本發(fā)明屬于分子生物學領域，涉及桃遺傳育種
技術領域：
，具體涉及一種輔助選擇含有隱性單基因hd桃品種的分子標記及其選育方法和應用。技術背景桃是深受人們喜愛的大宗果品，依據(jù)果肉的質(zhì)地差異，可分為溶質(zhì)、不溶質(zhì)和硬質(zhì)(SH，stonyhard)三種類型，目前國內(nèi)主栽桃品種多為溶質(zhì)桃，成熟后果肉迅速軟化，不僅大大縮短了果實的貯藏時間，而且果實軟化后極易受到病原微生物的侵染，每年由于衰老和腐爛造成大量的損失，是制約桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關鍵問題。而硬質(zhì)桃果實在完全轉色、且積累高濃度糖等的條件下，無論是留樹還是采收，均不會變軟。因此，研究硬質(zhì)桃的肉質(zhì)性狀形成的分子機理，探究決定或調(diào)控肉質(zhì)性狀形成的關鍵基因，有助于創(chuàng)造耐貯運桃優(yōu)異新品種，對于提高果實綜合品質(zhì)、增強市場競爭力具有重要的意義。遺傳上的證據(jù)表明硬質(zhì)性狀受隱性單基因(hd)控制，最近研究發(fā)現(xiàn)位于第六條染色體的PpYUC11(Ppa008176)可能控制桃果實的硬質(zhì)性狀。分析兩種肉質(zhì)類型PpYUC11基因及啟動子區(qū)域的DNA序列發(fā)現(xiàn)，啟動子區(qū)域是否有轉座子插入可以作為區(qū)分硬質(zhì)和非硬質(zhì)類型桃的候選區(qū)域。分子標記輔助選擇(MAS，marker-assistedselection)是隨著現(xiàn)代分子生物學技術的迅速發(fā)展而產(chǎn)生的新技術，它可以從分子水平上快速準確地分析個體的遺傳組成，從而實現(xiàn)對基因型的直接選擇，進行分子育種。目前，在桃SH肉質(zhì)品種的選育過程中主要采用系譜法，傳統(tǒng)的系譜法通過兩組親本組配，從分離后代中擇優(yōu)選育品種，SH肉質(zhì)表現(xiàn)型依賴于桃果實留樹時間或果實硬度鑒定，鑒別難度大，準確率很低。而桃屬于多年生果樹，生長周期長，由于不了解親本的SH基因型，在親本選擇上非常盲目，通常是海量組配，海量選擇后代，導致成本高，工作量大，費時且育種效率低。利用分子標記結合乙烯測定進行選擇，則可以大大提高SH肉質(zhì)品種選育的效率和準確性。技術實現(xiàn)要素：為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種分子標記輔助選擇含有隱性單基因hd桃品種的分子標記、選育方法及其應用。該方法可以高效選擇桃SH肉質(zhì)新品種，有針對性、特異性的選擇含有hd基因的后代材料。利用DNA分子標記CACTA-INS-F和CACTA-INS-R以及WILD-F和WILD-R對控制桃果實SH肉質(zhì)的主效基因PpYUC11進行分子標記輔助選擇，并結合資源圃的自然群體和育種圃的雜交后代群體的性狀選擇、乙烯測定，以提高選育桃果實SH肉質(zhì)新品種的效率。本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的一種輔助選擇含有隱性單基因hd桃品種的分子標記，所述的分子標記包含有變異特征引物序列：正向引物CACTA-INS-F引物序列為5’-CTTTGACTAGGATAACAC-3’，反向引物CACTA-INS-R引物序列為5’-AATGGCATGGACAACGA-3’；及無變異特征引物序列正向引物WILD-F引物序列為5’-ACATCAAACGGCAATCAATA-3’，反向引物WILD-R引物序列為5’-TTAGCCACGAAGGTTACTCA-3’。所述的輔助選擇含有隱性單基因hd桃品種的分子標記，所述的分子標記的主效位點為PpYUC11，該基因位于第6條染色體、且距離預測的第6條染色體上著絲粒的位置小于800k。采用上述輔助選擇含有隱性單基因hd桃品種的分子標記選育SH肉質(zhì)桃品種的方法，該方法包括以下步驟：(1)選取自然群體或育種圃單株為材料，分別提取其DNA，然后以引物對WILD-F、WILD-R以及CACTA-INS-F、CACTA-INS-R所示的引物序列為引物分別進行PCR擴增，再分別對擴增產(chǎn)物進行電泳分離分析；并結合乙烯測定進一步確定含有隱性基因hd的品種，備用；(2)將步驟(1)得到的基因型為hdhd的SH肉質(zhì)桃品種與基因型為Hdhd的非SH肉質(zhì)品種進行雜交，得到后代F1；(3)提取步驟(2)得到的后代F1單株的DNA，以引物對WILD-F、WILD-R以及CACTA-INS-F、CACTA-INS-R所示的引物序列為引物分別進行PCR擴增，擴增后分別測序，將兩對引物的PCR擴增產(chǎn)物分別進行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠經(jīng)染色后在凝膠掃描儀中檢測擴增條帶，根據(jù)兩次電泳得到的帶型來確定樣本的基因型；并結合乙烯測定，選擇基因型為hdhd的SH肉質(zhì)桃品種單株，即得到所述的SH肉質(zhì)桃品種。所述的采用輔助選擇含有隱性單基因hd桃品種的分子標記選育SH肉質(zhì)桃品種的方法，其特征在于，所述的以引物對WILD-F、WILD-R以及CACTA-INS-F、CACTA-INS-R進行PCR擴增的步驟為：用正向引物WILD-F與反向引物WILD-R檢測野生型基因是否發(fā)生突變；并利用正向引物CACTA-INS-F與反向引物CACTA-INS-R檢測突變型基因是否有CACTA轉座子插入；反應體系為20μl：10μmol·L-1上下游引物各1μl，10×PCRBufferforKOD2μl，KOD-Plus-Neo(1U/μl)0.5μl，2mMdNTPs2μl，25mMMgSO41.5μl，(50ng/μl)的DNA模板2μl以及ddH2O10μl；反應程序為：95℃變性2min；35個循環(huán)95℃30s，56℃30s，68℃2min；擴增完成后在4℃條件下保存，備用。采用上述輔助選擇含有隱性單基因hd桃品種的分子標記選育SH肉質(zhì)桃品種的方法，該方法包括以下步驟：(1)選取以自然群體或育種圃單株為材料，分別提取其DNA，以引物對WILD-F、WILD-R以及CACTA-INS-F、CACTA-INS-R所示的引物序列為引物分別進行PCR擴增，然后分別進行電泳分離分析；并結合乙烯測定進一步確定含有隱性基因hd的品種，備用；(2)將步驟(1)得到的基因型為hdhd的SH肉質(zhì)桃品種與基因型為HdHd的非SH肉質(zhì)桃優(yōu)質(zhì)桃品種進行雜交，得到后代F1；(3)以步驟(2)得到的后代F1作親本，與基因型為hdhd的SH肉質(zhì)桃品種進行雜交，得到后代F2；(4)提取步驟(3)得到的后代F2單株的DNA，以引物對WILD-F、WILD-R以及CACTA-INS-F、CACTA-INS-R所示的引物序列為引物分別進行PCR擴增，擴增后分別進行測序，將兩對引物的PCR擴增產(chǎn)物分別進行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠經(jīng)染色后在凝膠掃描儀中檢測擴增條帶，根據(jù)兩次電泳得到的帶型來確定樣本的基因型；并結合乙烯測定，選擇基因型為hdhd的SH肉質(zhì)桃品種單株，即得到所述的SH肉質(zhì)桃品種。所述的采用輔助選擇含有隱性單基因hd桃品種的分子標記選育SH肉質(zhì)桃品種的方法，其特征在于，所述的以引物對WILD-F、WILD-R以及CACTA-INS-F、CACTA-INS-R進行PCR擴增的步驟為：用正向引物WILD-F與反向引物WILD-R檢測野生型基因是否發(fā)生突變；并利用正向引物CACTA-INS-F與反向引物CACTA-INS-R檢測突變型基因是否有CACTA轉座子插入；反應體系為20μl：10μmol·L-1上下游引物各1μl，10×PCRBufferforKOD2μl，KOD-Plus-Neo(1U/μl)0.5μl，2mMdNTPs2μl，25mMMgSO41.5μl，(50ng/μl)的DNA模板2μl以及ddH2O10μl；反應程序為：95℃變性2min；35個循環(huán)95℃30s，56℃30s，68℃2min；擴增完成后在4℃條件下保存，備用。以上所述的乙烯測定，包括以下步驟：(1)取待測桃成熟期果實，置于密閉的4.0L的干燥器中，在室溫下放置2h；然后用排水法將樣品氣體收集在密閉的小瓶中待測定；(2)采用氣相色譜儀對待測定的樣品氣體進行測定，將氣相色譜測定所得的峰面積與收集樣品氣體中乙烯含量制作標準曲線，如圖4所示；(3)標準曲線制作完成后，采用氣相色譜儀對不同品種的成熟期桃果實進行檢測，每個試樣采用氣相色譜重復3次檢測，并求取峰面積平均值，然后根據(jù)標準曲線得到相應的樣品氣體中乙烯的含量；并由以下公式計算乙烯釋放速率：乙烯釋放速率(nL·g-1·h-1)＝c×V×m-1×t-1式中，c表示氣相色譜測定后根據(jù)標準曲線得到的樣品氣體中乙烯含量(nL·L-1)，V表示干燥器密閉空間的容積(L)，t表示待測成熟期桃子在密閉容器中的放置時間(h)，m表示測試果實質(zhì)量(g)。本發(fā)明通過探究得到，在SH型肉質(zhì)桃中基因PpYUC11的啟動子上游2.2kb的區(qū)域存在一個CACTA型轉座子的插入，導致這個基因在果實中不能正常表達，因此在果實成熟期不能合成生長素，而目前桃果實的成熟軟化需要依賴于生長素的乙烯釋放。因此，SH型肉質(zhì)桃的形成是由于CACTA型轉座子插入到PpYUC11基因的啟動子區(qū)域，本發(fā)明通過鑒定該基因啟動子區(qū)域內(nèi)是否有轉座子插入最終鑒定SH型肉質(zhì)桃。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下積極有益效果(1)、本發(fā)明提供一種SH桃果實肉質(zhì)分子標記在桃PpYUC11基因位點的變異特異引物和無變異特異引物；利用該分子標記進行基因分型及乙烯含量驗證表明，PCR分型結果與基因型對應的乙烯含量變化一致，可以作為SH性狀選擇的輔助標記。(2)、本發(fā)明針對PpYUC11的CACTA轉座子插入突變位點開發(fā)的普通PCR分子標記，方法簡單，成本低，結果穩(wěn)定；與定量PCR方法、酶切方法相比，操作更加便捷；不用熒光染料及限制性酶切，檢測成本低；通過對來自多個國家的自然群體的驗證結果，普通PCR條件可重復實驗，且結果穩(wěn)定。(3)、利用本發(fā)明的分子標記進行常規(guī)雜交育種，為輔助選擇SH肉質(zhì)桃育種提供了新的技術手段，可顯著提高性狀選擇的準確性，降低育種成本，提高育種效率。之前關于SH肉質(zhì)桃的判定主要體現(xiàn)在果實成熟期乙烯釋放的測定，所以傳統(tǒng)的SH肉質(zhì)型桃育種需等待桃樹結果才能判定是否屬于SH肉質(zhì)類型，從而進行SH肉質(zhì)性狀的選擇。然而桃樹是多年生果樹，因此通過分子標記輔助選擇在苗期便可以快速鑒定桃的肉質(zhì)類型，從而縮短育種年限，同時可以通過標記鑒定非SH肉質(zhì)類型是否含有隱性hd單基因。本發(fā)明通過有針對性、特異性的選擇含有隱性單基因hd基因的后代材料，然后高效選擇桃SH肉質(zhì)新品種；利用DNA分子標記CACTA-INS-F和CACTA-INS-R以及WILD-F和WILD-R對控制桃果實SH肉質(zhì)的主效基因PpYUC11進行分子標記輔助選擇，并結合資源圃的自然群體和育種圃的雜交后代群體的性狀選擇、乙烯測定，以提高選育桃果實SH肉質(zhì)新品種的效率。附圖說明圖1為基因PpYUC11在桃染色體上的定位，以及序列多態(tài)性的分布和轉座子插入所示位置；A.圖中圓圈表示預測的第六條染色體著絲粒的位置，PpYUC11在第六條染色體的位置在著絲粒附近；B.PpYUC11在SH肉質(zhì)和非SH肉質(zhì)之間的12處序列多態(tài)性分布，上游啟動子區(qū)域存在一個轉座子插入；C.轉座子插入類型為CACTA型，插入片段包含2539bp，PrimerWILD-F和PrimerWILD-R以及PrimerCACTA-INS-F和PrimerCACTA-INS-R表示轉座子插入的分子標記引物；圖2為利用無變異特征(即在主效位點基因PpYUC11處無轉座子插入)分子標記WILD-F和WILD-R對挑選出的32個桃SH肉質(zhì)和非SH肉質(zhì)品種的擴增產(chǎn)物的瓊脂凝膠電泳圖，M：2000bp分子量標記；所述的32個桃品種為：1.NJC19；2.NJC47；3.NJC77；4.NJC83；5.NJC105；6.NJC112；7.五月火；8.春雪；9.春時；10.岡山白桃；11.大和早生；12.興津油桃；13.白鳳；14.大久保；15.東王母；16.倉方早生；17.布目早生；18.上海水蜜；19.黃金蜜1號；20.深州水蜜；21.杭州早水蜜；22.貴州水蜜；23.黃金蜜3號；24.中油桃13號；25.寒公主；26.春蜜；27.中油桃16號；28.有明；29.秦王；30.京玉；31.華玉；32.霞脆；其中1-26為非SH肉質(zhì)品種；27-32為SH肉質(zhì)品種。圖2結果說明：27-32所示帶型(N50)為純合hd型，1-26所示帶型(N20)表示至少含有一個Hd基因。圖3為利用含有變異特征(即在主效位點基因PpYUC11處有轉座子插入)分子標記CACTA-INS-F和CACTA-INS-R對32個桃SH肉質(zhì)和非SH肉質(zhì)品種的擴增產(chǎn)物的瓊脂電泳圖，M：2000bp分子量標記，圖上所示的條帶為750bp；圖3測試所用的32個桃品種為圖2測試所用的桃品種；圖3的測試結果表明：10，12，14，23，25，27，28，29，30，31，32所示帶型(L50)至少含有一個hd隱性基因，沒有條帶的表示不含有hd隱性基因；圖4為氣相色譜測定成熟期桃果實樣品氣體所得峰面積與樣品氣體中乙烯含量的標準曲線圖。具體實施方式下面通過具體實施方式對本發(fā)明進行更加詳細的說明，但是并不用于限制本發(fā)明的保護范圍。實施例1一種輔助選擇含有隱性單基因hd桃品種的分子標記，1.PpYUC11位點無變異特征引物(檢測無CACTA轉座子插入)：在桃PpYUC11野生型基因ATG上游1593bp處設計正向引物WILD-F，ATG上游2515bp處設計反向引物WILD-R，如果存在位點變異，將擴增出3514bp條帶，如果不存在位點變異，將擴增出942bp的預期條帶，所用的引物如下：正向引物WILD-F引物序列為5’-ACATCAAACGGCAATCAATA-3’，反向引物WILD-R引物序列為5’-TTAGCCACGAAGGTTACTCA-3’；2.PpYUC11位點包含有變異特征引物(檢測CACTA轉座子插入，桃PpYUC11突變型基因在起始密碼子ATG上游2142bp處存在CACTA轉座子插入)：在桃PpYUC11突變型基因ATG上游2236bp處設計正向引物CACTA-INS-F，在CACTA轉座子插入序列的上游152bp處設計反向引物CACTA-INS-R，以檢測CACTA轉座子插入；如果存在位點變異，將擴增出262bp的預期條帶；如果沒有位點變異，將擴增不出任何條帶，所用的引物如下：正向引物CACTA-INS-F引物序列為5’-CTTTGACTAGGATAACAC-3’，反向引物CACTA-INS-R引物序列為5’-AATGGCATGGACAACGA-3’。CACTA轉座子屬于第二類轉座子，即DNA型轉座子，它們的末端反向重復序列的前5個堿基均為CACTA。所述不同PpYUC11基因型的分子標記帶型，參見表1。表1基因型與帶型參照表PpYUC11基因型帶型CACTA-INS-F/CACTA-INS-RWILD-F/WILD-RHdHdI×√(N20)HdhdП√(L50)×hdhdШ√(L50)√(N50)從表1基因型與帶型參照表可以得出如下結論：采用分子標記WILD-F和WILD-R以及CACTA-INS-F和CACTA-INS-R對不同PpYUC11基因型進行PCR擴增。HdHd基因型只有一條野生帶型(N20)；Hdhd基因型僅一條帶型(L50)；hdhd基因型具有兩條帶型(L50，N50)。實施例2利用實施例1所述輔助選擇含有隱性單基因hd桃品種的分子標記選育SH肉質(zhì)桃品種的方法之一，該包含以下步驟：(1)選擇自然群體為材料，提取其DNA，然后以引物對WILD-F和WILD-R以及CACTA-INS-F和CACTA-INS-R所示的引物序列為引物分別進行PCR擴增，并對擴增產(chǎn)物分別進行電泳分離分析，擴增結果帶型如圖2、3所示；從圖2可得，以WILD-F和WILD-R為引物對擴增出N50條帶的品種有‘中油桃16號’、‘yumyeong’、‘秦王’、‘京玉’、‘華玉’、‘霞脆’，其他均擴增出N20條帶；從圖3可得，以CACTA-INS-F和CACTA-INS-R為引物對擴增出L50條帶的有‘岡山白桃’、‘興津油桃’、‘大久?！?、‘黃金蜜3號’、‘寒公主’、‘中油桃16號’、‘yumyeong’、‘秦王’、‘京玉’、‘華玉’、‘霞脆’。圖中結果表明‘中油桃16號’、‘yumyeong’、‘秦王’、‘京玉’、‘華玉’、‘霞脆’的PpYUC11位點基因型是hdhd，為SH肉質(zhì)；‘岡山白桃’、‘興津油桃’、‘大久?！?、‘黃金蜜3號’和‘寒公主’的PpYUC11位點基因型是Hdhd，其他品種的PpYUC11位點基因型是HdHd(如表2所示)；然后用乙烯測定進一步測定，以進一步確定SH肉質(zhì)桃品種，備用；(2)將步驟(1)得到的基因型為hdhd的SH肉質(zhì)桃品種與基因型為Hdhd的非SH肉質(zhì)桃品種進行雜交，得到后代F1；(3)提取步驟(2)所述后代F1單株的DNA，以引物對WILD-F和WILD-R以及CACTA-INS-F和CACTA-INS-R所示的引物序列為引物分別進行PCR擴增，對擴增產(chǎn)物分別進行電泳分離分析；(4)對步驟(3)已經(jīng)進行電泳分離分析的PCR擴增產(chǎn)物，根據(jù)擴增條帶類型選擇基因型為hdhd的SH肉質(zhì)桃品種單株，即得到所述的SH肉質(zhì)桃品種。步驟(1)所述的自然群體材料包括有：NJC19；NJC47；NJC77；NJC83；NJC105；NJC112；五月火；春雪；春時；岡山白桃；大和早生；興津油桃；白鳳；大久保；東王母；倉方早生；布目早生；上海水蜜；黃金蜜1號；深州水蜜；杭州早水蜜；貴州水蜜；黃金蜜3號；中油桃13號；寒公主；春蜜；中油桃16號；有明；秦王；京玉；華玉；霞脆；步驟(1)所述提取DNA包括以下步驟：a.取用硅膠干燥之后的葉片1片放入研缽中，加入少量非溶性PVP在液氮下迅速研磨成粉末，并將粉末立即裝入2ml離心管1中，備用；b.在步驟a所述裝有粉末的離心管1中加入1ml已經(jīng)預熱至65℃、質(zhì)量體積濃度為2％的CTAB裂解液充分混勻，然后將離心管1放入65℃的恒溫水浴鍋中保溫1小時，在保溫過程中每隔10min輕柔顛倒震蕩1次；c.步驟b所述離心管1水浴保溫之后，在離心管1中加入體積比為24：1的氯仿與異戊醇的混合液至滿管，輕輕震蕩10min使之充分混勻，然后在4℃條件下、以10000r/min的轉速離心10min，靜置，取上清液于另一離心管2中；對離心管1中的沉淀重復上述步驟再次加入上述的氯仿與異戊醇混合液進行離心、沉淀，取上清液于離心管2中；d.在步驟c所述的離心管2中加入濃度為3mol/l已預冷至-20℃的NaAc，混合均勻，所述NaAc溶液的加入量為離心管2中上清液總體積的1/10；然后再加入已在冰箱中預冷至-20℃的無水乙醇(加入的無水乙醇與離心管2中的上清液等體積)混勻，將離心管2置于-20℃的冰箱中靜置沉淀過夜，靜置沉淀完成后取出離心管2在4℃條件下、以10000r/min的轉速離心10min，棄去上清液，得到DNA沉淀；e.用75％的乙醇洗滌步驟d所得到的的DNA沉淀2次，再用無水乙醇洗滌1次，晾干；晾干之后加入100μl的二次蒸餾水進行溶解，然后再加入1μl濃度為1g/100ml的的RNA水解酶，加入完成后置于-20℃冰箱中，以備檢測使用。所述的PCR擴增具體如下：反應體系為20μl：10μmol·L-1上下游引物各1μl，10×PCRBufferforKOD2μl，KOD-Plus-Neo(1U/μl)0.5μl，2mMdNTPs2μl，25mMMgSO41.5μl，(50ng/μl)的DNA模板2μl以及ddH2O10μl；反應程序為：95℃預變性2min；35個循環(huán)95℃30s，56℃30s，68℃2min；擴增完成后在4℃條件下保存。所述的電泳分離分析，包括以下步驟：a.配制膠溶液(1％)：瓊脂糖0.5g/100ml，5×TAE10ml，雙蒸餾水45ml；將上述混合溶液倒入錐形瓶中、并放置在微波爐中加熱煮沸；然后冷卻至65℃，加入溴化乙錠、搖勻，搖勻之后倒入模具中，插上梳子，放于室溫下自然凝固30min；b.點樣：在膠孔中加入已混入上樣緩沖液的PCR擴增產(chǎn)物6μl(所述6μl混合物中，體積比擴增產(chǎn)物：上樣產(chǎn)物＝5:1)，調(diào)節(jié)電壓為120V，電泳20～30min左右；c.拍照：將凝膠放入凝膠成像系統(tǒng)中，按照“凝膠成像系統(tǒng)操作規(guī)程”進行操作拍照。實施例3利用實施例1所述輔助選擇含有隱性單基因hd桃品種的分子標記選育SH肉質(zhì)桃品種的方法之二，該方法包含以下步驟：(1)選擇自然群體為材料，提取其DNA，然后以引物對WILD-F和WILD-R以及CACTA-INS-F和CACTA-INS-R所示的引物序列為引物分別進行PCR擴增，并對擴增產(chǎn)物分別進行電泳分離分析，擴增結果帶型如圖2、圖3所示；從圖2中可得，以WILD-F和WILD-R為引物對擴增出N50條帶的品種有‘中油桃16號’、‘yumyeong’、‘秦王’、‘京玉’、‘華玉’、‘霞脆’，其他的均擴增出N20條帶；從圖3可得，以CACTA-INS-F和CACTA-INS-R為引物對擴增出的L50條帶有‘岡山白桃’、‘興津油桃’、‘太久?！?、‘黃金蜜3號’、‘寒公主’、‘中油桃16號’、‘yumyeong’、‘秦王’、‘京玉’、‘華玉’、‘霞脆’；圖中結果表明，‘中油桃16號’、‘yumyeong’、‘秦王’、‘京玉’、‘華玉’、‘霞脆’的PpYUC11位點基因型是hdhd，為SH肉質(zhì)；‘岡山白桃’、‘興津油桃’、‘太保久’、‘黃金蜜3號’和‘寒公主’的PpYUC11位點基因型是Hdhd，其他品種的PpYUC11位點基因型是HdHd，如表2所示；然后用乙烯測定進一步測定，以進一步確定SH肉質(zhì)品種，備用；(2)將步驟(1)得到的基因型為hdhd的SH肉質(zhì)桃品種與基因型為HdHd的非SH肉質(zhì)桃優(yōu)質(zhì)桃品種進行雜交，得到后代F1；(3)以步驟(2)得到的F1代作為親本，與基因型為hdhd的SH肉質(zhì)桃品種進行回交，得到F2代；(4)提取步驟(3)得到的后代F2單株的DNA，以以引物對WILD-F和WILD-R以及CACTA-INS-F和CACTA-INS-R所示的引物序列為引物分別進行PCR擴增，擴增后分別進行測序，分別將兩對引物的PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠經(jīng)染色后在凝膠掃描儀中檢測擴增條帶，根據(jù)兩次電泳得到的帶型來確定樣本的基因型；然后結合乙烯測定，選擇基因型為hdhd的SH肉質(zhì)桃品種單株，即得到所述的SH肉質(zhì)桃品種。步驟(1)所述的自然群體材料包括有NJC19；NJC47；NJC77；NJC83；NJC105；NJC112；五月火；春雪；春時；岡山白桃；大和早生；興津油桃；白鳳；大久保；東王母；倉方早生；布目早生；上海水蜜；黃金蜜1號；深州水蜜；杭州早水蜜；貴州水蜜；黃金蜜3號；中油桃13號；寒公主；春蜜；中油桃16號；有明；秦王；京玉；華玉；霞脆；步驟(1)所述提取DNA包括以下步驟：a.取用硅膠干燥之后的葉片1片放入研體中，加入少量非溶性PVP在液氮下迅速研磨成粉末，并將粉末立即裝入2ml離心管1中，備用；b.在步驟a所述裝有粉末的離心管1中加入1ml已經(jīng)預熱至65℃、質(zhì)量體積濃度為2％的CTAB裂解液充分混勻，然后將離心管1放入65℃恒溫水浴鍋中保溫1小時，在保溫過程中每隔10min輕柔震蕩一次；c.在步驟b所述離心管1水浴保溫之后，在離心管1中加入體積比為24：1的氯仿與異戊醇的混合液至滿管，輕輕震蕩10min使之充分混勻，然后在4℃條件下、以10000r/min的轉速離心10min，靜置，取上清液于另一離心管2中；對離心管1中的沉淀重復上述步驟再次加入上述的氯仿與異戊醇混合液進行離心、沉淀，并取上清液于離心管2中；d.在步驟c所述已裝有上清液的離心管2中加入濃度為3mol/l已預冷至-20℃的NaAc，混合均勻，所述NaAc溶液的加入量為離心管2中上清液總體積的1/10；然后再加入已在冰箱中預冷至-20℃的無水乙醇(加入的無水乙醇與離心管2中的上清液等體積)混勻，然后將離心管2置于-20℃的冰箱中靜置沉淀過夜，靜置沉淀完成后取出離心管2在4℃條件下、以10000r/min的轉速離心10min，棄去上清液，得到DNA沉淀；e.用75％的乙醇洗滌步驟d所述的DNA沉淀2次，再用無水乙醇洗滌1次，晾干；晾干之后加入100μl的二次蒸餾水進行溶解，然后再加入1μl濃度為1g/100ml的RNA水解酶，加入完成后置于-20℃冰箱中，以備檢測使用。所述的PCR擴增，具體如下：反應體系為20μl：10μmol·L-1上下游引物各1μl，10×PCRBufferforKOD2μl，KOD-Plus-Neo(1U/μl)0.5μl，2mMdNTPs2μl，25mMMgSO41.5μl，(50ng/μl)的DNA模板2μl以及ddH2O10μl；反應程序為：95℃預變性2min；35個循環(huán)95℃30s，56℃30s，68℃2min；擴增完成后在4℃條件下保存。所述的電泳分離分析，包括以下步驟：a.配制凝膠溶液(1％)：瓊脂糖0.5g/100ml，5×TAE10ml，雙蒸餾水45ml；將上述混合溶液倒入錐形瓶中、并放置在微波爐中加熱煮沸；然后冷卻至65℃，加入溴化乙錠、搖勻，搖勻之后倒入模具中，插上梳子，放于室溫下自然凝固30min；b.點樣：在膠孔中加入已混入上樣緩沖液的PCR擴增產(chǎn)物6μl(所述6μl混合液中物質(zhì)的體積比為，擴增產(chǎn)物：上樣產(chǎn)物＝5:1)，調(diào)節(jié)電壓為120V，電泳20～30min；c.拍照：將凝膠放入凝膠成像系統(tǒng)中，按照“凝膠成像系統(tǒng)操作規(guī)程”進行操作拍照。實施例4對上述32種桃品種進行乙烯測定，包括有以下步驟：該過程中采用日本島津GC-2010型氣相色譜儀對待測樣品進行測定。氣相色譜的工作條件為：色譜柱Rtx-1701(30m×0.32mm)，柱溫為80℃，載氣為氮氣，檢測器(FID)溫度130℃；進樣口溫度為120℃，氫氣流速為40mL·min-1，空氣流量400mL·min-1、壓力為100Kpa，尾吹氣流30mL·min-1；柱流量1.19mL·min-1，進樣體積400μL，分流比5.0。(1)取1070g中油桃13號桃成熟期果實，置于密閉的4.0L的干燥器中，在室溫下放置2h，然后用排水法將樣品氣體收集在密閉的小瓶中等待測定；(2)將步驟(1)中的待測試樣采用氣相色譜重復3次檢測，并求取其平均值，并根據(jù)圖4所示的標準曲線將對應的檢測峰面積轉化為樣品氣體中乙烯含量，如表2所示；表2中油桃13號釋放氣體中乙烯含量測定結果重復123均值峰面積385397.6407396.5乙烯濃度(nL/L)1733.7179818461792.5(3)然后根據(jù)步驟(2)中的測試結果及下面公式計算中油桃13號的乙烯釋放速率；乙烯釋放速率(nL·g-1·h-1)＝c×V×m-1×t-1式中，c表示氣相色譜測定后根據(jù)標準曲線得到的樣品氣體中乙烯含量(nL·L-1)，V表示干燥器密閉空間的容積(L)，t表示待測成熟期桃子在密閉容器中的放置時間(h)，m表示測試果實質(zhì)量(g)；由上述公式可得：檢測中油桃13號的乙烯釋放速率為1792.5(nL·L-1)×4L×1070-1g×2-1h＝3.35nL·g-1·h-1用同樣的方法對‘yumyeong’、‘秦王’、‘京玉’、‘華玉’、‘霞脆’等進行檢測，成熟后的乙烯釋放速率如表3所示：其中，乙烯釋放速率小于0.5nL·g-1·h-1的品種為SH類型，乙烯釋放速率大于0.5nL·g-1·h-1的品種為非SH類型，檢測類型結果如表3所示；表3不同PpYUC11位點基因型桃品種的檢測結果SEQUENCELISTING<110>中國農(nóng)業(yè)科學院鄭州果樹研究所<120>輔助選擇含有隱性單基因hd桃品種的分子標記及其選育方法和應用<130>A<160>4<170>PatentInversion3.5<210>1<211>20<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>分子標記<400>1acatcaaacggcaatcaata20<210>2<211>20<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>分子標記<400>2ttagccacgaaggttactca20<210>3<211>18<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>分子標記<400>3ctttgactaggataacac18<210>4<211>17<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>分子標記<400>4aatggcatggacaacga17當前第1頁1 2 3