本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及家蠶BmST基因，還涉及家蠶BmST基因的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

家蠶是一種重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)，蠶絲是絲綢工業(yè)的重要原料。在中國(guó)、印度、巴西等發(fā)展中國(guó)家，養(yǎng)蠶業(yè)是農(nóng)民經(jīng)濟(jì)收入的一個(gè)重要來(lái)源，甚至是某些地區(qū)的支柱性產(chǎn)業(yè)。但是，家蠶卻面臨嚴(yán)重的疾病威脅，每年因蠶病引起的損失占蠶業(yè)生產(chǎn)總收入的20％左右。病毒病是對(duì)養(yǎng)蠶業(yè)威脅最嚴(yán)重的一類疾病，主要由家蠶核型多角體病毒(BmNPV)和家蠶質(zhì)型多角體病毒(BmCPV)引起。

由于BmNPV和BmCPV在蠶業(yè)生產(chǎn)上危害嚴(yán)重，科研工作者一直希望找出影響家蠶對(duì)病毒抗性的關(guān)鍵基因，然后通過(guò)轉(zhuǎn)基因遺傳改良來(lái)提高家蠶對(duì)病毒的抗性。對(duì)影響家蠶病毒抗性的關(guān)鍵基因全長(zhǎng)序列進(jìn)行克隆和鑒定，為闡明家蠶抵抗病毒的機(jī)制，以及培育抗性品種應(yīng)用于蠶業(yè)生產(chǎn)有著重要的理論價(jià)值和實(shí)踐意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種來(lái)自于家蠶的對(duì)多種病毒具有抗性的關(guān)鍵基因，還提供該基因的應(yīng)用。

本發(fā)明中，由于家蠶基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http://silkworm.swu.edu.cn/silkdb/)中沒(méi)有該基因表達(dá)序列標(biāo)簽(Expressed sequence tag，EST)，說(shuō)明表達(dá)量非常低，全長(zhǎng)序列克隆非常困難。因此為克隆此基因，本發(fā)明設(shè)計(jì)引物，克隆了家蠶BmST基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，分析發(fā)現(xiàn)該基因包括一個(gè)Somatomedin B-like結(jié)構(gòu)域和一個(gè)Thrombospondin type 1repeats結(jié)構(gòu)域。通過(guò)RT-PCR和qPCR對(duì)該基因的時(shí)期組織表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)，研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)該基因的表達(dá)量極低。為了研究該基因的功能，通過(guò)增量表達(dá)的方式來(lái)提高細(xì)胞和家蠶體內(nèi)該基因的表達(dá)量，然后感染病毒，檢測(cè)病毒增殖是否受到抑制。構(gòu)建了增量表達(dá)BmST的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染載體，轉(zhuǎn)染BmE細(xì)胞，然后感染BmNPV-GFP病毒，熒光觀察和qPCR檢測(cè)都顯示BmNPV病毒的增殖被明顯抑制；構(gòu)建增量表達(dá)BmST的轉(zhuǎn)基因載體，通過(guò)胚胎顯微注射制備轉(zhuǎn)基因家蠶，分別經(jīng)口添食感染BmNPV和BmCPV，qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因家蠶體內(nèi)的病毒含量顯著低于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?，說(shuō)明BmST基因是一個(gè)影響家蠶抗性的關(guān)鍵基因，可以作為家蠶轉(zhuǎn)基因抗病育種的靶標(biāo)基因。

具體應(yīng)用如下：

家蠶BmST基因在培育抗家蠶核型多角體病毒的家蠶品種中的應(yīng)用，所述家蠶BmST基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

家蠶BmST基因在培育抗家蠶質(zhì)型多角體病毒的家蠶品種中的應(yīng)用，所述家蠶BmST基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

家蠶BmST基因在培育抗家蠶核型多角體病毒和家蠶質(zhì)型多角體病毒的家蠶品種中的應(yīng)用，所述家蠶BmST基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

家蠶BmST基因在制備抑制家蠶核型多角體病毒增殖的藥物中的應(yīng)用，所述家蠶BmST基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

家蠶BmST基因在制備抑制家蠶質(zhì)型多角體病毒增殖的藥物中的應(yīng)用，所述家蠶BmST基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

家蠶BmST基因在制備抑制家蠶核型多角體病毒和家蠶質(zhì)型多角體病毒增殖的藥物中的應(yīng)用，所述家蠶BmST基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明克隆了家蠶的一個(gè)影響家蠶抗性的關(guān)鍵基因BmST的全長(zhǎng)CDS序列，該基因表達(dá)量非常低，沒(méi)有EST序列，克隆非常困難；通過(guò)RT-PCR和qPCR技術(shù)對(duì)該基因的時(shí)期組織表達(dá)譜進(jìn)行了檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明該基因的表達(dá)量非常低；為了研究該基因的功能，以該基因的全長(zhǎng)CDS序列作為靶標(biāo)，構(gòu)建瞬時(shí)轉(zhuǎn)染增量表達(dá)載體，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞水平增量表達(dá)該基因能夠顯著抑制BmNPV的增殖；進(jìn)而構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因增量表達(dá)載體，通過(guò)轉(zhuǎn)基因顯微注射，篩選得到轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性個(gè)體，增量表達(dá)該基因的轉(zhuǎn)基因家蠶對(duì)BmNPV和BmCPV病毒的抗性都顯著提高，因此該基因在家蠶轉(zhuǎn)基因抗病育種的研究和應(yīng)用中具有重要價(jià)值。

附圖說(shuō)明

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖進(jìn)行說(shuō)明：

圖1為不同時(shí)期BmST基因時(shí)期表達(dá)情況(1-12分別為卵、蟻蠶、一齡眠蠶、二齡起蠶、二齡眠蠶、三齡起蠶、三齡眠蠶、四齡起蠶、四齡眠蠶、五嶺起蠶、熟蠶、蛹)。

圖2為qPCR技術(shù)檢測(cè)BmST基因不同組織表達(dá)情況。

圖3為BmE細(xì)胞中增量表達(dá)BmST基因?qū)mNPV增殖的影響(A為BmST基因瞬時(shí)增量表達(dá)載體示意圖；B為轉(zhuǎn)染后48h RT-PCR檢測(cè)BmST基因表達(dá)量；C為感染病毒后72h觀察BmNPV病毒熒光；D為感染病毒后48h qPCR檢測(cè)BmNPV病毒含量)。

圖4為增量表達(dá)BmST基因的轉(zhuǎn)基因家蠶對(duì)BmNPV和BmCPV的抗性影響(A為BmST基因轉(zhuǎn)基因增量表達(dá)載體示意圖；B為轉(zhuǎn)基因家蠶感染BmNPV后48h qPCR檢測(cè)BmNPV病毒含量；C為轉(zhuǎn)基因家蠶感染BmCPV后72h qPCR檢測(cè)BmCPV病毒含量)。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。

實(shí)施例1、克隆BmST基因全長(zhǎng)CDS序列

根據(jù)家蠶基因組序列設(shè)計(jì)特異引物，正向引物：5'-atgcaccgccattttcttt-3'(SEQ ID NO.1)，反向引物5'-tcaaacaaagatgaagtcagggt-3'(SEQ ID NO.2)。以家蠶大造品種5齡3天的全蠶cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4分鐘，然后94℃變性40秒、58℃退火40秒、72℃延伸50秒，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘；PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收，然后與pMD19-T載體連接，連接反應(yīng)在T4DNA連接酶作用下，16℃過(guò)夜連接，然后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，獲得陽(yáng)性克隆后送往上海生工生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果如SEQ ID NO.3所示，該序列命名為BmST基因，結(jié)果表明成功克隆了BmST基因的CDS序列。由于家蠶基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http://silkworm.swu.edu.cn/silkdb/)中沒(méi)有該基因的EST序列，說(shuō)明該基因表達(dá)量非常低，克隆很困難。

經(jīng)序列分析表明，BmST基因CDS全長(zhǎng)為828bp的序列。生物信息學(xué)分析顯示該基因包括一個(gè)Somatomedin B-like結(jié)構(gòu)域和一個(gè)Thrombospondin type 1repeats結(jié)構(gòu)域。

實(shí)施例2、BmST基因的時(shí)期組織表達(dá)譜檢測(cè)

以家蠶卵、蟻蠶、一齡眠蠶、二齡起蠶、二齡眠蠶、三齡起蠶、三齡眠蠶、四齡起蠶、四齡眠蠶、五嶺起蠶、熟蠶、蛹的cDNA作為模板，以BmST基因的特異引物BmSTqRT(F：5'-acttgagacttcgcaaccca-3'(SEQ ID NO.4)，R：5'-tcgcaaagcacgcatacag-3'(SEQ ID NO.5))進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性4分鐘，然后94℃變性40秒、58℃退火40秒、72℃延伸10秒，共32個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘；以家蠶看家基因TIF-4A作為內(nèi)參，以其特異引物TIF-4AqRT(F：5'-gaatggaccctgggacactt-3'(SEQ ID NO.6),R：5'-ctgactgggcttgagcgata-3'(SEQ ID NO.7))進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性4分鐘，然后94℃變性40秒、57℃退火40秒、72℃延伸10秒，共25個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘，結(jié)果如圖1所示。

然后再以家蠶5齡3天幼蟲(chóng)的頭、脂肪體、中腸、絲腺、皮、血、馬氏管、氣管、卵巢以及精巢等組織的cDNA作為模板，用BmST基因的特異引物BmSTqRT和內(nèi)參基因TIF-4A的特異引物TIF-4AqRT進(jìn)行qPCR檢測(cè)，按照儀器和試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，結(jié)果如圖2所示。

RT-PCR和qPCR的結(jié)果證明BmST基因的表達(dá)量確實(shí)非常低，表明本發(fā)明能克隆得到該基因的全長(zhǎng)CDS序列非常不容易。

實(shí)施例3、構(gòu)建瞬時(shí)增量表達(dá)載體1180-hr3-A4P-BmST-SV40和轉(zhuǎn)基因增量表達(dá)載體piggyBac[hr3-A4P-BmST-SV40-3×p3DsRed afm]

為了研究BmST基因的功能，通過(guò)增量表達(dá)方式來(lái)提高BmE細(xì)胞和家蠶體內(nèi)BmST基因的表達(dá)量，然后再觀察病毒增殖是否有變化，從而證明該基因的功能。具體步驟如下：

以BmST基因的全長(zhǎng)CDS序列作為靶標(biāo)，設(shè)計(jì)增量表達(dá)引物，上游引物為BmSToe-F：5'-ggatccatgcaccgccattttcttt-3’(SEQ ID NO.8)，下游引物為BmSToe-R：5'-gcggccgctcaaacaaagatgaagtca-3'(SEQ ID NO.9)。以克隆的BmST基因的CDS質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4分鐘，然后94℃變性40秒、58℃退火40秒、72℃延伸50秒，共29個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘；對(duì)擴(kuò)增出的目的條帶進(jìn)行回收、連接和轉(zhuǎn)化，篩選陽(yáng)性克隆后測(cè)序。

將上一步測(cè)序驗(yàn)證成功的質(zhì)粒用BamH I和Not I進(jìn)行雙酶切，經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定并回收，得BmST酶切片段；同時(shí)用BamH I和Not I雙酶切已經(jīng)包含Hr3增強(qiáng)子、家蠶肌動(dòng)蛋白Actin 4啟動(dòng)子(A4P)和SV40終止信號(hào)序列的1180載體，將BmST基因替換pb-HEAG載體的hycu-ep32基因序列(pb-HEAG載體見(jiàn)蔣亮博士畢業(yè)論文《基于轉(zhuǎn)基因工程的家蠶核型多角體病毒(BmNPV)抗性素材創(chuàng)新及抗性機(jī)制研究》，2013)，經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定并回收，得1180-hr3-A4P-SV40酶切片段。將BmST酶切片段和1180-hr3-A4P-SV40酶切片段進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，篩選陽(yáng)性克隆，得到1180-hr3-A4P-BmST-SV40載體(簡(jiǎn)稱為BmSTOE)。

(4)將piggyBac[3×p3DsRed afm]載體和1180-hr3-A4P-BmST-SV40分別用Asc I單酶切，回收目的條帶后連接轉(zhuǎn)化，篩選陽(yáng)性克隆，得到piggyBac[hr3-A4P-BmST-SV40-3×p3DsRed afm]載體(簡(jiǎn)稱為pb-STOE)，結(jié)構(gòu)如圖3中A所示。

實(shí)施例4、瞬時(shí)增量表達(dá)BmST抑制BmNPV增殖

將BmSTOE和對(duì)照1180空載的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染進(jìn)BmE細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染后48h后提取RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用BmST基因的特異引物BmSTqRT和內(nèi)參基因TIF-4A的特異引物TIF-4AqRT進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果如圖3中B所示。結(jié)果顯示BmST的擴(kuò)增條帶亮度在轉(zhuǎn)染BmSTOE的樣品中更加明顯，表明BmST的增量表達(dá)成功。

在轉(zhuǎn)染后48h感染帶有綠色熒光標(biāo)記的BmNPV-GFP病毒，在感染病毒后48h提取DNA，以BmNPV病毒GP41基因的特異引物GP41qRT(F：5'-cgtagtagtagtaatcgccgc-3'(SEQ ID NO.10)，R：5'-agtcgagtcgcgtcgcttt-3'(SEQ ID NO.11))進(jìn)行qPCR檢測(cè)，以家蠶看家基因BmGAPDH作為內(nèi)參，其特異檢測(cè)引物為BmGAPDHqRT(F：5'-ccgcgtccctgttgctaat-3'(SEQ ID NO.12)，R：5'-ctgcctccttgaccttttgc-3'(SEQ ID NO.13))，按照儀器和試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，結(jié)果如圖3中D所示。qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染BmSTOE的細(xì)胞能夠顯著抑制病毒增殖，其BmNPV含量?jī)H為對(duì)照的35％。

在感染病毒后72h觀察熒光，結(jié)果如圖3中C所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染BmSTOE的細(xì)胞中病毒熒光明顯少于對(duì)照，表明瞬時(shí)增量表達(dá)BmST能夠抑制BmNPV的增殖。

實(shí)施例5、轉(zhuǎn)基因顯微注射和陽(yáng)性個(gè)體的篩選

將家蠶大造(DZ)品種蠶卵浸酸(鹽酸比重為1.073，溫度為46℃，時(shí)間為5分鐘)解除滯育以后，放于15℃和85％濕度的黑暗環(huán)境中催青30天左右直至孵化，將蟻蠶收好置于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境中飼養(yǎng)(溫度：25℃，濕度：80％)，化蛾以后將雌雄蠶蛾交配4小時(shí)，拆對(duì)后產(chǎn)下的蠶卵為非滯育蠶卵，用于下一步的顯微注射；

將pb-STOE重組載體和輔助質(zhì)粒A3H混合備用，將產(chǎn)下的蠶卵在干凈的載玻片上排列整齊，在蠶卵產(chǎn)后2小時(shí)用Eppendorf顯微注射儀將混合質(zhì)粒溶液注射DZ蠶卵中，總注射蠶卵數(shù)為132粒。用無(wú)毒膠水封口以后置于25℃、相對(duì)濕度80％的環(huán)境中催青10天左右孵化，將孵化的76頭G0代蟻蠶用桑葉收集飼養(yǎng)至化蛾，G0代蠶蛾通過(guò)自交或回交共獲得12蛾圈G1代蠶卵，用電動(dòng)宏觀熒光顯微鏡觀察G1胚胎篩選并獲得1個(gè)陽(yáng)性蛾圈，繼代擴(kuò)大得到轉(zhuǎn)基因家蠶系統(tǒng)STOE。

實(shí)施例6、轉(zhuǎn)基因家蠶抗病毒能力檢測(cè)

取轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)STOE和非轉(zhuǎn)基因DZ，在4齡起蠶以半致死劑量經(jīng)口單頭添食BmNPV病毒，在攻毒后48h提取DNA，用GP41基因的特異引物GP41qRT和內(nèi)參基因BmGAPDH的特異引物BmGAPDHqRT進(jìn)行qPCR檢測(cè)，結(jié)果如圖4中A所示。結(jié)果顯示STOE體內(nèi)的BmNPV含量?jī)H為對(duì)照的34％，表明增量表達(dá)BmST的轉(zhuǎn)基因家蠶對(duì)BmNPV的抗性顯著提高。

取STOE和DZ的4齡起蠶，分別經(jīng)口單頭添食半致死劑量的BmCPV病毒，在攻毒后72h提取RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以BmCPV病毒結(jié)構(gòu)蛋白編碼基因S2的特異引物S2qRT(F：5'-cggcaaactcgcaaacat-3'(SEQ ID NO.14)，R：5'-ctaaaccttggagcaatacgg-3'(SEQ ID NO.15))和非結(jié)構(gòu)蛋白編碼基因S8的特異引物S8qRT(F：5'-gacgagacggagaagaagga-3'(SEQ ID NO.16)，R：5'-tactataggtgagggcaatggt-3'(SEQ ID NO.17))進(jìn)行qPCR檢測(cè)，以家蠶看家基因TIF-4A作為內(nèi)參，其特異引物為T(mén)IF-4AqRT，結(jié)果如圖4中B所示。檢測(cè)結(jié)果顯示，STOE能夠顯著抑制BmCPV的增殖，其體內(nèi)S2和S8基因mRNA含量分別只有對(duì)照的56％和42％，表明增量表達(dá)BmST能夠顯著提高轉(zhuǎn)基因家蠶對(duì)BmCPV的抗性。

增量表達(dá)BmST不但在細(xì)胞水平能夠顯著抑制病毒的增殖，而且在轉(zhuǎn)基因家蠶個(gè)體水平也顯著抑制了病毒的增殖，表明BmST基因是一個(gè)影響家蠶抗性的關(guān)鍵基因。更有趣的是，增量表達(dá)BmST的轉(zhuǎn)基因家蠶對(duì)BmNPV和BmCPV兩種病毒的抗性都顯著增強(qiáng)，說(shuō)明BmST基因是一個(gè)影響家蠶對(duì)多種病毒抗性的關(guān)鍵基因，可以作為家蠶轉(zhuǎn)基因抗病育種的靶標(biāo)基因用于今后的分子育種工作中。

最后說(shuō)明的是，以上優(yōu)選實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過(guò)上述優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。

<110> 西南大學(xué)；

<120> 家蠶BmST基因及其應(yīng)用

<160> 17

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 家蠶BmST基因正向引物

<400> 1

atgcaccgcc attttcttt 19

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 家蠶BmST基因反向引物

<400> 2

tcaaacaaag atgaagtcag ggt 23

<210> 3

<211> 828

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 家蠶BmST基因

<400> 3

atgcaccgcc attttctttg tctaagcttg ttcattttcg cgggctattg cgatgcgaac 60

tattgccggg acgcgaacct gtgctgcccg gggagggata gttcctgcgt cgttcagaag 120

gcgcaccaga acgccattat tgaggaccta accgacaagc cttgttactg tgaccacgct 180

tgcttgaaat tgggagattg ttgccccgac ttccgggaga cttgcggagt gatcgattgc 240

gttgtttcaa gctggggctc gtggtcggaa tgcgatacca cctgcggctc tgggagcatg 300

gtgcgaacgc gtaggatcgt gcaagcccca gcgcatggag gtcggcactg cccctcgctg 360

gtccagcgga gggcatgcca agaacatcag gggtgctcat cggatagtga cgtaccatta 420

cgagacgaaa cagcgatgct cttaccggga ggactttcgg tcagtcgaca ttcgaacgag 480

acagtggaca tccgcaaaaa cttgagactt cgcaacccag acgatcctga atctaattcg 540

cacagagagt actgcgctca atacgaagtg actaaagtct cgaaagcctg ccacgcggat 600

tcggactaca aagcgttgag ggaaggcaat actgtatgcg tgctttgcga gtcggccgct 660

ttaagacgtg acttgaaatg gagatgtaat ggccatggcg tctctggaca cacgacgcgc 720

ttctacgcgc tcgtagctcc acactgtcac gggaagtgga tcagatccga ccacgacctg 780

gacaagacaa gcgactgctg caccaaccct gacttcatct ttgtttga 828

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 特異引物BmSTqRT上游引物

<400> 4

acttgagact tcgcaaccca 20

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 特異引物BmSTqRT下游引物

<400> 5

tcgcaaagca cgcatacag 19

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 特異引物TIF-4AqRT上游引物

<400> 6

gaatggaccc tgggacactt 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 特異引物TIF-4AqRT下游引物

<400> 7

ctgactgggc ttgagcgata 20

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BmST基因增量表達(dá)上游引物

<400> 8

ggatccatgc accgccattt tcttt 25

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BmST基因增量表達(dá)下游引物

<400> 9

gcggccgctc aaacaaagat gaagtca 27

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 特異引物GP41qRT上游引物

<400> 10

cgtagtagta gtaatcgccg c 21

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 特異引物GP41qRT下游引物

<400> 11

agtcgagtcg cgtcgcttt 19

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 檢測(cè)引物BmGAPDHqRT上游引物

<400> 12

ccgcgtccct gttgctaat 19

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 檢測(cè)引物BmGAPDHqRT下游引物

<400> 13

ctgcctcctt gaccttttgc 20

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 特異引物S2qRT上游引物

<400> 14

cggcaaactc gcaaacat 18

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 特異引物S2qRT下游引物

<400> 15

ctaaaccttg gagcaatacg g 21

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 特異引物S8上游引物

<400> 16

gacgagacgg agaagaagga 20

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 特異引物S8下游引物

<400> 17

tactataggt gagggcaatg gt 22