本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及家蠶BmPEPCK-2基因，還涉及家蠶BmPEPCK-2基因的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

家蠶是一種重要的經(jīng)濟昆蟲，蠶絲是絲綢工業(yè)的重要原料。在我國很多農(nóng)村地區(qū)，養(yǎng)蠶業(yè)是當?shù)亟?jīng)濟的支柱性產(chǎn)業(yè)和農(nóng)民的主要經(jīng)濟收入來源，蠶絲業(yè)每年為蠶農(nóng)創(chuàng)收上百億元。但是，家蠶卻面臨嚴重的疾病威脅，核型多角體病毒病是蠶業(yè)生產(chǎn)上最常見而且危害最嚴重的一類蠶病，引起該病的病原為核型多角體病毒(BmNPV)，該病的傳染力極強并且難以控制。

由于BmNPV在蠶業(yè)生產(chǎn)上危害嚴重，科研工作者一直希望找出影響家蠶對病毒抗性的關(guān)鍵基因，然后通過分子生物技術(shù)來提高家蠶對病毒的抗性。對影響家蠶病毒抗性的關(guān)鍵基因全長序列進行克隆和鑒定，為闡明家蠶抵抗病毒的機制，以及培育抗性品種應(yīng)用于蠶業(yè)生產(chǎn)有著重要的理論價值和實踐意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種家蠶BmPEPCK-2基因，還提供該基因的應(yīng)用。

本發(fā)明中根據(jù)家蠶基因組序列設(shè)計引物，克隆了家蠶BmPEPCK-1/2基因，其中BmPEPCK-1基因核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，BmPEPCK-2基因核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，通過RT-PCR和qPCR對BmPEPCK-1/2的時期組織表達情況進行了檢測，證實BmPEPCK-1/2的表達量極低，BmPEPCK-2的表達量低于BmPEPCK-1。BmPEPCK-1/2都被BmNPV病毒誘導下調(diào)表達，在病毒感染后24h，BmPEPCK-1的表達水平恢復正常而BmPEPCK-2仍然下調(diào)表達，暗示BmPEPCK-1/2可能參與了BmNPV病毒和家蠶的互作，BmPEPCK-1和BmPEPCK-2的功能也許不一樣。為了研究該基因的功能，通過增量表達的方式來提高BmPEPCK-1/2的的表達量，然后感染病毒，檢測病毒增殖是否受到抑制。構(gòu)建了增量表達BmPEPCK-1/2的瞬時轉(zhuǎn)染載體，分別轉(zhuǎn)染BmE細胞，然后感染BmNPV-GFP病毒，熒光觀察和qPCR檢測都顯示增量表達BmPEPCK-1不影響B(tài)mNPV病毒的增殖而增量表達BmPEPCK-2能夠顯著抑制了BmNPV病毒的增殖。說明BmPEPCK-2基因是一個影響家蠶抗性的關(guān)鍵基因，可以作為家蠶轉(zhuǎn)基因抗病育種的靶標基因。具體應(yīng)用如下：

所述家蠶BmPEPCK-2基因在培育抗家蠶核型多角體病毒的家蠶品種中的應(yīng)用，所述家蠶BmPEPCK-2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

所述家蠶BmPEPCK-2基因在制備抑制家蠶核型多角體病毒增殖的藥物中的應(yīng)用，所述家蠶BmPEPCK-2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明克隆了影響家蠶抗性的關(guān)鍵基因BmPEPCK的兩種拼接形式的全長序列，包括CDS序列和3’UTR序列，BmPEPCK-1和BmPEPCK-2的主要差異在最后一個外顯子和3’UTR，BmPEPCK-1/2表達量非常低，克隆非常困難；通過RT-PCR和qPCR技術(shù)對該基因的時期組織表達譜進行了檢測，檢測結(jié)果表明該基因的表達量非常低，而且BmPEPCK-2的表達量低于BmPEPCK-1；BmPEPCK-1/2都被BmNPV病毒誘導下調(diào)表達，在病毒感染后24h，BmPEPCK-1的表達水平恢復正常而BmPEPCK-2仍然下調(diào)表達，暗示

BmPEPCK-1/2可能參與了BmNPV病毒和家蠶的互作，BmPEPCK-1和BmPEPCK-2的功能也許不一樣。為了研究BmPEPCK-1/2的功能，以它們的CDS序列作為靶標，構(gòu)建增量表達載體，轉(zhuǎn)染BmE細胞，發(fā)現(xiàn)增量表達BmPEPCK-1不影響B(tài)mNPV病毒的增殖而增量表達BmPEPCK-2能夠顯著抑制BmNPV病毒的增殖，因此BmPEPCK-2基因在家蠶轉(zhuǎn)基因抗病育種的研究和應(yīng)用中具有重要價值。

附圖說明

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖進行說明：

圖1為RT-PCR檢測BmPEPCK-1和BmPEPCK-2基因的時期表達情況(1-11分別為蟻蠶、一齡眠蠶、二齡起蠶、二齡眠蠶、三齡起蠶、三齡眠蠶、四齡起蠶、四齡眠蠶、五嶺起蠶、熟蠶、蛹。BmPEPCK-1/2基因擴增38個循環(huán)，內(nèi)參TIF-4A擴增25個循環(huán))。

圖2為qPCR技術(shù)檢測BmPEPCK-1和BmPEPCK-2基因的組織表達情況(以5齡3天家蠶幼蟲各組織cDNA為模板)。

圖3為BmPEPCK-1和BmPEPCK-2基因被BmNPV病毒誘導下調(diào)表達(A：家蠶大造品種5齡幼蟲感染BmNPV后不同時間點的檢測；B：BmE細胞感染BmNPV后不同時間點的檢測)。

圖4為增量表達BmPEPCK-1基因不能抑制BmNPV增殖(A：轉(zhuǎn)染后48h RT-PCR檢測BmPEPCK-1基因表達量；B：感染病毒后72h觀察BmNPV病毒熒光；C：感染病毒后48h qPCR檢測BmNPV病毒含量)。

圖5為增量表達BmPEPCK-2基因能顯著抑制BmNPV增殖(A：轉(zhuǎn)染后48h RT-PCR檢測BmPEPCK-2基因表達量；B：感染病毒后72h觀察BmNPV病毒熒光；C：感染病毒后48h qPCR檢測BmNPV病毒含量)。

具體實施方式

下面將結(jié)合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。

實施例1、克隆BmPEPCK-1和BmPEPCK-2基因的全長序列

首先根據(jù)家蠶基因組序列設(shè)計特異引物，BmPEPCK-1全長的正向引物：5'-atgctgcattttaaaaccacccccgaaga-3'(SEQ ID NO.1)，反向引物5'-gactcgtttaattttatatctttggt-3'(SEQ ID NO.2)；BmPEPCK-2全長的正向引物：5'-atgctgcattttaaggccatcccc-3'(SEQ ID NO.3)，反向引物5'-catgtgggataaataactaggaagag-3'(SEQ ID NO.4)。然后以家蠶大造5齡3天的全蠶cDNA為模板進行擴增，PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4分鐘，然后94℃變性40秒、57℃退火40秒、72℃延伸1min40秒，共33個循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘；PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收，然后與pMD19-T載體連接，連接反應(yīng)在T4DNA連接酶作用下，16℃過夜連接，然后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，獲得陽性克隆后送往上海生工生物技術(shù)有限公司測序，測序結(jié)果表明我們成功克隆了BmPEPCK-1/2基因的全長序列，其中BmPEPCK-1基因全長如SEQ ID NO.5所示，BmPEPCK-2基因全長如SEQ ID NO.6所示。結(jié)果顯示，BmPEPCK-1基因全長序列為1952bp，包括1914bp的CDS序列和38bp的3’UTR；BmPEPCK-2基因全長序列為1962bp，包括1926bp的CDS序列和36bp的3’UTR。生物信息學分析顯示BmPEPCK-1和BmPEPCK-22都由13個外顯子組成，都包含一個PEPCK結(jié)構(gòu)域，這兩種拼接形式的主要區(qū)別在于它們的第13外顯子以及3’UTR不同。

經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)該基因在家蠶基因組數(shù)據(jù)庫(http://silkworm.swu.edu.cn/silkdb/)中沒有該基因的EST序列，說明該基因表達量非常低，克隆很困難。

實施例2、BmPEPCK-1和BmPEPCK-2基因的時期組織表達譜檢測

以蟻蠶、一齡眠蠶、二齡起蠶、二齡眠蠶、三齡起蠶、三齡眠蠶、四齡起蠶、四齡眠蠶、五嶺起蠶、熟蠶、蛹的cDNA作為模板，以BmPEPCK-1基因的特異引物PEPCK-1qRT(F：5'-tcaaagaggaggtaggcga-3'(SEQ ID NO.7)，R：5'-gactcgtttaattttatatctttggt-3'(SEQ ID NO.8))和BmPEPCK-2基因的特異引物PEPCK-2qRT(F：5'-tcaaagaggaggtaggcgaa-3'(SEQ ID NO.9)，R：5'-catgtgggataaataactaggaagag-3'(SEQ ID NO.10))進行RT-PCR檢測，PCR擴增條件為：94℃預(yù)變性4分鐘，然后94℃變性40秒、57℃退火40秒、72℃延伸10秒，共38個循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘；以家蠶看家基因TIF-4A作為內(nèi)參，以其特異引物TIF-4AqRT(F：5'-gaatggaccctgggacactt-3'(SEQ ID NO.11)，R：5'-ctgactgggcttgagcgata-3'(SEQ ID NO.12))進行RT-PCR檢測，PCR擴增條件為：94℃預(yù)變性4分鐘，然后94℃變性40秒、57℃退火40秒、72℃延伸10秒，共25個循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘，結(jié)果如圖1所示。

以家蠶5齡3天幼蟲的頭、脂肪體、中腸、絲腺、皮、血、馬氏管、氣管、卵巢以及精巢等組織的cDNA作為模板，用BmPEPCK-1基因的特異引物PEPCK-1qRT、BmPEPCK-2基因的特異引物PEPCK-2qRT和內(nèi)參基因TIF-4A的特異引物TIF-4AqRT進行qPCR檢測，按照儀器和試劑盒的說明書進行操作，結(jié)果如圖2所示。

RT-PCR和qPCR的結(jié)果證明BmPEPCK-1和BmPEPCK-2的表達量確實非常低，且BmPEPCK-2的表達量低于BmPEPCK-1，同時也說明我們能克隆得到該基因的全長序列確實非常不容易。

實施例3、BmNPV感染后BmPEPCK-1和BmPEPCK-2的表達量檢測

以半致死劑量的BmNPV病毒經(jīng)口添食感染家蠶大造品種的5齡幼蟲，在感染后6h、12h和24h提取感染和未感染家蠶的中腸RNA，反轉(zhuǎn)成cDNA，用BmPEPCK-1基因的特異引物PEPCK-1qRT、BmPEPCK-2基因的特異引物PEPCK-2qRT和內(nèi)參基因TIF-4A的特異引物TIF-4AqRT進行qPCR檢測，結(jié)果如圖3中A所示。結(jié)果顯示BmNPV感染誘導家蠶BmPEPCK-1和BmPEPCK-2下調(diào)表達，在病毒感染后24h，BmPEPCK-1的表達水平恢復正常而BmPEPCK-2仍然下調(diào)表達。

將BmE細胞感染BmNPV病毒，在感染后0h、3h、6h、12h和24h提取RNA并反轉(zhuǎn)成cDNA，用BmPEPCK-1基因的特異引物PEPCK-1qRT、BmPEPCK-2基因的特異引物PEPCK-2qRT和內(nèi)參基因TIF-4A的特異引物TIF-4AqRT進行qPCR檢測，結(jié)果如圖3中B所示。結(jié)果同樣顯示BmNPV感染誘導BmE細胞BmPEPCK-1/2下調(diào)表達，在病毒感染后24h，BmPEPCK-1的表達水平恢復正常而BmPEPCK-2仍然下調(diào)表達。

上述檢測結(jié)果顯示BmNPV病毒誘導BmPEPCK-1/2下調(diào)表達，而且誘導模式有一定的差異，暗示BmPEPCK-1/2可能參與了BmNPV病毒和家蠶的互作，BmPEPCK-1和BmPEPCK-2的功能也許有所不同。

實施例4、構(gòu)建增量表達載體1180-hr3-A4P-BmPEPCK-1-SV40和1180-hr3-A4P-BmPEPCK-2-SV40

為了研究該基因的功能，通過增量表達方式來提高BmPEPCK-1和BmPEPCK-2基因的表達量，然后再觀察病毒增殖是否有變化，從而證明該基因的功能。

以BmPEPCK-1基因的CDS序列作為靶標，設(shè)計增量表達引物，上游引物為PEPCK-1oe-F：5'-ggatccatgctgcattttaaaaccacccccgaaga-3'(SEQ ID NO.13)，下游引物為PEPCK-1oe-R：5'-gcggccgcttaggcttgtatgttcttcctcaac-3'(SEQ ID NO.14)，以克隆的BmPEPCK-1基因的全長序列質(zhì)粒為模板進行PCR擴增；以BmPEPCK-2基因的CDS序列作為靶標，設(shè)計增量表達引物，上游引物為PEPCK-2oe-F：5'-ggatccatgctgcattttaaggccatcccc-3'(SEQ ID NO.15)，下游引物為PEPCK-2oe-R：5'-gcggccgcctaatttaaagcttggccttgtatg-3'(SEQ ID NO.16)，以克隆的BmPEPCK-2基因的全長序列質(zhì)粒為模板進行PCR擴增。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4分鐘，然后94℃變性40秒、60℃退火40秒、72℃延伸1min40秒，共29個循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘；對擴增出的目的條帶進行回收、連接和轉(zhuǎn)化，篩選陽性克隆后測序。

將上一步測序驗證成功的質(zhì)粒用BamH I和Not I進行雙酶切，經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定并回收，得BmPEPCK-1酶切片段和BmPEPCK-2酶切片段；同時用BamH I和Not I雙酶切已經(jīng)包含Hr3增強子、家蠶肌動蛋白Actin 4啟動子(A4P)和SV40終止信號序列的1180載體，經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定并回收，得1180-hr3-A4P-SV40酶切片段，將BmPEPCK-1和BmPEPCK-2分別和1180-hr3-A4P-SV40酶切片段進行連接轉(zhuǎn)化，使BmPEPCK-1和BmPEPCK-2基因分別替換pb-HEAG載體的hycu-ep32基因序列(pb-HEAG載體見蔣亮博士畢業(yè)論文《基于轉(zhuǎn)基因工程的家蠶核型多角體病毒(BmNPV)抗性素材創(chuàng)新及抗性機制研究》，2013)。篩選陽性克隆，得到1180-hr3-A4P-BmPEPCK-1-SV40載體(PEPCK-1OE)和1180-hr3-A4P-BmPEPCK-2-SV40載體(PEPCK-2OE)。

實施例5、檢測增量表達BmPEPCK-1/2對BmNPV增殖的影響

將PEPCK-1OE、PEPCK-2OE和對照1180空載的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染進BmE細胞，在轉(zhuǎn)染后48h后提取RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用BmPEPCK-1基因的特異引物PEPCK-1qRT、BmPEPCK-2基因的特異引物PEPCK-2qRT和內(nèi)參基因TIF-4A的特異引物TIF-4AqRT進行qPCR檢測，結(jié)果如圖4中A和圖5中A所示。結(jié)果顯示BmPEPCK-1和BmPEPCK-2都增量表達成功。

在轉(zhuǎn)染后48h感染帶有綠色熒光標記的BmNPV-GFP病毒，在感染病毒后48h提取DNA，以BmNPV病毒GP41基因的特異引物GP41qRT(F：5'-cgtagtagtagtaatcgccgc-3'(SEQ ID NO.17)，R：5'-agtcgagtcgcgtcgcttt-3'(SEQ ID NO.18))進行qPCR檢測，以家蠶看家基因BmGAPDH作為內(nèi)參，其特異檢測引物為BmGAPDHqRT(F：5’-ccgcgtccctgttgctaat-3’(SEQ ID NO.19)，R：5’-ctgcctccttgaccttttgc-3’(SEQ ID NO.20))，按照儀器和試劑盒的說明書進行操作，結(jié)果如圖4中C和圖5中C所示。qPCR檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染PEPCK-1OE的細胞不能顯著降低BmNPV病毒含量，而轉(zhuǎn)染PEPCK-2OE的細胞能夠顯著抑制病毒增殖，其BmNPV含量僅為對照的5％。

在感染病毒后72h觀察熒光，結(jié)果如圖4中B和圖5中B所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染PEPCK-1OE的細胞中病毒熒光沒有明顯減少，而轉(zhuǎn)染PEPCK-2OE的細胞中幾乎看不見病毒熒光，表明增量表達BmPEPCK-2顯著抑制了BmNPV的增殖。

上述結(jié)果表明，增量表達BmPEPCK-1不能抑制BmNPV病毒的增殖但增量表達BmPEPCK-2能夠顯著抑制病毒的增殖，表明BmPEPCK基因的這兩種拼接形式具有不同的生物學功能，BmPEPCK-2基因是一個影響家蠶抗性的關(guān)鍵基因，可以作為家蠶轉(zhuǎn)基因抗病育種的靶標基因，用于今后的分子育種工作中。

最后說明的是，以上優(yōu)選實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過上述優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進行了詳細的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解，可以在形式上和細節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書所限定的范圍。

<110> 西南大學；

<120> 家蠶BmPEPCK-2基因及其應(yīng)用

<160> 20

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BmPEPCK-1正向引物

<400> 1

atgctgcatt ttaaaaccac ccccgaaga 29

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BmPEPCK-1反向引物

<400> 2

gactcgttta attttatatc tttggt 26

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BmPEPCK-2正向引物

<400> 3

atgctgcatt ttaaggccat cccc 24

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BmPEPCK-2反向引物

<400> 4

catgtgggat aaataactag gaagag 26

<210> 5

<211> 1952

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BmPEPCK-1基因序列

<400> 5

atgctgcatt ttaaaaccac ccccgaagac tacgtgagga agacggcaca atgtgctcaa 60

gtggcgattg gatgcagccg cgctgcccac caaactgctc tgcgagggtc gacgaagcct 120

tccccacagc tggccactct tactccaaag gtccgcgcgt tcgtggagcg cagcgctgct 180

ctgtgccagc cggagcacgt gcacgtgtgc gacggctccg agacagaggc gagggcgctg 240

ctacagctga tgcagcagca gaccaccctc aaacgactgc cccaatacga taactgttgg 300

ttggcccgga cagacccggc agacgttgcc cgggttgaat cccgcacgtt catatgctcc 360

gatcgggaga gcgacgtggt cccctcggct cgcgccggcc agaagtccgc cctggggaac 420

tacatctccc ccccggatta cgagaaggcc gtgtccgaca gattccctgg ttgtatgaaa 480

ggacgcacaa tgtacgtgat accattctcg atgggtcctg tgggatctcc tctctcgaag 540

atcggcgtag aaatcacgga ttcgccttac gtggtttatt ctatgcgagt catgactaga 600

attggagcga aggttctaga aattctacgt caagacgagc agttcgttcg ttgtcttcac 660

gcagtcggct ccggtggcac tccgggttgg ccctgcgacc ctaagaacac catcatactc 720

cacaagccgg ctgagaacga gatcgtaagc tacggcagtg gatacggcgg caatagtttg 780

ttgggcaaga agtgcttcgc tctacgtctg ggatcagtga tcgctcgtcg cgaaggatgg 840

ctggccgaac atatgcttat cgtcggcata accaaccctc aaggtaagaa gcgctacatc 900

gctgccgctt ttccttcagc ttgcgggaaa acgaaccttg ccatgatgac gccaacactg 960

cccgggtaca aagtagagtg cgtgggggac gacatagcct ggatgaagtt cgacaaggac 1020

ggcgtactcc gggccattaa cccggaaaac gggttctttg gagttgcacc aggtacgtca 1080

gccgctacga atccgatagc aatggcgacg gtgttcaaaa acaccgtgtt cactaacgtg 1140

gcggaaacac ctgagggtgg ggtgtggtgg gaaggcatgg gaccagctcc ggagcgcctc 1200

gtcgactgga aaggtcaacc ctgggacccc agcaagaaaa ctccggctgc acatccaaat 1260

tccagattct gcaccccggc agagcagtgt cccatgatag acggtgagtg ggagagctcg 1320

gagggtgtgc cgatatccgc catcctgctg ggcggcagac ggccggccgg cgtaccgctc 1380

gtagtcgagt cgcgggactg gcagcacggc gtgttcatgg gagcttccat gaggtccgag 1440

gccacggccg ccgccgaaca cagcggtaaa atggtgatgc acgatccgtt tgcgatgcgt 1500

ccgttcttcg gctacaactt cggcgactac ctgaagcact ggctgtcgat gccgcagcct 1560

ggacgaaaca tgcccaagat cttccacgtc aactggttcc gtaaagatga acagggtaag 1620

ttcctctggc ccggtttcgg cgagaactct cgggtcttag actggatctt gcgtcgctgc 1680

gacggggagc cctgccacgc cgagactcca ctggggtaca taccgagagc cggtgctctg 1740

aatacggaaa acctaagcgc tgtcgacatg aacgagctgt tcagcatacc taaagacttt 1800

tggctgcagg agtctgacgc catcgagaag tacttcaaag aggaggtagg cgaagatcta 1860

cccaacgaaa tgtgggacga attgaacaag ttgaggaaga acatacaagc ctaagcttta 1920

aattagacca aagatataaa attaaacgag tc 1952

<210> 6

<211> 1962

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BmPEPCK-2基因序列

<400> 6

atgctgcatt ttaaggccat ccccgaagac tacgtgagga agacggcaca atgtgctcaa 60

gtggcgattg gatgcagccg cgccgcccac caaactgctc tgcgagggtc gacgaagcct 120

tccccacagc tgaccactct cactccaaag gttcgcgcgt tcgtggagcg cagcgctgct 180

ctgtgccagc cggagcacgt gcacgtgtgc gacggctccg agacagaggc gagggccctg 240

ctacagctga tgcagcagca gaccaccctc aaacgactgc ccaaatacga taactgttgg 300

ttggcccgga cagacccggc agacgttgcc cgggttgaat cccgcacgtt catatgctcc 360

gatcgggaga gcgacgtggt cccctcggct cgcgccggcc agaagtccgc cctggggaac 420

tacatctccc ccccggatta cgagaaggcc gtgtccgaca gattccctgg ttgcatgaga 480

ggtcgcacaa tgtacgtgat accgttctcg atgggccctg tgggatctcc tctctcgaag 540

attggtgtag aaatcacgga ttcgccttac gtggtttttt ctatgcgagt catgactaga 600

attggagcga aggttctaga tattctacgt caagacgagc agtttgttca ttgtcttcac 660

gcagtcggat ccggtggcac tccgggctgg ccctgcgacc ctcagaacat cgtcgtactc 720

cacaagccgg ctaacaacga gatagtaagc tacggcagtg gatatggcgg caacagtttg 780

ttgggcaaga agtgcttcgc tctacgtctg ggatcagtga tcgcccgtcg cgaaggatgg 840

ctggctgaac atatgcttat cgtcggcata accaaccctc aaggtaaaaa gcgctacatc 900

gctgctgctt ttccttcagc ttgcgggaag acgaatctcg caatgatgac gccaacactg 960

cccgggtaca aagtagagtg cgtgggggac gacatagcct ggatgaagtt cgacaaggac 1020

ggcgtactgc gggccatcaa ctctgaaaac gggttctttg gaattgcacc aggtacgtca 1080

gccgctacga atccgatagc aatggcgacg gtgttcaaaa acaccgtgtt cactaacgtg 1140

gcggaaacac ctgagggtgg ggtgtggtgg gaaggcatgg gaccagctcc ggagcgcctc 1200

gtcgactgga aaggtcaacc ctgggacccc agcaagaaaa ctccggctgc acatccaaat 1260

tccagattct gcaccccggc agagcagtgt cccatgatag acggtgagtg ggagagctcg 1320

gagggtgtgc cgatatccgc catcctgctg ggcggcagac ggccggccgg cgtaccgctc 1380

gtagtcgagt cgcgggactg gcagcacggc gtgttcatgg gagcttccat gaggtccgag 1440

gccacggccg ccgccgaaca cagcggtaaa atggtgatgc acgatccgtt tgcgatgcgt 1500

ccgttcttcg gctataactt cggcgactac ctgaagcact ggctgtcgat gccgcagccg 1560

ggacgcaaga tgcccaagat cttccatgtc aactggttcc gtaaagacga acagggtaag 1620

ttcctctggc ccggtttcgg cgagaactct cgggtcttag actggatctt acgtcgctgc 1680

gatggggagc cctgccacgc cgagactcca ctggggtaca taccgagagc cggtgctctg 1740

aatacggaaa acctaagcgc tgtcgacatg aacaagctgt tcagcatacc taaagacttt 1800

tggctgcagg aggctgacgc catcgagaag tacttcaaag aggaggtagg cgaagatcta 1860

cccaacgaaa tgtgggacga actgaacaag ttgaggaaaa acatacaagg ccaagcttta 1920

aattagacct ctctctctct tcctagttat ttatcccaca tg 1962

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 特異引物PEPCK-1qRT上游引物

<400> 7

tcaaagagga ggtaggcga 19

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 特異引物PEPCK-1qRT下游引物

<400> 8

gactcgttta attttatatc tttggt 26

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 特異引物PEPCK-2qRT上游引物

<400> 9

tcaaagagga ggtaggcgaa 20

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 特異引物PEPCK-2qRT下游引物

<400> 10

catgtgggat aaataactag gaagag 26

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 特異引物TIF-4AqRT上游引物

<400> 11

gaatggaccc tgggacactt 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 特異引物TIF-4AqRT上游引物

<400> 12

ctgactgggc ttgagcgata 20

<210> 13

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 上游引物PEPCK-1oe-F

<400> 13

ggatccatgc tgcattttaa aaccaccccc gaaga 35

<210> 14

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 下游引物PEPCK-1oe-R

<400> 14

gcggccgctt aggcttgtat gttcttcctc aac 33

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 上游引物PEPCK-2oe-F

<400> 15

ggatccatgc tgcattttaa ggccatcccc 30

<210> 16

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 上游引物PEPCK-2oe-F

<400> 16

gcggccgcct aatttaaagc ttggccttgt atg 33

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 特異引物GP41qRT上游引物

<400> 17

cgtagtagta gtaatcgccg c 21

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 特異引物GP41qRT下游引物

<400> 18

agtcgagtcg cgtcgcttt 19

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BmGAPDHqRT上游引物

<400> 19

ccgcgtccct gttgctaat 19

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BmGAPDHqRT下游引物

<400> 20

ctgcctcctt gaccttttgc 20