冬蟲(chóng)夏草菌DNA的核苷酸序列

<400> 3

atactctggg ctcctggtga ttcctgataa ctcctcgaat cgcacggcct tgcgccggcg 60

atggttcatt caaatttctt ccctatcaac tttcgatgtt tgggtagtgg ccaaacatgg 120

ttgcaacggg taacggaggg ttagggctcg accccggaga aggagcctga gaaacggcta 180

ctacatccaa ggaaggcagc aggcgcgcaa attacccaat cccgacacgg ggaggtagtg 240

acaataaata ctgatacagg gctcttttgg gtcttgtaat tggaatgagt acaatttaaa 300

tcccttaacg aggaacaatt ggagggcaag tctggtgcca gcagccgcgg taattccagc 360

tccaatagcg tatattaaag ttgttgtggt taaaaagctc gtagttgaac cttgggcctg 420

gctggccggt ccgcctcacc gcgtgtactg gtccggccgg gcctttccct ctgtggaacc 480

ccatgccctt cactgggcgt ggcggggaaa caggactttt actttgaaaa aattagagtg 540

ctccaggcag gcctatgctc gaatacatta gcatggaata atgaaatagg acgcgcggtt 600

ctattttgtt ggtttctagg accgccgtaa tgattaatag ggacagtcgg gggcatcagt 660

attcaatggt cagaggtgaa attcttggat ccattgaaga ctaactactg cgaaagcatt 720

tgtcaaggat gttttcatta atcaggaacg aaagttaggg gatcgaagac gatcagatac 780

cgtcgtagtc ttaaccataa actatgccga ctagggatcg gacgatgtta ttttttgact 840

cgttcggcac cttacgagaa atcaaagtgc ttgggctcca gggggagtat ggtcgcaagg 900

ctgaaactta aagaaattga cggaaaggca ccaccagggg tggaaccttg cgggttta 958

<210> 4

<211> 959

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 對(duì)比例1提取的冬蟲(chóng)夏草菌DNA的核苷酸序列

<400> 4

gactgggtgt agttgcccac ctccctgggc cagtccggac gcctcactga gccattcaat 60

cggtagtagc gacgggcggt gtgtacaaag ggcagggacg taatcaacgc aagctgatga 120

cttgcgctta ctagggattc ctcgttgaag agcaataatt gcaatgctct atccccagca 180

cgacggagtt taacaagatt acccgggcct ttcggccaag gaagtactcg ctggctccgt 240

cagtgtagcg cgcgtgcggc ccagaacatc taagggcatc acagacctgt tattgcctca 300

aacttccatc ggcttgagcc gatagtccct ctaagaagcc ggcgtactgc caaagcaata 360

cgggctattt agcaggttaa ggtctcgttc gttatcgcaa ttaagcagac aaatcactcc 420

accaactaag aacggccatg caccaccacc cacaaaatca agaaagagct ctcaatctgt 480

caatcctcat tgtgtctgga cctggtgagt ttccccgtgt tgagtcaaat taagccgcag 540

gctccacccc tggtggtgcc cttccgtcaa tttctttaag tttcagcctt gcgaccatac 600

tccccctgga gcccaagcac tttgatttct cgtaaggtgc cgaacgcgtc aaaaaataac 660

atcgtccgat ccctagtcgg catagtttat ggttaagact acgacggtat ctgatcgtct 720

tcgatcccct aactttcgtt cctgattaat gaaaacatcc ttggcaaatg ctttcgcagt 780

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ctgtccctat taatcattac ggcggtccta gaaaccaaca aaatagaacc acacgtccta 900

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