專利名稱：：高靈敏度快速檢測(cè)血吸蟲(chóng)循環(huán)抗原藥盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及的是應(yīng)用血清學(xué)技術(shù)檢測(cè)血吸蟲(chóng)病循環(huán)抗原時(shí)所用的藥盒。在血吸蟲(chóng)病防治工作中，檢測(cè)人體內(nèi)是否有血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)或蟲(chóng)卵代謝物的存在，是診斷、治療和療效考核的重要判斷依據(jù)，運(yùn)用血清學(xué)技術(shù)進(jìn)行檢驗(yàn)是目前的主要檢測(cè)手段。由于人體被感染后，雖經(jīng)治療并已痊愈，其體內(nèi)因此所產(chǎn)生的抗體仍可保留較長(zhǎng)時(shí)間，因而以往對(duì)抗體檢測(cè)的方法和結(jié)果常常不能真實(shí)反映出體內(nèi)是否還存在有活蟲(chóng)及活動(dòng)性感染的程度，也不便準(zhǔn)確判斷和考核治療效果，現(xiàn)已逐漸被可直接反映體內(nèi)有活蟲(chóng)寄生因而更具診斷意義的對(duì)循環(huán)抗原的檢測(cè)所代替。經(jīng)長(zhǎng)期研究，現(xiàn)已了解這些循環(huán)抗原可包括如成蟲(chóng)表膜抗原、腸相關(guān)抗原等由血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)排泄釋放入患者血中的蟲(chóng)源性抗原和由毛蚴分泌物進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)而形成的蟲(chóng)卵源性抗原等幾大類。經(jīng)電泳分析表明它們是由蛋白質(zhì)、多糖和核糖核酸等幾類大分子物質(zhì)的數(shù)十種抗原組分組成的十分復(fù)雜的抗原譜。由于這些循環(huán)抗原在感染患者血清中的濃度一般都很低，加之這眾多的抗原成分在是否具有診斷意義及診斷價(jià)值的大小上又各不相同，因而增加了對(duì)具有病原學(xué)診斷意義和價(jià)值的循環(huán)抗原檢測(cè)工作的困難和難度。在目前的血吸蟲(chóng)病循環(huán)抗原檢測(cè)中，報(bào)道較多的一類是用由不同抗原制備得到的單克降抗體進(jìn)行特異性檢測(cè)的方法。例如，嚴(yán)自助等人曾在《中國(guó)寄生蟲(chóng)學(xué)與寄生蟲(chóng)病雜志》1990.Vol.8(3)中報(bào)道了用腸相關(guān)陰極抗原的單克隆抗體直接法斑點(diǎn)酶聯(lián)試驗(yàn)檢測(cè)的方法;在《上海免疫學(xué)雜志》1991.Vol.11(3)中又報(bào)道了采用循環(huán)蟲(chóng)卵可溶性糖蛋白抗原的單克隆抗體直接法斑點(diǎn)酶聯(lián)試驗(yàn)檢測(cè)循環(huán)蟲(chóng)卵抗原的方法。裘麗姝等人在上述前種雜志的同一期中報(bào)道了采用成蟲(chóng)表膜抗原的單克隆抗體進(jìn)行檢測(cè)的方法。周蕊等人在該雜志1990年的第4期中也報(bào)道了用血吸蟲(chóng)的排泄分泌抗原(S.ESA)制備的單克隆抗體的斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的檢測(cè)方法。雖然這種由某種特定抗原所得到的單克隆抗體對(duì)該種抗原可具有排除其它干擾因素的較高特異選擇性，但由前述內(nèi)容可知，在成分眾多的復(fù)雜抗原譜中，其這種特異性的作用范圍畢竟過(guò)于局限，且所檢出抗原的診斷意義有無(wú)或大小也尚屬待測(cè)。這些存在問(wèn)題有些在上述有關(guān)文獻(xiàn)中也已有所論及。由于在檢測(cè)中對(duì)處于低水平狀態(tài)的循環(huán)抗原檢測(cè)的敏感性不高導(dǎo)致了其在實(shí)際使用中的檢出率和準(zhǔn)確性很難達(dá)到如文獻(xiàn)中所報(bào)道的水平，尤其是對(duì)輕度感染的檢測(cè)影響更為明顯。除此以外，上述文獻(xiàn)報(bào)道的檢測(cè)多采用斑點(diǎn)法，其操作步驟多，要求及控制條件較嚴(yán)格，對(duì)某些偏遠(yuǎn)窮困地區(qū)而言甚至可稱是難以實(shí)現(xiàn)的苛求，而且檢測(cè)所用的時(shí)間長(zhǎng)，材料浪費(fèi)也較大，這些也造成了普遍推廣應(yīng)用中的困難。本申請(qǐng)內(nèi)容的發(fā)明人在《免疫學(xué)雜志》1988.Vol.4(1)中曾報(bào)道過(guò)一種由可同時(shí)針對(duì)蟲(chóng)源性和蟲(chóng)卵源性等多種抗原所制備的多克隆抗體免疫血清，利用生物素-親合素系統(tǒng)(BAS)多級(jí)放大原理的抗原探針進(jìn)行檢測(cè)的方法。雖然就某一特定抗原而言，多克隆抗體在某些方面可能不及單克隆抗體的特異選擇性高，但由于其是經(jīng)專門選擇的動(dòng)物由實(shí)驗(yàn)室制備得到的，而且是可針對(duì)血吸蟲(chóng)病多種循環(huán)抗原，因此其不僅在排除其它寄生蟲(chóng)感染干擾而僅針對(duì)血吸蟲(chóng)抗原上具有必要的特異性，而且對(duì)各種循環(huán)抗原而言的總敏感性和檢出率明顯提高。但由于其檢測(cè)方法仍未能克服斑點(diǎn)法所固有的缺點(diǎn)，例如在為廣泛普及使用所必須的簡(jiǎn)化操作和對(duì)各種簡(jiǎn)陋或惡劣環(huán)境條件的廣泛適應(yīng)性，以及在進(jìn)一步提高檢測(cè)準(zhǔn)確性，尤其是對(duì)低感染度檢測(cè)的敏感性和檢出率等方面都還有著需進(jìn)一步改進(jìn)和完善之處。本發(fā)明的目的正是為進(jìn)一步提高檢測(cè)水平和簡(jiǎn)化操作并可對(duì)各種環(huán)境條件都有廣泛適應(yīng)性而提供一種檢測(cè)血吸蟲(chóng)循環(huán)抗原，尤其是以多克隆抗體為基礎(chǔ)檢測(cè)血吸蟲(chóng)循環(huán)抗原的檢測(cè)工具，即通常所稱的藥盒。本發(fā)明的檢測(cè)藥盒仍包括有應(yīng)相互配合使用的固相載體與檢測(cè)試劑兩部分組成。其中的固相載體以聚氯乙烯(PVC)材料為支承基質(zhì)。由于現(xiàn)在已知PVC材料本身就具有該載體應(yīng)具備的吸附抗循環(huán)抗原抗體的作用，因此所說(shuō)的固相載體可以就采用此材料構(gòu)成的支承基質(zhì)本身。目前除PVC材料外，也有采用如硝酸纖維薄膜或其它適當(dāng)材料形式的固相載體，因此本發(fā)明所說(shuō)的固相載體除上述形式外，也可以為在PVC基質(zhì)材料表面以各種形式被覆有其它適當(dāng)材料膜層的復(fù)合形式，例如本發(fā)明優(yōu)先推薦的是被覆有硝酸纖維膜層的復(fù)合載體形式。本發(fā)明所說(shuō)的檢測(cè)試劑是有A、B兩組分的混合液體形式。其中組分A為用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗熒光素抗體，組分B為用熒光素標(biāo)記的抗血吸蟲(chóng)循環(huán)抗原抗體。組分A中的抗熒光素抗體可由常規(guī)免疫注射法制備動(dòng)物的高效價(jià)抗熒光素抗體，免疫血清純化后用過(guò)碘酸鈉法標(biāo)記上HRP。實(shí)驗(yàn)證明，在用HRP標(biāo)記時(shí)，以使每個(gè)抗熒光素抗體分子平均結(jié)合1.5-2個(gè)HRP分子為好，低于或高于此值可因HRP量不足或過(guò)量可能造成在用顯色劑顯色時(shí)的顯色不足或非特異性顯色等不利影響，不同程度地影響顯色準(zhǔn)確性。組分B中的抗血吸蟲(chóng)循環(huán)抗原抗體由前述內(nèi)容可知，雖不必完全排除使用單克隆抗體，但經(jīng)使用單株單克隆抗體和多克隆抗體比較，在試驗(yàn)方法特異性很好的情況下，后者明顯優(yōu)于前者，因此建議以采用可同時(shí)針對(duì)蟲(chóng)源性和蟲(chóng)卵源性等多種抗原的多克隆抗體為佳，它們均可由普通免疫方法制備得到，經(jīng)純化后再按常規(guī)方法用熒光素標(biāo)記而成。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，用熒光素(F)標(biāo)記抗循環(huán)抗原抗體(P)時(shí)，每毫升被標(biāo)記抗體中的F/P的克分子比值為1-2為佳，比值過(guò)大因易出現(xiàn)多個(gè)抗體的空間位阻等原因反而可能產(chǎn)生不利影響。與一般免疫試驗(yàn)一樣，檢測(cè)試劑中各組分因其制備的原料源和/或方法等原因，使用效果上會(huì)有所差異，即使同批制備出的各組分在混合時(shí)的混配比例不同檢測(cè)效果也不相同。因此，除在通常試劑中均必不可少的緩沖液、無(wú)機(jī)鹽及表面活性劑等成分外，組分A與組分B各自的最佳使用濃度或/和最適混配比例均可由常規(guī)免疫試驗(yàn)的棋盤式方陣最佳滴度選擇確定。在上述內(nèi)容基礎(chǔ)上，經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)和比較發(fā)現(xiàn)，如能將所用的固相載體由通常的平面板形式改為帶有可盛納液體的適當(dāng)形式的凹窩式，例如帶有一個(gè)或數(shù)個(gè)柱狀或半球狀凹窩等形式，可進(jìn)一步提高檢測(cè)效果和水平，并且操作也很方便。尤其當(dāng)采用有被覆膜層的復(fù)合式固相載體時(shí)，所復(fù)合的膜層僅被覆在凹窩的底表面與把包括凹窩側(cè)壁在內(nèi)的全部表面都被覆上膜層相比效果相近，但前者至少在經(jīng)濟(jì)上講是更可取的。由上述內(nèi)容不難看出，本發(fā)明檢測(cè)藥盒的重要特點(diǎn)之一就是檢測(cè)試劑中利用了優(yōu)于BAS系統(tǒng)的熒光素-抗熒光素抗體系統(tǒng)的多級(jí)放大作用和原理。利用具有半抗原性質(zhì)的小分子熒光素與大分子的抗熒光素抗體間很高的特異親合性可產(chǎn)生多級(jí)放大作用近來(lái)雖有報(bào)道，但在本發(fā)明上述內(nèi)容提出之前，在對(duì)寄生蟲(chóng)病，尤其是對(duì)血吸蟲(chóng)病循環(huán)抗原的檢測(cè)中卻未見(jiàn)被有效地應(yīng)用。加之對(duì)固相載體形式的改進(jìn)和最佳形式的選擇，使得本發(fā)明的檢測(cè)工具無(wú)論在操作方法的簡(jiǎn)易性、檢測(cè)所用時(shí)間的長(zhǎng)短和對(duì)環(huán)境條件的要求程度和廣泛適應(yīng)性，還是在檢測(cè)效果和水平，尤其是對(duì)低感染度的檢測(cè)水平上均遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于前述文獻(xiàn)中的各種方法。例如在操作方法上，檢測(cè)中必不可少的沖洗用水可用自來(lái)水或井水、河水等任何水源的潔凈水代替在斑點(diǎn)法中所嚴(yán)格要求使用的蒸餾水及緩沖液，并且也完全省卻了通常為斑點(diǎn)法所不可少的恒溫箱、烘烤箱、搖床等儀器設(shè)備;被檢者的血樣既可以為通常所用的血清，也可以為未加分離的全血;檢測(cè)耗時(shí)也可由斑點(diǎn)法的數(shù)小時(shí)減少為20-30分鐘;每次檢測(cè)規(guī)模要求也可由斑點(diǎn)法的必須數(shù)十上百人份一批降為一人份一批，檢測(cè)成本也可降低50%以上。其中有些優(yōu)點(diǎn)顯然是目前各種方法所完全無(wú)法實(shí)現(xiàn)的，它們無(wú)疑都具有特別重要的實(shí)用意義和價(jià)值，為在門診快速檢測(cè)，特別是為在環(huán)境和條件極簡(jiǎn)陋的偏遠(yuǎn)地區(qū)開(kāi)展和普及實(shí)地檢測(cè)提供了極大的便利條件，并使之能得以實(shí)現(xiàn)。在檢測(cè)效果上，用本發(fā)明的藥盒檢測(cè)血吸蟲(chóng)病循環(huán)抗原的靈敏度可以達(dá)到10-9g的水平，比現(xiàn)在的斑點(diǎn)試驗(yàn)(Dot-ELISA)法提高了30倍。對(duì)采自輕、中、重不同感染度的血吸蟲(chóng)病流行區(qū)糞檢陽(yáng)性患者的血清檢測(cè)陽(yáng)性率分別為92.9～100%，對(duì)急性血吸蟲(chóng)病人血清檢測(cè)的陽(yáng)性率為100%，而對(duì)正常人或患有其它寄生蟲(chóng)病人血清的假陽(yáng)性率不超過(guò)0.11%，顯示了對(duì)血吸蟲(chóng)病循環(huán)抗原，尤其是對(duì)輕度感染血清的檢測(cè)具有理想的敏感度和特異性，這也是目前各種檢測(cè)工具及方法所不及的。采用本發(fā)明檢測(cè)藥盒及方法與前述文獻(xiàn)報(bào)道的檢測(cè)技術(shù)的有關(guān)方面的比較數(shù)據(jù)見(jiàn)表1，文獻(xiàn)報(bào)道的檢測(cè)方法均為斑點(diǎn)試驗(yàn)法，其中“對(duì)比1”用的工具為嚴(yán)自助等人所報(bào)道的，“對(duì)比2”用的工具為裘麗姝等人所報(bào)道的，“對(duì)比3”用的工具為周蕊等人報(bào)道的。以下介紹的是作為本
發(fā)明內(nèi)容的實(shí)例，但本發(fā)明的范圍并不僅限于下述實(shí)例。例1本例藥盒中的固相載體采用帶有若干圓柱狀凹窩的PVC片材為支承基質(zhì)，并在各凹窩內(nèi)的底平面上被覆有硝酸纖維膜層。本例藥盒中的檢測(cè)試劑有A、B兩部分組成，按常規(guī)與無(wú)機(jī)鹽、緩沖液、表面活性劑及蒸餾水等混合。用免疫注射法制備高效價(jià)的兔抗FITC(異硫氰酸熒光素)免疫血清，經(jīng)硫酸銨鹽析后用過(guò)碘酸鈉法標(biāo)記制備與HRP的結(jié)合物，得到組分A，其中每個(gè)抗體分子平均結(jié)合1.5個(gè)HRP分子。由可針對(duì)血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)釋放的腸相關(guān)抗原和表膜抗原及蟲(chóng)卵源性抗原等多種抗原制備的高效價(jià)(106)多克隆抗循環(huán)抗原抗體經(jīng)硫酸銨鹽鹽析及柱層析純化后，用FITC標(biāo)記，使每個(gè)抗體分子平均標(biāo)記1.75個(gè)FITC分子，得到組分B。將按1∶25-1000稀釋度的組分B與按1∶100稀釋度的同量抗原在棋盤式固相載體上作方陣滴度選擇后，確定組分B的最佳稀釋濃度為1∶200。以此效價(jià)的組分B對(duì)按1∶25～1000不同稀釋度的組分A用同樣方法確定了組分A的最佳稀釋度為1∶100以及在檢測(cè)試劑中A與B兩組分的最適混合比例為2∶1。用本例檢測(cè)試劑對(duì)標(biāo)準(zhǔn)陰性與陽(yáng)性血清的四次消光值(OD值)檢測(cè)結(jié)果分別為0.95，0.98，0.89和0.92，標(biāo)準(zhǔn)差0.039，變異系數(shù)4.12%。例2固相載體及制備檢測(cè)試劑的方法同例1。其中檢測(cè)試劑中組分A每個(gè)抗體分子平均標(biāo)記1.7分子HRP，組分B中每個(gè)抗體分子平均標(biāo)記1.9分子FITC，其最佳稀釋濃度均同例1，A與B的最適混合比例為1∶1。本例試劑對(duì)標(biāo)準(zhǔn)血清檢測(cè)的四次消光值分別為1.10，1.05，1.15和0.97，標(biāo)準(zhǔn)差0.082，變異系數(shù)7.66%。例3固相載體及制備檢測(cè)試劑的方法同例1。其中檢測(cè)試劑中組分A每抗體分子平均標(biāo)記1.95分子HRP，組分B每抗體分子平均標(biāo)記1.5分子FITC，其最佳稀釋濃度均同例1，A與B的最適混合比例為1.5∶1。本例試劑對(duì)標(biāo)準(zhǔn)血清的四次消光值檢測(cè)結(jié)果分別為1.30，1.20，1.26和1.15，標(biāo)準(zhǔn)差0.066，變異系數(shù)5.13%。以上三例檢測(cè)試劑實(shí)測(cè)感染血清確定的效價(jià)均在1∶4096以上，完全符合實(shí)測(cè)的要求。本發(fā)明上述檢測(cè)藥盒使用時(shí)的操作方法十分簡(jiǎn)單。首先將經(jīng)稀釋的待測(cè)血清(必要時(shí)可用全血，但注意不要溶血)鋪滿固相載體中的某一凹窩底面，室溫25℃放置10分鐘(延長(zhǎng)時(shí)間不限)，傾去血清，自來(lái)水洗10次后空干。加入按1∶50-100工作濃度稀釋的檢測(cè)試劑，25℃放置10分鐘后傾去，自來(lái)水洗10次以上，最后最好再用蒸餾水洗一次，空干。加入含H2O2的TMB底物溶液反應(yīng)5-10分鐘，即可用目測(cè)或分光光度計(jì)作比色分析，判斷結(jié)果。除此以外并無(wú)其它更多的儀器設(shè)備及操作條件方面的要求。表1</tables>權(quán)利要求1.一種用于檢測(cè)血吸蟲(chóng)病循環(huán)抗原的藥盒，包括相互配合使用的固相載體和檢測(cè)試劑兩部分組成，其特征在于固相載體采用聚氯乙烯材料為支承基質(zhì)，檢測(cè)試劑為用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗熒光素抗體與用熒光素標(biāo)記的抗血吸蟲(chóng)循環(huán)抗原抗體的混合物。2.如權(quán)利要求1所述的藥盒，其特征在于所說(shuō)檢測(cè)試劑中用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗熒光素抗體中，每個(gè)抗體分子上被結(jié)合的標(biāo)記酶分子為1.5-2個(gè)。3.如權(quán)利要求1所述的藥盒，其特征在于所說(shuō)檢測(cè)試劑中被標(biāo)記的抗血吸蟲(chóng)病循環(huán)抗原抗體為同時(shí)針對(duì)血吸蟲(chóng)蟲(chóng)源性和蟲(chóng)卵源性抗原的多克隆抗體。4.如權(quán)利要求1至3之一所述的藥盒，其特征在于所說(shuō)檢測(cè)試劑中被標(biāo)記于抗血吸蟲(chóng)病循環(huán)抗原抗體(P)上的熒光素(F)分子的P/F摩爾數(shù)之比為1/1～2。5.如權(quán)利要求4所述的藥盒，其特征在于所說(shuō)檢測(cè)試劑中用酶標(biāo)記的抗熒光素抗體與用熒光素標(biāo)記的抗血吸蟲(chóng)病循環(huán)抗原抗體間的優(yōu)化混合比例由免疫試驗(yàn)的棋盤式方陣滴度選擇確定。6.如權(quán)利要求1所述的藥盒，其特征在于所說(shuō)的固相載體為至少帶有一個(gè)凹窩的形式。7.如權(quán)利要求1或6所述的藥盒，其特征在于所說(shuō)的固相載體為在聚氯乙烯支承基質(zhì)上被覆有硝酸纖維膜層的復(fù)合形式。8.如權(quán)利要求6所述的藥盒，其特征在于所說(shuō)的固相載體為僅在支承基質(zhì)凹窩的底面上被覆有硝酸纖維膜層的復(fù)合形式。9.如權(quán)利要求5所述的藥盒，其特征在于所說(shuō)的固相載體為在由聚氯乙烯片狀材料制成的帶凹窩的支承基質(zhì)上，僅在凹窩的底面上被覆有硝酸纖維膜層的復(fù)合形式。全文摘要本發(fā)明提供的是由相互配合使用的固相載體和檢測(cè)試劑組成的血吸蟲(chóng)病循環(huán)抗原檢測(cè)藥盒。其中的固相載體以PVC為支承基質(zhì)，檢測(cè)試劑為采用熒光素-抗熒光素多級(jí)放大系統(tǒng)放大的抗血吸蟲(chóng)循環(huán)抗原抗體酶結(jié)合物。本發(fā)明藥盒具有高靈敏度、快速及操作簡(jiǎn)單方便的優(yōu)點(diǎn)，符合普及推廣應(yīng)用的實(shí)際要求。文檔編號(hào)G01N33/535GK1062601SQ9210801公開(kāi)日1992年7月8日申請(qǐng)日期1992年1月17日優(yōu)先權(quán)日1992年1月17日發(fā)明者黎世濤,王秀珍,周肇西申請(qǐng)人:四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院寄生蟲(chóng)病防治研究所