本發(fā)明屬于基因診斷制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測紅細胞RhD陰性血型的SNP標記。
發(fā)明背景
Rh血型系統(tǒng)(Rhesus monkeys)是由著名科學家、諾貝爾獎得主Karl Landsteiner率先從恒河猴的紅細胞上發(fā)現(xiàn)，故因此得名。Rh血型系統(tǒng)是目前人類36個血型系統(tǒng)中最復雜的，其重要性僅次于ABO系統(tǒng)，在臨床輸血、新生兒溶血病的診治中占有重要地位。Rh血型系統(tǒng)中D抗原是免疫原性最強、多態(tài)性最復雜的。對于中國大陸的漢族人來講，RhD陰性人群只占千分之三左右，由于十分罕見，故又名熊貓血。由于RhD的強抗原性，導致RhD陰性者不能接受RhD陽性血液，因為RhD抗原將刺激RhD陰性人體產(chǎn)生抗-RhD抗體。如果再次輸入RhD陽性血液，即可導致溶血性輸血反應(yīng)。同樣，若RhD陰性婦女由于妊娠或輸血刺激體內(nèi)產(chǎn)生抗-RhD抗體，再次懷孕則會導致新生兒溶血病的發(fā)生。
RhD血型系統(tǒng)而除了正常的RhD陽性、陰性外，還存在許多變異型，包括弱D(weak D)、部分D(partial D)及DEL型(放散型)。這些變異型的紅細胞表面存在不完全的、或者變異的RhD抗原，若輸注給陰性個體也有可能刺激產(chǎn)生抗體，因此這些變異型的個體有兩個主要特點：一是他們作為受血者和獻血者是不同的兩種處理，作為受血者，他們只能輸入RhD陰性血液；而作為獻血者，他們的血液只能作為RhD陽性血使用。二是容易漏檢，由于RhD抗原的變異，導致在常規(guī)的血型血清學檢測時常規(guī)抗體無法與之反應(yīng)，故易錯判為RhD陰性，由于目前沒有特別有效的清除不規(guī)則抗體的措施，所以這對于需多次輸血的患者、妊娠期婦女來說危害十分巨大。因此準確的定型是確保正確輸注的前提。目前血型的常規(guī)檢測方法是血清學實驗，但這個實驗受多種限制，比如樣本的質(zhì)量、自身抗體或不規(guī)則抗體的干擾、疾病的影響等，同時對于DEL型這種只能通過吸收放散試驗才能檢測到的類別更是無法判斷，這就需要利用分子生物學的方法在基因水平進行診斷。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測RhD陰性血型的SNP標記，可以準確的對紅細胞RhD陰性血型進行確證，從而彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足。
本發(fā)明提供一種與RhD陰性血型相關(guān)的SNP標記，包含有：
第一SNP標記，是RHD基因編碼區(qū)域由起始密碼子起第208位堿基發(fā)生了突變，由C突變?yōu)門；
第二SNP標記，是RHD基因編碼區(qū)域由起始密碼子起第211位堿基發(fā)生插入了G，導致后續(xù)移碼突變。
本發(fā)明的另一個方面提供上述SNP標記的應(yīng)用，是在制備檢測紅細胞RhD陰性血型的制品中的應(yīng)用；
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，是提供上述SNP標記在檢測紅細胞RhD陰性血型中的應(yīng)用。
上述的測定方法，是通過能擴增上述SNP標記的引物對待檢測的血樣DNA進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物進行測序后進行基因型分析，確定待檢樣品是否存在上述的SNP標記。
上述方法中所使用的引物對，根據(jù)實施例的優(yōu)選，其引物的序列信息如下：
RHD-2F:5’-TCCCCCTCGTCCTTCTCG-3’(SEQ ID NO:1)
RHD-2R:5’-CAGGATGCCCAGTTAATTTGAAT-3’(SEQ ID NO:2)。
其中SEQ ID NO：2同時為測序引物。
本發(fā)明通過檢測篩選獲得的SNP位點，從而提供了一種有效的進行RhD血型基因診斷途徑，應(yīng)用效果表明本發(fā)明所提供的SNP位點及檢測引物可以有效的用于臨床患者及血站獻血員進行RHD基因的快速檢測。
附圖說明
圖1：實施例1的RhD陰性表型RHD基因測序圖，其中A：先證者父親，正常RhD陽性表型，攜帶RHD全缺失基因；B：先證者母親，正常RhD陽性表型，攜帶突變基因；C：先證者，RhD陰性表型。該家系中兩名RHD基因編碼區(qū)域由起始密碼子起第208位堿基發(fā)生了突變，由C突變?yōu)門，第211位堿基發(fā)生插入突變，插入G，導致后續(xù)移碼突變。
具體實施方式
申請人從226例血清學檢測為RhD陰性或變異型個體進行RHD基因測序，發(fā)現(xiàn)了一例新的SNP突變導致RhD陰性，從而促成了本發(fā)明。
RH基因位于染色體1p34.3-1p36.1區(qū)域，可轉(zhuǎn)錄成2837bp的mRNA(NCBI登錄號為NM_016124.4)，最終翻譯形成417個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。由RHD基因(編碼RhD抗原)和RHCE基因(編碼RHC、c、E和e抗原)緊密串聯(lián)排列組成。RHD基因和RHCE基因結(jié)構(gòu)高度同源，均由10個外顯子和9個內(nèi)含子組成，其中兩者的第8外顯子完全相同，差異較大的是外顯子3、4、5、7、9和內(nèi)含子4。因此采用分子生物學的手段，建立RHD基因檢測系統(tǒng)，并應(yīng)用于臨床和采供血工作當中，有助于RhD陰性個體的準確檢出，有助于降低受血者不規(guī)則抗體的產(chǎn)生，有助于產(chǎn)前不規(guī)則抗體的預(yù)防和監(jiān)測，有助于降低新生兒溶血病的發(fā)生。
對于本發(fā)明所涉及SNP標記，申請人解釋如下：
SNP(single nucleotide polymorphism，SNP，即單核苷酸多態(tài)性)是指基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。SNP表現(xiàn)出的多態(tài)性僅涉及到單個堿基的變異，表現(xiàn)是有轉(zhuǎn)換、顛換、插入和缺失等。
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進行詳細的描述。
實施例1：SNP標記的篩選
1、提取外周血基因組DNA：
在符合國家相關(guān)政策規(guī)定，并在取樣對象同意的基礎(chǔ)上，抽取RhD陰性或變異型獻血員外周靜脈血2-5mL，放入EDTA抗凝管內(nèi)，-80℃凍存?zhèn)溆?；凍存的EDTA抗凝血在室溫融化后，取500μL放于離心管，加入等體積TE(pH8.0)，混勻，4℃，10000rpm離心10分鐘，棄上清。
加入180μL TE、20μLSDS(10％)、8μL蛋白酶K(l0mg/ml)混勻，置于37℃水浴過夜。從水浴中取出樣品，瞬時離心沉淀樣本。在反應(yīng)管中加入等體積的Tris-飽和酚(約300μL)，充分混勻，室溫下10000rpm離心10分鐘，吸取上清液(約300μL)至一新離心管中。重復酚抽提一次，吸取上清液至一新離心管中。
加入等體積的Tris飽和酚:氯仿混合液(酚、氯仿各150μL)，混勻，室溫10000rpm離心10分鐘，轉(zhuǎn)移上清液至一新離心管。
加入等體積的Tris飽和酚:氯仿:異戊醇混合液(酚、氯仿、異戊醇各100μL)，混勻，室溫10000rpm離心10分鐘，轉(zhuǎn)移上清液至一新離心管。
加入l/10體積3mol/L、pH5.2醋酸鈉(約30μL)，2倍體積預(yù)冷100％乙醇，輕輕混合，可見白色絮狀沉淀。室溫10000rpm離心10分鐘，使DNA沉淀于管底，棄上清。
向DNA沉淀加入70％乙醇，漂洗一次，室溫7000rpm離心5分鐘，棄上清，置于室溫中揮發(fā)剩余乙醇，最后加入50μL TE(pH8.0)，4℃過夜溶解DNA。
對提取的DNA行瓊脂糖膠電泳，并應(yīng)用紫外分光光度計在260nm和280nm比色，檢測DNA純度及濃度。
2、直接測序法尋找該獻血員RHD基因的突變
PCR擴增目的片段：反應(yīng)條件與反應(yīng)體系：
(1)PCR反應(yīng)條件：95℃5m；95℃30s，58℃30s，72℃60s，35cycles；72℃5m。
(2)反應(yīng)體系：(Onelambda公司Fast startTaq polymerase)
應(yīng)用該反應(yīng)體系分別進行每位RhD陰性獻血員的基因組DNA模板與該RhD引物的擴增反應(yīng)。
PCR產(chǎn)物測序：應(yīng)用常規(guī)Sanger測序法對上述PCR產(chǎn)物進行測序，SEQ ID NO：2：5’-CAGGATGCCCAGTTAATTTGAAT-3’，在該RhD陰性獻血員RHD基因第二外顯子處發(fā)現(xiàn)兩處突變，第208位堿基C突變?yōu)門，第211位堿基發(fā)生G插入突變(圖1C)，從而導致后續(xù)移碼突變，475-477位堿基編碼為TAA終止密碼，第二外顯子只翻譯出159個氨基酸，并且導致后續(xù)8個外顯子均無法翻譯為蛋白，RhD蛋白翻譯提前終止，造成RhD陰性血型。多次測序結(jié)果表明此兩處突變位點并不是因為擴增或測序錯誤引進的，應(yīng)為為一新生突變。該突變不存在于下面的四個數(shù)據(jù)庫中：單核苷酸多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/snp/database/)，千人基因組計劃(ftp://ftp-trace.ncbi.nih.gov/1000genomes/ftp/)，Hapmap8數(shù)據(jù)庫(http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)，及炎黃數(shù)據(jù)庫(http://yh.genomics.org.cn/)，表明該突變非常罕見，該突變導致了RhD蛋白長度截短，從而導致RhD陰性。而在200例RhD陽性獻血員的外周血基因組DNA樣本中進行該位點的突變篩查，未發(fā)現(xiàn)該突變。
通過上述的分析，證明該方法可以準確測定RHD基因，從而可以更加精準的確定待測者的RhD血型，對于患者制定輸血政策具有重要意義。
實施例2：對SNP突變先證者的父母進行遺傳驗證
1、提取外周血基因組DNA：
在符合國家相關(guān)政策規(guī)定，并在取樣對象同意的基礎(chǔ)上，抽取RhD陰性或變異型獻血員外周靜脈血2-5mL，放入EDTA抗凝管內(nèi)，-80℃凍存?zhèn)溆?；凍存的EDTA抗凝血在室溫融化后，取500μL放于離心管，加入等體積TE(pH8.0)，混勻，4℃，10000rpm離心10分鐘，棄上清。
加入180μL TE、20μLSDS(10％)、8μL蛋白酶K(l0mg/ml)混勻，置于37℃水浴過夜。從水浴中取出樣品，瞬時離心沉淀樣本。在反應(yīng)管中加入等體積的Tris-飽和酚(約300μL)，充分混勻，室溫下10000rpm離心10分鐘，吸取上清液(約300μL)至一新離心管中。重復酚抽提一次，吸取上清液至一新離心管中。
加入等體積的Tris飽和酚:氯仿混合液(酚、氯仿各150μL)，混勻，室溫10000rpm離心10分鐘，轉(zhuǎn)移上清液至一新離心管。
加入等體積的Tris飽和酚:氯仿:異戊醇混合液(酚、氯仿、異戊醇各100μL)，混勻，室溫10000rpm離心10分鐘，轉(zhuǎn)移上清液至一新離心管。
加入l/10體積3mol/L、pH5.2醋酸鈉(約30μL)，2倍體積預(yù)冷100％乙醇，輕輕混合，可見白色絮狀沉淀。室溫10000rpm離心10分鐘，使DNA沉淀于管底，棄上清。
向DNA沉淀加入70％乙醇，漂洗一次，室溫7000rpm離心5分鐘，棄上清，置于室溫中揮發(fā)剩余乙醇，最后加入50μL TE(pH8.0)，4℃過夜溶解DNA。
對提取的DNA行瓊脂糖膠電泳，并應(yīng)用紫外分光光度計在260nm和280nm比色，檢測DNA純度及濃度。
2、直接測序法尋找該先證者父母RHD基因第二外顯子的突變
PCR擴增目的片段：反應(yīng)條件與反應(yīng)體系：
(1)PCR反應(yīng)條件：95℃5m；95℃30s，58℃30s，72℃60s，35cycles；72℃5m。
(2)反應(yīng)體系：(Onelambda公司Fast startTaqpolymerase)
應(yīng)用該反應(yīng)體系分別進行先證者父母的基因組DNA模板與擴增引物的擴增反應(yīng)。
PCR產(chǎn)物測序：采用常規(guī)Sanger測序法對上述PCR產(chǎn)物進行測序(圖1)，先證者父親(A)為正常RhD陽性表型，攜帶RHD全缺失基因；先證者母親(B)為正常RhD陽性表型，攜帶突變基因，表現(xiàn)為RHD正?；蚺cSNP突變基因雜合峰；先證者(C)遺傳父親RHD全缺失基因和母親SNP突變基因，顧表現(xiàn)為RhD陰性表型。該突變不存在于下面的四個數(shù)據(jù)庫中：單核苷酸多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/snp/database/)，千人基因組計劃(ftp://ftp-trace.ncbi.nih.gov/1000genomes/ftp/)，Hapmap8數(shù)據(jù)庫(http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)，及炎黃數(shù)據(jù)庫(http://yh.genomics.org.cn/)，表明該突變非常罕見。而在200例RhD陽性獻血員的外周血基因組DNA樣本中進行該位點的突變篩查，未發(fā)現(xiàn)該突變。
上述的實驗結(jié)果表明，該SNP突變位點能夠精準的確定待測者的RhD血型，對于患者制定輸血政策具有重要意義。
SEQUENCE LISTING
<110> 青島市中心血站（青島市公民義務(wù)獻血辦公室青島市輸血醫(yī)學研究所）
<120> 一種用于檢測RhD陰性表型的SNP標記
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 1
<400> 1
tccccctcgt ccttctcg 18
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 2
<400> 2
caggatgccc agttaatttg aat 23