本發(fā)明屬于分子疫苗學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，涉及一種羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌重組CBP蛋白疫苗的制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

無(wú)乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)是一種人畜魚(yú)共患革蘭氏陽(yáng)性菌，能引起新生兒腦膜炎、牛乳腺炎和魚(yú)類(lèi)腦膜腦炎。無(wú)乳鏈球菌能感染多種海水、淡水魚(yú)類(lèi)并引起死亡，給我國(guó)乃至世界水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。因此，研究無(wú)乳鏈球菌相關(guān)的防治技術(shù)具有很重要的現(xiàn)實(shí)意義。

目前，在國(guó)內(nèi)已有一些與鏈球菌疫苗相關(guān)的專(zhuān)利。申請(qǐng)?zhí)枺?00580013779.X，發(fā)明名稱：無(wú)乳鏈球菌疫苗公布了一種β溶血性無(wú)乳鏈球菌的完整滅活細(xì)胞和該菌培養(yǎng)物的濃縮提取物制備的組合疫苗通過(guò)注射和浸泡兩種方式對(duì)羅非魚(yú)抗無(wú)乳鏈球菌的免疫保護(hù)效果分別為80％和35％。申請(qǐng)?zhí)枺?00780025577.6，發(fā)明名稱：抗鏈球菌的聯(lián)合疫苗公布了一種聯(lián)合疫苗，當(dāng)難辨鏈球菌和海豚鏈球菌在疫苗制劑中的比例(基于細(xì)胞∶細(xì)胞)為20∶1或40∶1時(shí)，可得到抗難辨鏈球菌的64％的相對(duì)保護(hù)率和抗海豚鏈球菌的71％的相對(duì)保護(hù)率。申請(qǐng)?zhí)枺?01080047156.5，發(fā)明名稱：鏈球菌組合疫苗，公布了一種組合疫苗，包含無(wú)乳鏈球菌生物型1血清型Ia細(xì)胞和血清型III細(xì)胞的組合疫苗提供針對(duì)羅非魚(yú)抗無(wú)乳鏈球菌生物型1血清型Ia的88.9％保護(hù)率和抗羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌生物型1血清型III的92％的保護(hù)率。申請(qǐng)?zhí)枺?01010207289.6，發(fā)明名稱：羅非魚(yú)二聯(lián)鏈球菌滅活疫苗的制備方法，公布了一種羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌和海豚鏈球菌等體積混合二聯(lián)疫苗的制備過(guò)程。申請(qǐng)?zhí)枺?01210337267.0，發(fā)明名稱：一種預(yù)防羅非魚(yú)鏈球菌病的疫苗，公布了一種無(wú)乳鏈球菌全菌滅活疫苗通過(guò)浸泡、注射和口服免疫羅非魚(yú)后最高分別能達(dá)到60％、90％和75％的免疫保護(hù)率。申請(qǐng)?zhí)枺?01410121138.7，申請(qǐng)名稱：一種無(wú)乳鏈球菌的口服疫苗及其制備方法，構(gòu)建一種表達(dá)無(wú)乳鏈球菌sip蛋白的重組減毒沙門(mén)氏菌，將其拌料投喂羅非魚(yú)后最高可獲得63％的抗無(wú)乳鏈球菌免疫保護(hù)率。

但是，以上公開(kāi)使用的無(wú)乳鏈球菌疫苗均是單一或是二聯(lián)全菌滅活疫苗，制備出的疫苗免疫效力與疫苗菌株的免疫原性直接相關(guān)，并且只對(duì)血清型一致的無(wú)乳鏈球菌有效，對(duì)海豚鏈球菌沒(méi)有效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，提供一種羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌Cbp基因編碼的重組CBP蛋白，并作為重組蛋白疫苗來(lái)防治羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌病，能夠?qū)α_非魚(yú)抗無(wú)乳鏈球菌不同血清型產(chǎn)生特異性的保護(hù)性。該重組蛋白疫苗的制備方法簡(jiǎn)單、制備過(guò)程安全，疫苗對(duì)羅非魚(yú)抗無(wú)乳鏈球菌的免疫保護(hù)率達(dá)到56.35％±8.09％。

本發(fā)明的目的是提供一種羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌重組CBP蛋白疫苗的制備方法。

本發(fā)明另一目的是提供所述羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌重組CBP蛋白疫苗的應(yīng)用。

本發(fā)明上述目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌Cbp基因，其核苷酸序列如序列1所示。

所述的羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌Cbp基因是從羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌中克隆得到的。

一種羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌Cbp基因編碼的重組CBP蛋白，其氨基酸序列如序列2所示。

所述重組CBP蛋白是由上述羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌Cbp基因編碼得到。

另外，上述羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌重組CBP蛋白的制備方法，包括如下步驟：

S1.利用引物對(duì)CBP-F和CBP-R，將Cbp基因克隆到原核表達(dá)系統(tǒng)中，得到含重組質(zhì)粒pET28a-CBP的工程菌；

S2.將含重組質(zhì)粒pET28a-CBP的工程菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，純化回收獲得重組CBP蛋白；

其中，所述引物CBP-F的序列如序列3所示，引物CBP-R的序列如序列4所示；所述Cbp基因的序列如序列1所示。

另外，進(jìn)一步優(yōu)選地，步驟S1的具體方法是：

S11.克隆Cbp基因：以羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌基因組DNA為模板，以引物CBP-F和CBP-R進(jìn)行PCR克隆Cbp基因；

S12.構(gòu)建CBP克隆菌株：將克隆的Cbp基因連接到pET28a載體，并轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，利用卡那青霉素篩選得到含有重組質(zhì)粒pET28a-CBP的陽(yáng)性CBP菌株；

S13.構(gòu)建CBP表達(dá)菌株：將重組質(zhì)粒pET28a-CBP轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)卡那青霉素抗性篩選，挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定，篩選出陽(yáng)性克隆細(xì)胞，即為含重組質(zhì)粒pET28a-CBP的工程菌。

其中，更優(yōu)選地，步驟S11所述PCR反應(yīng)體系為：25μl反應(yīng)體系含50ng模板DNA(基因組DNA)，2.5μl 10×PCR Buffer(Mg+)，2μl dNTP Mixture(2.5mM)，1μl CBP-F，1μl CBP-R，0.125μl rTaq(5U/μl)，加滅菌蒸餾水至25μl。

更優(yōu)選地，步驟S11所述PCR條件為：94℃預(yù)變性3min；然后94℃變性30s，53℃退火35s，72℃延伸2min下作用30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸8min；4℃保溫。

更優(yōu)選地，步驟S12所述連接的體系為：20μl體系內(nèi)含3μl PCR產(chǎn)物，1μl Vector，2μl 10×Buffer，1μl Enzyme Mix A，13μl ddH₂O。(注：連接體系所用載體、酶、緩沖液均來(lái)自斯丹賽生物技術(shù)公司‘如意連試劑盒’)

更優(yōu)選地，步驟S12的具體方法如下：將步驟S11所述PCR的產(chǎn)物回收純化后與pET28a載體連接，37℃下連接30min；將10μl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入100μl大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，冰浴30min，42℃熱激60s，冰浴5min；然后加入500μl LB液體培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)45min；4000rpm離心5min，留100μl吹打沉淀菌液，將混合液加入含有50μg/ml卡那青霉素(Kan+)的LB固體培養(yǎng)基上，涂布均勻后在37℃培養(yǎng)過(guò)夜；隨機(jī)挑取平板上的10個(gè)單菌落鑒定，鑒定結(jié)果為陽(yáng)性的單菌落即為CBP克隆菌株。

更優(yōu)選地，步驟S13的具體方法如下：將5μl質(zhì)粒pET28a轉(zhuǎn)入100μl大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，冰浴30min，42℃熱激60s，冰浴5min；然后加入500μl LB液體培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)45min；4000rpm離心5min，留100μl吹打沉淀菌液，將混合液加入含有50μg/ml卡那青霉素(Kan+)的LB固體培養(yǎng)基上，涂布均勻后在37℃培養(yǎng)過(guò)夜；隨機(jī)挑取平板上的10個(gè)單菌落鑒定，鑒定結(jié)果為陽(yáng)性的單菌落即為CBP表達(dá)菌株。

進(jìn)一步優(yōu)選地，步驟S2的具體方法如下：

S21.將含有重組質(zhì)粒pET28a-CBP的工程菌單菌落接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)10h；

S22.將菌液加入含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，擴(kuò)大培養(yǎng)2h，至OD600為0.6；

S23.向菌液中加入IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)后，利用咪唑洗脫液純化回收，得到純化的重組CBP蛋白，即為所述羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌重組CBP蛋白，其氨基酸序列如序列2所示。

其中，更具體優(yōu)選地，步驟S2的具體方法如下：

S21.將含有重組質(zhì)粒pET28a-CBP的E.coli BL21(DE3)單菌落接種于5ml含有50μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃下200r/min震蕩培養(yǎng)10h；

S22.將5ml菌液加入500ml含有50μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，1∶100擴(kuò)大培養(yǎng)2h，至OD600約為0.6；

S23.向菌液中加入終濃度為1mmol/l的IPTG，16℃震蕩培養(yǎng)過(guò)夜；離心收集過(guò)夜誘導(dǎo)的菌體，Lysis Buffer重懸，冰浴30min后超聲破碎30min，離心收集上清；

S24.用Ni-NTA純化上清液中的重組CBP蛋白，先用含有20mmol/l咪唑的洗脫液洗去雜質(zhì)，再用含100mmol/l咪唑的洗脫液洗脫重組蛋白；洗脫的重組蛋白用10KDa超濾管超濾，除去洗脫液中的咪唑，得到純化的重組CBP蛋白，即為所述羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌重組CBP蛋白，其氨基酸序列如序列2所示。

另外，上述羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌重組CBP蛋白在作為或制備羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌重組CBP蛋白疫苗方面的應(yīng)用，也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

一種羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌重組CBP蛋白疫苗的制備方法，是將羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌重組CBP蛋白用滅菌PBS稀釋至1mg/ml，與弗氏完全或不完全佐劑按1∶1混合均勻，制備成亞單位疫苗。

進(jìn)一步地，取1ml制備好的疫苗，在3000×g下離心5min，疫苗無(wú)分層現(xiàn)象，則可用于后續(xù)免疫。

上述方法制備得到的羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌重組CBP蛋白疫苗，以及所述羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌重組CBP蛋白疫苗在制備防治羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌病的藥物或制劑方面的應(yīng)用，也都應(yīng)在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明提供了一種羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌重組CBP蛋白疫苗的制備方法，所得重組CBP蛋白疫苗可用于防治羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌病，能夠?qū)α_非魚(yú)抗無(wú)乳鏈球菌不同血清型產(chǎn)生特異性的保護(hù)性，疫苗對(duì)羅非魚(yú)抗無(wú)乳鏈球菌的免疫保護(hù)率達(dá)到56.35％±8.09％。

相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的重組CBP亞單位疫苗具有明顯的優(yōu)勢(shì)，現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌的防治仍主要依賴傳統(tǒng)藥物，在養(yǎng)殖羅非魚(yú)中新型抗無(wú)乳鏈球菌病疫苗的開(kāi)發(fā)是近些年的研究熱點(diǎn)，但是主要集中于全菌滅活疫苗和減毒活疫苗；這兩種疫苗雖然制備方法簡(jiǎn)便，但是滅活疫苗在水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物中的使用需要大劑量、多次免疫接種，而減毒活疫苗的儲(chǔ)藏和運(yùn)輸條件要求極高，有效期較短，且存在返毒危險(xiǎn)；因此這兩種疫苗均可能引起較大的毒副反應(yīng)。亞單位疫苗即由具免疫活性的致病菌蛋白所制成的疫苗，本發(fā)明中的重組CBP亞單位疫苗僅含一種致病菌蛋白質(zhì)，因而能消除許多無(wú)關(guān)抗原所誘發(fā)的抗體，減少疫苗帶來(lái)的副反應(yīng)以及因疫苗引起的其他疾病，安全性可靠。并且，與全菌滅活疫苗和減毒活疫苗相比，本發(fā)明的重組CBP疫苗不存在血清型特異性，可對(duì)抗不同血清型的無(wú)乳鏈球菌，適用范圍更廣。因此，在預(yù)防羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌方面具有良好的應(yīng)用前景。

而且，本發(fā)明的蛋白疫苗制備方法采用原核表達(dá)系統(tǒng)，制備方法簡(jiǎn)單，流程簡(jiǎn)潔快速、制備過(guò)程安全、表達(dá)成本低、適于大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用。

附圖說(shuō)明

圖1為羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌Cbp基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；其中，泳道M：DL2000 Marker；泳道1：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖2為羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌CBP蛋白純化SDS-PAGE圖；M為蛋白Marker；Lane 1為蛋白超聲液；Lane 2為流出液；Lane 3為Wash buffer的洗脫結(jié)果；Lane 4為50mM咪唑濃度的Elution buffer的洗脫結(jié)果；Lane 5-9為100mM咪唑濃度的Elution buffer的洗脫結(jié)果；Lane 10-11分別為200mM、250mM咪唑濃度的Elution buffer的洗脫結(jié)果。

圖3為Western Blot檢測(cè)CBP蛋白的免疫原性；M為蛋白Marker；

圖4為重組CBP蛋白疫苗免疫羅非魚(yú)后攻毒的存活曲線。橫坐標(biāo)為攻毒后天數(shù)；縱坐標(biāo)為存活率。

圖5為重組CBP蛋白Elisa檢測(cè)血清抗體滴度；橫坐標(biāo)為初免后第2、4周的血清；縱坐標(biāo)為抗體滴度，抗體滴度用產(chǎn)生陽(yáng)性結(jié)果的最大稀釋倍數(shù)表示。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合說(shuō)明書(shū)附圖和具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說(shuō)明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。

除非特別說(shuō)明，以下實(shí)施例所用試劑和材料均為市購(gòu)。

實(shí)施例1制備羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌重組CBP蛋白

1、引物設(shè)計(jì)：

以羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌為模板，設(shè)計(jì)一對(duì)包含限制性內(nèi)切酶的引物CBP-F和CBP-R，序列如下：

引物CBP-F(序列如序列3所示)：

5’-GGGGGGTCTCTAGTGGATCAAACTACATCGGTTCAA-3’

引物CBP-R((序列如序列4所示))：

5’-GCCGGGTCTCGTGGGAATTTCAATATAGCGACGAAT-3’

2、Cbp基因克隆

(1)PCR擴(kuò)增Cbp基因

提取羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌基因組DNA，以基因組DNA為模板，以上述引物對(duì)CBP-F和CBP-R進(jìn)行PCR反應(yīng)。

PCR反應(yīng)體系為：25μl反應(yīng)體系含50ng模板DNA(基因組DNA)，2.5μl 10×PCR Buffer(Mg+)，2μl dNTP Mixture(2.5mM)，1μl CBP-F，1μl CBP-R，0.125μl rTaq(5U/μl)，加滅菌蒸餾水至25μl。

PCR條件為：94℃預(yù)變性3min；然后94℃變性30s，53℃退火35s，72℃延伸2min下作用30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸8min；4℃保溫。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖如附圖1所示。M表示DL2000 DNA marker；1表示PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

Cbp基因核苷酸序列如序列1所示。

(2)構(gòu)建CBP克隆菌株

上述PCR產(chǎn)物回收純化后與pET28a載體連接，37℃下連接30min。

連接體系為：20μl體系內(nèi)含3μl PCR產(chǎn)物，1μl Vector，2μl 10×Buffer，1μl Enzyme Mix A，13μl ddH₂O。(注：連接體系所用載體、酶、緩沖液均來(lái)自斯丹賽生物技術(shù)公司‘如意連試劑盒’)

將10μl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入100μl大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，冰浴30min，42℃熱激60s，冰浴5min；然后加入500μl LB液體培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)45h；4000rpm離心5min，留100μl吹打沉淀菌液，將混合液加入含有50μg/ml卡那青霉素(Kan+)的LB固體培養(yǎng)基上，涂布均勻后在37℃培養(yǎng)過(guò)夜。

隨機(jī)挑取平板上的10個(gè)單菌落鑒定，鑒定結(jié)果為陽(yáng)性的單菌落即為CBP克隆菌株。

3、構(gòu)建構(gòu)建CBP表達(dá)菌株

提取CBP克隆菌株質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒pET28a-CBP轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)卡那青霉素抗性篩選，挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定，篩選出陽(yáng)性克隆細(xì)胞，即為含重組質(zhì)粒pET28a-CBP的工程菌。

4、純化重組CBP蛋白——重組質(zhì)粒pET28a-CBP在E.coli BL21(DE3)中的表達(dá)和純化：

(1)將含有重組質(zhì)粒pET28a-CBP的E.coli BL21(DE3)單菌落接種于5ml含有50μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃下200r/min震蕩培養(yǎng)10h，將5ml菌液加入500ml含有50μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，1∶100擴(kuò)大培養(yǎng)2h，至OD600約為0.6。向菌液中加入終濃度為1mmol/l的IPTG，16℃震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。離心收集過(guò)夜誘導(dǎo)的菌體，Lysis Buffer重懸，冰浴30min后超聲破碎30min，離心收集上清。用Ni-NTA純化上清液中的重組CBP蛋白，先用含有20mmol/l咪唑的洗脫液洗去雜質(zhì)，再用含100mmol/l咪唑的洗脫液洗脫重組蛋白。洗脫的重組蛋白用10KDa超濾管超濾，除去洗脫液中的咪唑，得到純化的重組CBP蛋白，即為所述羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌重組CBP蛋白，其氨基酸序列如序列2所示。

(2)蛋白純化結(jié)果如附圖2所示。M為蛋白Marker；Lane 1為蛋白超聲液；Lane 2為流出液；Lane 3為Wash buffer的洗脫結(jié)果；Lane 4為50mM咪唑濃度的Elution buffer的洗脫結(jié)果；Lane 5-9為100mM咪唑濃度的Elution buffer的洗脫結(jié)果；Lane 10-11分別為200mM、250mM咪唑濃度的Elution buffer的洗脫結(jié)果。

5、Western Blot檢測(cè)

使用感染無(wú)乳鏈球菌THN菌株的兔血清作為一抗，檢測(cè)重組蛋白CBP的免疫原性，具體操作如下：

(1)電泳結(jié)束后將分離膠割至合適的大小，放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡10min。

(2)膜處理：預(yù)先裁好與分離膠同樣大小的濾紙和膜，放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡10min。

(3)轉(zhuǎn)膜：在陰極電極板上從下至上依次疊放好層濾紙、膜、凝膠、層濾紙，保證其精確對(duì)齊無(wú)氣泡，然后用100mA恒流轉(zhuǎn)膜1h。

(4)用TBST洗膜，平穩(wěn)搖動(dòng)，5min×3次。

(5)加入包被液，4℃過(guò)夜。

(6)棄包被液，用TBST洗膜，5min×3次。

(7)加入一抗(稀釋后的兔血清)，37℃孵育3h。

(8)棄一抗，用TBST分別洗膜，平穩(wěn)搖動(dòng)，5min×3次。

(9)加入二抗羊抗兔(用TBS按1∶5000稀釋)，平穩(wěn)搖動(dòng)，室溫孵育2h。

(10)棄二抗，用TBST分別洗膜，平穩(wěn)搖動(dòng)，5min×3次。

(11)DAB顯色：將膜放入新鮮配制的DAB顯色液中避光顯色至出現(xiàn)條帶時(shí)放入ddH₂O終止反應(yīng)。

結(jié)果如圖3所示，在目的條帶大小處有條帶，證明重組蛋白CBP具有良好的免疫原性。

實(shí)施例2制備羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌重組CBP蛋白疫苗

將實(shí)施例1獲得的純化的重組CBP蛋白用滅菌PBS稀釋至1mg/ml，與弗氏完全及不完全佐劑按1∶1混合均勻，制備成亞單位疫苗。

取1ml制備好的疫苗，在3000×g下離心5min，疫苗無(wú)分層現(xiàn)象，則可用于后續(xù)免疫。

實(shí)施例3羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌重組CBP蛋白疫苗免疫試驗(yàn)

1、免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)

(1)尼羅羅非魚(yú)購(gòu)自廣州市中心溝水產(chǎn)養(yǎng)殖發(fā)展有限公司，規(guī)格為30±5.0g，實(shí)驗(yàn)前暫養(yǎng)兩周。

(2)免疫實(shí)驗(yàn)時(shí)，將羅非魚(yú)隨機(jī)分為3組，即PBS組、PBS+佐劑組、CBP疫苗組。每組15尾，每組設(shè)三個(gè)平行。

CBP組和佐劑組分別腹腔注射100μl與弗氏佐劑等體積混合的重組抗原CBP以及PBS，PBS組注射100μl的滅菌PBS。

2、免疫程序

對(duì)羅非魚(yú)進(jìn)行兩次免疫，初次免疫使用弗氏完全佐劑，加強(qiáng)免疫使用弗氏不完全佐劑亞單位疫苗。

初次免疫時(shí)，每尾魚(yú)腹腔注射100μl疫苗。兩周后，每尾魚(yú)腹腔注射100μl疫苗進(jìn)行加強(qiáng)免疫。

初免后第2和4周，每組選3尾魚(yú)采血，室溫放置2h后，4℃、8000×rpm離心10min，收集上清，分裝后-80℃保存，用于免疫指標(biāo)的測(cè)定。

3、免疫保護(hù)率測(cè)定

(1)加強(qiáng)免疫兩周后，用LD50劑量進(jìn)行細(xì)菌攻毒實(shí)驗(yàn)，每尾魚(yú)腹腔注射100ul無(wú)乳鏈球菌菌液(1×10⁸CFU/ml)。攻毒后，每天觀察羅非魚(yú)的狀況，及時(shí)撈出死魚(yú)，并記錄14天內(nèi)的死亡情況。連續(xù)觀察14天，停止觀察，實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

根據(jù)下述公式計(jì)算羅非魚(yú)的相對(duì)保護(hù)率(RPS)：

RPS＝(1-免疫組累積死亡率/對(duì)照組累積死亡率)×100％。

(2)攻毒后羅非魚(yú)死亡情況如圖4所示。

結(jié)果顯示，初次免疫后第四周，用無(wú)乳鏈球菌進(jìn)行攻毒。羅非魚(yú)從攻毒后第1天開(kāi)始就出現(xiàn)死亡，死亡主要集中在攻毒后的前3天。

此外，攻毒羅非魚(yú)表現(xiàn)出一些患鏈球菌病的臨床癥狀，如眼球突出且渾濁，離群獨(dú)游和身體蜷曲等。

重組CBP蛋白作為抗羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌病疫苗用于注射免疫可獲得56.35％±8.09％的免疫保護(hù)率。

4、Elisa檢測(cè)抗體滴度

檢測(cè)方法

(1)包被：用包被液稀釋重組CBP蛋白至200μg/ml，加入96孔酶標(biāo)板內(nèi)，100μl/孔，4℃包被過(guò)夜。

(2)洗滌：棄去96孔中的包被液，用低鹽Buffer清洗5次，3min×5次，每次250μl/孔，移液槍輕輕吹打后，用200rpm的速度緩和振蕩，拍干。

(3)封閉：加入1％BSA進(jìn)行封閉，250μl/孔，22℃，封閉2h。按上述條件進(jìn)行洗滌，拍干。

(4)一抗反應(yīng)：將采集的羅非魚(yú)抗血清用PBS按2倍逐級(jí)稀釋(如稀釋倍數(shù)：2、2²、2³、2⁴、2⁵、2⁶、2⁷、2⁸等)，按100μl/孔加入，22℃，孵育3h。按上述條件進(jìn)行洗滌，拍干。

(5)二抗反應(yīng)：將鼠抗魚(yú)IgM用PBS稀釋10倍，按100μl/孔加入，22℃，孵育2h；洗滌，拍干。

(6)三抗反應(yīng)：將羊抗鼠IgG-HRP標(biāo)記的抗體用PBS稀釋5000倍，按100μl/孔加入，22℃孵育2h；洗滌，拍干。

(7)顯色：將TMB底物溶液按100μl/孔加入，室溫孵育；10min后，加入反應(yīng)終止液50μl/孔終止反應(yīng)。

(8)讀數(shù)：將此96酶標(biāo)板置于酶標(biāo)儀上進(jìn)行讀數(shù)，測(cè)定450nm處的吸光值，即OD₄₅₀。

若試驗(yàn)組的讀數(shù)大于或等于對(duì)照組的兩倍，則記為陽(yáng)性，否則為陰性?？贵w滴度以陽(yáng)性結(jié)果的最大稀釋倍數(shù)表示。

結(jié)果如圖5所示。免疫后血清抗體效價(jià)出現(xiàn)不同程度的增長(zhǎng)，且在第四周達(dá)到峰值，為1∶8192。