本發(fā)明屬于油菜分子育種技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及包含甘藍(lán)型油菜早花基因Bnflc.a2及其晚花等位基因BnFLC.A2的兩條DNA片斷的分離克隆、功能驗(yàn)證及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

甘藍(lán)型油菜(Brassica napus L.)是一種異源四倍體作物，約7500年前由二倍體作物白菜(B.rapa)和甘藍(lán)(B.oleracea)的自然雜交并通過天然加倍而形成(Chalhoub et al 2014)。甘藍(lán)型油菜(B.napus)是一種重要的油料作物，在我國廣泛種植。適時(shí)開花不僅影響著甘藍(lán)型油菜的產(chǎn)量和品質(zhì)，也決定了其對生態(tài)區(qū)域的適應(yīng)性，因此開花期是甘藍(lán)型油菜育種的重要目標(biāo)性狀之一。根據(jù)甘藍(lán)型油菜的春化需求劃分為冬性油菜、半冬性油菜和春性油菜，其中半冬性油菜主要分布在我國的長江流域，而春性油菜則主要分布于甘肅，青海，內(nèi)蒙等省。目前，在實(shí)際生產(chǎn)中甘藍(lán)型油菜和水稻、棉花等作物茬口矛盾突出，導(dǎo)致甘藍(lán)型油菜種植面積大幅度下降，菜籽油的自給率嚴(yán)重不足。解決這一問題的關(guān)鍵就是縮短甘藍(lán)型油菜的生育期，開展甘藍(lán)型油菜早熟育種。前人研究表明甘藍(lán)型油菜早花和早熟呈現(xiàn)出顯著正相關(guān)，通過早花材料的選擇可以選育出早熟油菜(Campbell and Kondra 1978；高永同1979；劉后利1985；Amiri-Oghan et al 2009)。因此，調(diào)控甘藍(lán)型油菜適時(shí)開花，除了對其產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要意義之外還能夠避免甘藍(lán)型油菜同稻、棉爭地的現(xiàn)狀。

目前，甘藍(lán)型油菜開花期研究仍集中在開花期QTL的定位工作上，成功通過圖位克隆技術(shù)克隆甘藍(lán)型油菜開花期基因的報(bào)道還很少。Ferreira等(1995)在很早就利用冬油菜Major和春油菜Stellar構(gòu)建了DH群體，進(jìn)行了在春化處理?xiàng)l件下和沒有春化處理情況下的花期QTL的定位。他們共檢測到3個(gè)QTL位點(diǎn)，其中位于LG9(N2連鎖群)上的QTL位點(diǎn)在不春化、春化處理4周以及春化處理8周這三種條件下均和該群體花期顯著相關(guān)；其中春化處理8周條件下，該位點(diǎn)可以解釋表型變異的28％。Butruille等(1999)利用德國冬油菜栽培品種Ceres和澳大利亞春油菜品種Marno以及加拿大春油菜品種Westar構(gòu)建了多個(gè)IBLs群體，他們用這些IBLs群體檢測到多個(gè)與花期顯著相關(guān)的位點(diǎn)，其中位于N2連鎖群上的一個(gè)QTL位點(diǎn)可以解釋表型變異的22.6％，該位點(diǎn)和Ferreira等人檢測到的位于LG9上的花期QTL位點(diǎn)在同一個(gè)區(qū)間；此外，他們還檢測到一個(gè)位于N12連鎖群上的主效花期位點(diǎn)，該位點(diǎn)可以解釋表型變異的26％。Raman等(2016)通過搜集182份甘藍(lán)型油菜品種，在三種不同的環(huán)境下(大田環(huán)境、溫室以及人工控制的環(huán)境)記錄花期表型然后進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，他們共發(fā)現(xiàn)69個(gè)SNPs位點(diǎn)和花期表型顯著相關(guān)，而且這些位點(diǎn)可以重復(fù)的檢測到。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明人首次通過圖位克隆技術(shù)成功克隆了甘藍(lán)型油菜開花基因BnFLC.A2，而且通過比較測序，遺傳互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)以及表達(dá)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了BnFLC.A2是一種甘藍(lán)型油菜晚花基因。

此外，通過雙親比較測序，發(fā)明人在甘藍(lán)型油菜中第一次發(fā)現(xiàn)了一個(gè)包含約2.8kb長片段插入的Bnflc.a2基因。通過Bnflc.a2基因的序列分析及表達(dá)分析證實(shí)該基因是一個(gè)功能缺失型突變。該基因的功能喪失導(dǎo)致了開花時(shí)間提早。通過自然群體分析表明Bnflc.a2中的長片段插入導(dǎo)致該拷貝功能喪失是影響甘藍(lán)型油菜開花時(shí)間自然變異的重要因素，說明該基因具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

因此，本發(fā)明的目的在于從甘藍(lán)型油菜中分離克隆早花基因Bnflc.a2以及晚花等位基因BnFLC.A2，并對這兩個(gè)基因進(jìn)行功能驗(yàn)證及應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，發(fā)明人通過大量試驗(yàn)研究并不懈努力，最終從甘藍(lán)型油菜中分離得到一種甘藍(lán)型油菜晚花基因BnFLC.A2，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。

根據(jù)本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)手段，本發(fā)明人可以采用已克隆的多核苷酸序列作為探針，從基因組或cDNA文庫中篩選得到本發(fā)明的基因或同源基因。同樣，采用PCR技術(shù)也可以從基因組和cNDA中擴(kuò)增得到本發(fā)明的基因或任何一段感興趣的核苷酸序列或與其同源的核苷酸序列。因此，在嚴(yán)格條件下與序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列雜交且編碼相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列也屬于一種甘藍(lán)型油菜晚花基因序列。

進(jìn)一步地，上述任一一種核苷酸序列經(jīng)核苷酸添加、刪除、替換、修飾的保守性突變而獲得的保守性變異體也屬于甘藍(lán)型油菜晚花基因序列。

另外，本發(fā)明還提供了一種表達(dá)甘藍(lán)型油菜晚花基因BnFLC.A2的蛋白，其氨基酸序列由上述任一一種核苷酸序列編碼。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述表達(dá)甘藍(lán)型油菜晚花基因BnFLC.A2的蛋白，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。

再者，本發(fā)明還提供了一種甘藍(lán)型油菜早花等位基因Bnflc.a2，其核苷酸序列選自以下的任意一種：

(1)序列表中SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；

(2)與(1)限定的核苷酸序列經(jīng)核苷酸添加、刪除、替換、修飾的保守性突變而獲得的保守性變異體。

最后，本發(fā)明還提供了上述的甘藍(lán)型油菜晚花基因BnFLC.A2在油菜生育期改良中的應(yīng)用。以及，上述的甘藍(lán)型油菜早花等位基因Bnflc.a2在油菜早花、早熟改良中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明首次提供了一種甘藍(lán)型油菜晚花基因BnFLC.A2和一種甘藍(lán)型油菜早花基因Bnflc.a2，早花隱性基因Bnflc.a2是BnFLC.A2基因的功能喪失突變體。本發(fā)明開發(fā)早花基因的功能標(biāo)記，通過甘藍(lán)型油菜495份自然群體基因型及花期表型分析發(fā)現(xiàn)，Bnflc.a2基因在自然群體中對開花期的影響在七個(gè)環(huán)境下均表現(xiàn)出顯著水平，說明Bnflc.a2中的長片段插入導(dǎo)致該拷貝功能喪失是影響甘藍(lán)型油菜開花時(shí)間自然變異的重要因素。利用該基因本身的序列設(shè)計(jì)功能標(biāo)記進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇選育早花材料進(jìn)而培育出早花、早熟油菜，具有準(zhǔn)確、高效、經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)。

附圖說明

圖1：本發(fā)明鑒定、分離、克隆并驗(yàn)證甘藍(lán)型油菜早花基因Bnflc.a2以及晚花等位基因BnFLC.A2的技術(shù)流程圖。

圖2：BnFLC.A2基因效應(yīng)下的雙親開花期表型示意圖。圖2A為播種后第99天拍攝的L06、F1和L04表型圖；圖2B為播種后第136天拍攝的L06、F1和L04表型圖；標(biāo)尺，10cm。

圖3：NIL-F2群體開花期表型分布圖。圖3A為冬油菜環(huán)境下NIL-F2開花期表型分布圖；圖3B為春油菜環(huán)境下NIL-F2開花期表型分布圖。

圖4：特異標(biāo)記STA2-18鑒定白菜、甘藍(lán)、雙親及NIL-F2小群體。檢測樣品依次為22份白菜、11份甘藍(lán)、L06、L04、NIL-F2(15-43)及另外兩份甘藍(lán)型油菜R15和R11。其中NIL-F2小群體的花期表型數(shù)據(jù)在目標(biāo)帶下面，-表示數(shù)據(jù)缺失；M表示DL2000marker。

圖5：覆蓋甘藍(lán)型油菜開花期基因BnFLC.A2區(qū)段的物理圖譜。圖中分子標(biāo)記下面的數(shù)字表示在近等基因系群體中檢測到的BnFLC.A2基因位點(diǎn)與分子標(biāo)記之間發(fā)生重組交換的單株數(shù)目。

圖6：雙親比較測序目標(biāo)基因BnFLC.A2。圖6A和圖6B分別表示引物組合STA2-6L/STA2-6R，STA2-55L/STA2-1R，STA2-1L/STA2-42R，STA2-8L/STA2-8R的位置示意圖及該四對引物組合在雙親L04和L06及另外兩個(gè)材料R15和R11中擴(kuò)增圖；以上四對引物是根據(jù)甘藍(lán)型油菜Darmor-bzh的參考基因組序列將目標(biāo)候選基因BnFLC.A2及其上下游區(qū)間設(shè)計(jì)成四段進(jìn)行擴(kuò)增；圖6C和圖6D分別表示引物組合STA2-13L/STA2-17R和STA2-17L/STA2-13R的位置示意圖及該兩對引物組合在雙親L04和L06及另外兩個(gè)材料R15和R11中擴(kuò)增圖；圖6C藍(lán)色箭頭指的是目標(biāo)帶，而紅色箭頭指的是包含長片段插入的條帶；圖6E和圖6F分別表示引物組合STA2-55L/STA2-46R，STA2-54L/STA2-54R STA2-45L/STA2-1R，STA2-1L/STA2-42R的位置示意圖及該引物組合在雙親L04和L06中擴(kuò)增圖；以上四對引物是根據(jù)L06中測得的Bnflc.a2基因序列設(shè)計(jì)成四段進(jìn)行擴(kuò)增。M1代表DL2000marker，M2代表1Kb DNA ladder marker。

圖7：轉(zhuǎn)基因所用的功能性載體圖pFGC5941骨架。

圖8：T1代株系及雙親花期表型示意圖及花期數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)圖。圖8A為雙親L06，L04以及轉(zhuǎn)基因T1代陽性和陰性單株表型；圖8B為雙親L06，L04以及4個(gè)單拷貝株系BnA2-2，BnA2-10，BnA2-14和BnA2-37的T1代陽性和陰性單開花期數(shù)據(jù)表型。–和+分別代表單拷貝株系T1代中的陰性單株和陽性單株。花期數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。***表示P<0.0001。標(biāo)尺，10cm。

圖9：候選基因啟動(dòng)子分析載體的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖10：擬南芥T2代遺傳轉(zhuǎn)化植株花蕾GUS染色結(jié)果。圖10A-10D為野生型對照，圖10E-10H為BnFLC.A2基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化苗各部位染色GUS染色結(jié)果，圖10I-10L為Bnflc.a2基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化苗各部位染色GUS染色結(jié)果。

圖11：冬油菜環(huán)境下BnFLC.A2基因和Bnflc.a2基因的表達(dá)圖片，使用的材料是L04和L06。圖11A為RT-PCR(32個(gè)循環(huán))檢測L04和L06中不同時(shí)期BnFLC.A2基因的表達(dá)；圖11B，圖11C和圖11D分別表示qRT-PCR分析L04和L06中不同時(shí)期BnFLC.A2，BnFT和BnSOC1的表達(dá)情況。樣品1-8分別表示播種后第34d，76d，83d，105d，124d，132d，150d和174d時(shí)取樣。BnACTIN7基因的表達(dá)作為對照。每個(gè)取樣點(diǎn)均有三次生物學(xué)重復(fù)(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM))。

圖12：Bnflc.a2基因的功能標(biāo)記分析自然群體中開花期變異。根據(jù)Bnflc.a2基因型分組，開花期差異在七個(gè)環(huán)境下達(dá)到顯著水平。Bnflc.a2-表示被檢測的材料不包含Bnflc.a2基因，Bnflc.a2+表示被檢測的材料包含Bnflc.a2基因。開花天數(shù)是用開花期均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(s.e.m.)表示。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步定義本發(fā)明，并描述了本發(fā)明在上述前期工作基礎(chǔ)上分離克隆包含有BnFLC.A2基因以及Bnflc.a2基因完整編碼區(qū)段的DNA片段和驗(yàn)證這兩個(gè)基因的方法(技術(shù)路線如圖1所示)。但是本發(fā)明能夠以很多不同于在此描述的其它方式來實(shí)施，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不違背本發(fā)明內(nèi)涵的情況下做類似改進(jìn)，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求書為準(zhǔn)，不受下面公開的具體實(shí)施的限制。下述所使用的實(shí)驗(yàn)方法若無特殊說明，均為本技術(shù)領(lǐng)域現(xiàn)有的常規(guī)方法和技術(shù)，所使用的試劑配方或材料，均通過商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1：構(gòu)建BnFLC.A2基因的近等基因系并初步定位該基因

1.實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)所用的材料為甘藍(lán)型油菜高世代近等基因系材料：晚花材料L04和早花材料L06(圖2)。材料來源：利用兩個(gè)甘藍(lán)型油菜純系材料HZ396E和Y106作為原始親本雜交，并用HZ396E作為輪回親本連續(xù)回交五代之后自交得到高世代分離群體，發(fā)現(xiàn)花期分離，我們從中選擇一個(gè)早花純合型材料，并命名為L06和一個(gè)晚花純合型材料，并命名為L04。冬油菜環(huán)境下多年田間觀察該NILs材料花期穩(wěn)定，其中早花材料L06播種后93天左右開花，而晚花親本L04播種后135天左右開花，二者花期差異達(dá)到42天。利用L04和L06作為親本雜交并自交構(gòu)建NIL-F2分離群體，用于該開花基因的定位。

2.NIL-F2分離群體花期表型考察

通過2014年冬油菜環(huán)境和2015年春油菜環(huán)境條件下NIL-F₂群體的開花期表型分布圖進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)：2014年冬油菜環(huán)境下，NIL-F2群體花期分離經(jīng)卡方檢測表明晚花和早花分離符合3:1的分離比(χ²＝3.20，P＝0.064)(圖3A)，2015年春油菜環(huán)境下，NIL-F2群體花期分離經(jīng)卡方檢測表明晚花和早花分離符合3:1的分離比(χ²＝1.16，P＝0.24)(圖3B)。各NIL-F₂群體開花期表型均符合一對主基因控制的孟德爾遺傳定律，說明該群體中開花期表型是由單個(gè)基因控制，因此，可以通過構(gòu)建大群體對該位點(diǎn)進(jìn)行精細(xì)定位，進(jìn)而確定候選基因。

3.初步定位晚花基因BnFLC.A2

為了確定該開花期QTL的位置，我們從本實(shí)驗(yàn)室公共引物中挑選了共計(jì)400對SSR引物，這些引物均勻分布在甘藍(lán)型油菜19條連鎖群上。首先我們利用雙親篩選有多態(tài)性的引物，然后用一個(gè)NIL-F₂分離群體來驗(yàn)證這些引物是否與開花期表型連鎖。通過這一策略我們發(fā)現(xiàn)SRA2-6，SSA2-2，SSA2-6，SRA2-31這四對引物與該NIL-F₂分離群體的花期表型連鎖，花期差異均達(dá)到極顯著水平(表1)，以上四對引物序列如表2所示。針對該NIL-F₂分離群體，我們利用Mapmaker3.0進(jìn)行局部遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建。同時(shí)結(jié)合群體表型利用QTL 1.1軟件進(jìn)行QTL掃描。結(jié)果表明該花期QTL位點(diǎn)位于SSA2-2和SSA2-6之間，該位點(diǎn)解釋了96.4％的表型變異，加性效應(yīng)為18.96天，LOD值為58.1，說明該群體中花期性狀只受一對基因控制。

表1 NIL-F₂分離群體驗(yàn)證連鎖標(biāo)記

表中花期均值表示該F₂群體中標(biāo)記基因型和L06相同的所有單株花期的平均值，以及標(biāo)記基因型和L04相同的所有單株花期的平均值。開花期是用花期均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

表2連鎖標(biāo)記引物序列

通過上述四對標(biāo)記的序列比對發(fā)現(xiàn)該開花基因更可能位于A2染色體(表3，表4)，此外，我們同時(shí)開發(fā)了一個(gè)能夠特異區(qū)分A2/C2的SCAR標(biāo)記STA2-18(圖4)，進(jìn)一步驗(yàn)證目標(biāo)基因位于A2染色體上，本研究中該位點(diǎn)命名為qFT-A2。我們利用兩側(cè)最遠(yuǎn)的標(biāo)記SRA2-6和SRA2-31的序列將qFT-A2限定在對應(yīng)白菜A2染色體約1Mb的物理區(qū)間內(nèi)。

表3連鎖標(biāo)記引物序列與白菜及甘藍(lán)基因組比對情況

表中位置表示左引物序列比對的位置，-表示引物沒有比對到基因組上。

表4連鎖標(biāo)記引物序列與甘藍(lán)型油菜基因組比對情況

表中位置表示左右引物序列比對的位置，*表示引物沒有比對到基因組上。

實(shí)施例2：精細(xì)定位晚花基因BnFLC.A2

1.分子標(biāo)記的開發(fā)

根據(jù)初定位結(jié)果，我們針對兩側(cè)最遠(yuǎn)的標(biāo)記SRA2-6和SRA2-31之間的區(qū)間，以白菜基因組A2染色體序列為參考序列，針對共約1Mb的物理區(qū)間開發(fā)了119對SSR標(biāo)記。通過雙親L06和L04篩選有多態(tài)性的標(biāo)記即可用于大群體基因型分析，通過標(biāo)記篩選，共篩選到有多態(tài)性的SSR標(biāo)記28對。從這28對SSR標(biāo)記中挑選出均勻分布在目標(biāo)區(qū)間且?guī)洼^好的10對SSR標(biāo)記用于后續(xù)群體分析以及交換單株基因型的鑒定。這些標(biāo)記的序列信息見表5。

表5精細(xì)定位標(biāo)記序列

2.BnFLC.A2的精細(xì)定位及候選基因預(yù)測

為了進(jìn)一步縮小目標(biāo)區(qū)間，2014年10月初我們在武漢冬油菜環(huán)境下又種植了2065株的NIL-F₂大群體，用于qFTA2-1位點(diǎn)的進(jìn)一步精細(xì)定位。和前面的思路一樣，首先我們利用兩側(cè)標(biāo)記SRA2-6和SRA2-31分析該群體的標(biāo)記基因型，共鑒定出了66株可能的交換單株；其中標(biāo)記SRA2-6一側(cè)有14株，標(biāo)記SRA2-31一側(cè)有52株(圖5A)；接著將該區(qū)間的其他標(biāo)記直接檢測這66株交換單株，經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)這66株交換單株只有14種交換類型(圖5B)；最終發(fā)現(xiàn)在標(biāo)記SRA2-77一側(cè)有2個(gè)交換單株，標(biāo)記SRA2-114一側(cè)有1株交換單株；而標(biāo)記SRA2-80，SRA2-81，STA2-18，SSA2-6和SRA2-86均和目標(biāo)基因共分離(圖5A和5B)。2015年5月我們將這66株交換單株中共計(jì)14種交換類型各選1株的自交后代送往甘肅種植，并記錄花期表型進(jìn)行交換單株的后代驗(yàn)證，其他交換單株于2015年10月種植于武漢并記錄分離情況。最終通過交換單株后代驗(yàn)證將qFT-A2位點(diǎn)限定在標(biāo)記SRA2-77和SRA2-114之間(圖5B)，序列比對分析表明，該區(qū)間參照甘藍(lán)型油菜基因組A2染色體約86kb的物理區(qū)間，該區(qū)間內(nèi)包含23個(gè)候選基因(圖5C)。為了進(jìn)一步縮小候選基因的范圍，我們將這23個(gè)候選基因?qū)?yīng)的白菜和擬南芥同源基因全部標(biāo)注出來，并進(jìn)行功能注釋，分析發(fā)現(xiàn)該區(qū)間僅有一個(gè)候選基因BnaA02g00370D基因是擬南芥中開花基因AT5G10140(FLC)的同源基因(圖5C)。FLC基因是擬南芥春化途徑中調(diào)控開花的關(guān)鍵基因，因此，我們初步確定目標(biāo)候選基因?yàn)閿M南芥春化途徑過程中的FLC基因，在本研究中將其命名為BnFLC.A2。

實(shí)施例3：比較測序確定BnFLC.A2等位基因間的自然變異

為了進(jìn)一步確認(rèn)候選基因，我們根據(jù)甘藍(lán)型油菜A2染色體目標(biāo)區(qū)間候選基因BnaA02g00370D基因及其上下游的參考序列我們設(shè)計(jì)了特異引物，分別擴(kuò)增目標(biāo)候選基因BnFLC.A2編碼區(qū)及其上游啟動(dòng)子區(qū)和下游區(qū)間。我們用這些引物分析了雙親L04和L06，其中標(biāo)記STA2-6L/STA2-6R擴(kuò)增的是BnFLC.A2基因起始密碼子上游一直到上一個(gè)基因的最后一個(gè)外顯子，理論大小約2.3kb；STA2-8L/STA2-8R擴(kuò)增的是BnFLC.A2基因終止密碼子下游一直到下一個(gè)基因的第一個(gè)外顯子，理論大小約2.4kb(圖6A)；針對BnFLC.A2編碼區(qū)我們設(shè)計(jì)了兩對引物擴(kuò)增，分別是STA2-55L/STA2-1R(理論大小約1.6kb)，STA2-1L/STA2-42R(理論大小約1.9kb)(圖6A)。我們利用各對引物進(jìn)行擴(kuò)增雙親L04和L06時(shí)發(fā)現(xiàn)：和晚花親本L04相比，早花親本L06中BnFLC.A2編碼區(qū)前半段STA2-55L/STA2-1R沒有擴(kuò)增產(chǎn)物(圖6B)，說明早花親本L06中BnFLC.A2編碼區(qū)前半段序列有變異，因此沒有擴(kuò)增產(chǎn)物。而其他三對引物組合在雙親中均能擴(kuò)增出目標(biāo)帶，我們將雙親L04和L06所有能擴(kuò)增出的片段進(jìn)行了TA克隆測序。對L04來說，將四段序列進(jìn)行拼接進(jìn)而得到了該材料中BnFLC.A2拷貝的序列。針對早花親本L06，為了找到變異所在，我們改變了策略，將目標(biāo)基因BnFLC.A2編碼區(qū)以及上下游共約8kb的區(qū)間分成兩段長片段，分別設(shè)計(jì)了引物STA2-13L/STA2-17R和STA2-17L/STA2-13R，理論擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別是3.8kb和4.2kb(圖6C)。擴(kuò)增結(jié)果發(fā)現(xiàn)，早花親本L06中引物組合STA2-13L/STA2-17R擴(kuò)增出一條長約6.6kb的片段；而L04中STA2-13L/STA2-17R引物組合擴(kuò)增產(chǎn)物除了目標(biāo)3.8kb的條帶，也擴(kuò)增出了一條較弱的約6.6kb的片段(圖6D)。理論上引物組合STA2-13L/STA2-17R擴(kuò)增片段只有3.8kb大小，而在L06中卻擴(kuò)增出一條6.6kb的片段，因此說明這段序列存在較大的變異。L04中也有一條與L06大小相近的6.6kb的條帶，該條帶很弱，回收產(chǎn)物濃度太低，因此沒有對其進(jìn)行克隆測序。而針對L06中6.6kb大小的擴(kuò)增產(chǎn)物，我們按照同源重組一步法克隆的要求，通過同源重組酶將該片段連接到載體PFGC5941上面，然后進(jìn)行克隆轉(zhuǎn)化，并選擇陽性克隆L06-13L/17R-01和L06-13L/17R-03這兩個(gè)克隆進(jìn)行測序。利用同樣的方法把L06中另外一段片段(4.2kb)STA2-17L/STA2-13R克隆轉(zhuǎn)化之后進(jìn)行測序。最終將這兩部分序列拼接進(jìn)而得到L06中目標(biāo)候選基因編碼區(qū)及其上下游的序列，我們把L06中的等位基因型記為Bnflc.a2(圖6E)。在完成L06中Bnflc.a2及其上下游序列的拼裝之后，有了該拷貝完整的序列作為參考，我們又在該序列的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)引物STA2-55L/STA2-46R(1.577kb)，STA2-54L/STA2-54R(1.762kb)，STA2-45L/STA2-1R(1.264kb)結(jié)合之前的引物組合STA2-1L/STA2-42R(1.954kb)共四對引物將該拷貝分成四段分別在L04和L06中進(jìn)行擴(kuò)增(圖6F)，然后將擴(kuò)增片段回收并進(jìn)行TA克隆測序，得到的序列分別進(jìn)行拼接之后發(fā)現(xiàn)L04中得到的Bnflc.a2拷貝的序列和L06中Bnflc.a2拷貝的序列完全一致。比較測序所用的引物序列信息見表6。

表6比較測序引物序列

實(shí)施例4：BnFLC.A2基因的轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)

1.轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建

根據(jù)之前候選基因預(yù)測以及雙親比較測序結(jié)果，我們以晚花材料L04基因組DNA為模板，利用引物STA2-13L/STA2-13R(引物序列見表6)擴(kuò)增BnFLC.A2基因全長7.645-kb(包含上游2.195kb，編碼序列3.259kb及下游2.191kb)序列，選用高保真酶Phanta^TMSuper-Fidelity DNA Polymerase(諾維贊，南京)進(jìn)行擴(kuò)增。之后連接到表達(dá)載體PFGC5941(圖7)上面。PCR擴(kuò)增體系(總體積20μl)如下：

模板DNA：2μl

5×SF Buffer：4μl

dNTP：0.4μl

左引物：0.8μl

右引物：0.8μl

DNA Polymerase：0.4μl

ddH₂O：11.6μl

PCR反應(yīng)條件如下：95℃，2min；95℃，10sec，60℃，10sec，72℃，4min，35個(gè)循環(huán)；72℃，10min；20℃，5min。通過1％瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，并對目標(biāo)片段進(jìn)行挖膠，挖膠后使用Promega的瓊脂糖膠回收試劑盒(http://cn.promega.com/)回收DNA。與此同時(shí)提取載體PFGC5941質(zhì)粒DNA，直接用Fermentas(Thermo Scientific，http://www.thermoscientificbio.com)快速限制性內(nèi)切酶EcoRI和SmaI進(jìn)行雙酶切，雙酶切體系如下：

模板DNA：5μl

EcoRI：0.5μl

SmaI：0.5μl

FD Green Buffer：1.5μl

酶切反應(yīng)在37℃的恒溫箱中進(jìn)行，酶切時(shí)間為2h。載體PFGC5941質(zhì)粒酶切后再通過瓊脂糖凝膠電泳檢測回收酶切后的質(zhì)粒并通過Promega的瓊脂糖膠回收試劑盒(http://cn.promega.com/)回收質(zhì)粒DNA。然后將目標(biāo)片段和線性化的PFGC5941質(zhì)粒利用諾唯贊重組克隆試劑盒(ClonExpress^TM II)通過同源重組的方法將該序列連接到PFGC5941載體上并通過熱激轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入大腸桿菌感Top10的感受態(tài)細(xì)胞中用于測序。選擇測序完全正確的單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)保存菌種，并利用質(zhì)粒提取試劑盒(Plasmid mini Kit,OMEGA)提取質(zhì)粒，并進(jìn)行EcoRI和SmaI雙酶切檢測。將構(gòu)建成功的載體利用電擊轉(zhuǎn)化法將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞GV3101中，涂布于含有三種抗生素(利福平、慶大霉素和卡那霉素)的LB平板上。挑取平板上生長的單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒并進(jìn)行EcoRI和SmaI雙酶切檢測，最后選擇6個(gè)陽性克隆活化并保存于-70℃?zhèn)溆?，我們將從L04中擴(kuò)增的BnFLC.A2基因構(gòu)建的載體分別命名為PFGC5941-L04-BnFLC.A2。

2.BnFLC.A2轉(zhuǎn)基因流程

1)無菌受體材料的準(zhǔn)備

選取飽滿、干凈的油菜種子用75％乙醇浸泡1min，然后在0.1％升汞中滅菌10～15min，無菌水沖洗4～5次，用無菌濾紙吸干多余的水分，接種于發(fā)芽培養(yǎng)基上，25～28℃下置于紙盒子中暗培養(yǎng)一周。

種子發(fā)芽培養(yǎng)基

2)受體材料的預(yù)處理

取4～6d的無菌苗子葉或下胚軸作為轉(zhuǎn)化受體。用解剖刀切下完整的子葉(帶1～2mm子葉柄)或下胚軸(5～10mm)，將切下的外植體置于預(yù)培養(yǎng)基NMS1上進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)3d即可進(jìn)行接種浸染。

預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基：NMS1

3)供體菌株培養(yǎng)

a.固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基的配制：此處給出常用LB培養(yǎng)基(Luria-Bertani)培養(yǎng)基的配制方法。

LB液體培養(yǎng)基：稱取胰蛋白胨(bacto-tryptone)10g，酵母提取物(bacto-yeast extract)5g，NaCl 10g，溶于800ml去離子水中，用1mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，加入去離子水至總體積為1L。高壓蒸氣滅菌20min。

LB固體培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基每升中加入細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂粉(bacto-agar)12g，高壓蒸氣滅菌后，待溶液冷卻至60℃左右時(shí)，加入Kan(使終濃度為50mg/L)，Gen(硫酸慶大霉素，終濃度50mg/L)和Rfi(利福平，終濃度50mg/L)旋轉(zhuǎn)混勻(避免產(chǎn)生氣泡)，從燒瓶中傾出培養(yǎng)基至培養(yǎng)皿內(nèi)，90mm直徑的培養(yǎng)皿約需20ml培養(yǎng)基。完全凝固后，應(yīng)倒置平皿并貯存于4℃?zhèn)溆?。使用?～2h應(yīng)取出貯存的平皿。

b.單菌落農(nóng)桿菌的培養(yǎng)：取出-70℃長期保存的菌種管，置于冰上，在無菌條件下，用接種針刮取凍結(jié)的培養(yǎng)物表面，迅速把黏附在接種針上的農(nóng)桿菌劃線于含50mg/L Kan+50mg/L Gen+50mg/L Rfi的LB瓊脂平板表面。菌種管重新置于-70℃保存。將接種的瓊脂平板在28℃下暗培養(yǎng)36～48h。

c.農(nóng)桿菌擴(kuò)增液體培養(yǎng)：用滅菌的牙簽從瓊脂平板上挑取生長良好的單菌落，接種到液體LB培養(yǎng)基(加入50mg/L Kan+50mg/L Gen+50mg/L Rfi)中，28℃振蕩培養(yǎng)(200r/min)過夜(16～18h)，使農(nóng)桿菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期，OD₆₀₀值達(dá)0.4左右。

d.以小型離心機(jī)6000r/min轉(zhuǎn)速離心2ml離心管中裝有的菌液，5min后收集菌體，用MS液體培養(yǎng)基洗2次，再用MS液體培養(yǎng)基(添加100μmol/L AS，pH 5.4)重懸菌體，調(diào)OD₆₀₀至0.4左右，輕微振蕩培養(yǎng)2～3h備用。

4)浸染

于超凈工作臺(tái)上，將培養(yǎng)的根癌農(nóng)桿菌液倒入無菌培養(yǎng)皿中(可根據(jù)材料對菌液敏感情況進(jìn)行不同倍數(shù)的稀釋)。取出經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的外植體，放入菌液中，浸泡30min(不同材料處理時(shí)間不同)，用無菌濾紙吸干外植體表面的菌液。

5)外植體與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)

將浸染過的外植體接種到鋪有一層無菌濾紙的共培養(yǎng)基(即NMS1培養(yǎng)基上面蓋張濾紙)，光照培養(yǎng)室內(nèi)暗培養(yǎng)2天。

6)脫菌篩選培養(yǎng)基

將經(jīng)過共培養(yǎng)的外植體取出后用無菌濾紙吸干或在超凈工作臺(tái)上吹干多余的水分，下胚軸平放于脫菌篩選培養(yǎng)基NMS3上進(jìn)行脫菌培養(yǎng)7～10d。

選擇培養(yǎng)基：NMS3

滅菌后降至50℃時(shí)加入

Carb 1ml

PPT 50μl

7)誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基

將NMS3上放置一周后的外植體(兩端略微出現(xiàn)膨大，有的可能出現(xiàn)綠色愈傷)轉(zhuǎn)移到誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基NMS4，此過程經(jīng)歷2周之間，中間要繼代一次。

誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基：NMS4

滅菌后降至50℃時(shí)加入

Carb 1ml

PPT 50μl

AgNO₃ 100μl

8)誘導(dǎo)出芽培養(yǎng)基

將NMS4上兩端出現(xiàn)綠色愈傷組織的外植體轉(zhuǎn)移到誘導(dǎo)出芽的培養(yǎng)基NMS5(MS+3mg/L BAP+2mg/L Zeatin+30g/L Sucrose+5.5g/L Phytal-膠+500mg/L Carb+10mg/L PPT)上直至芽出現(xiàn)。此過程經(jīng)歷時(shí)間最長，中間繼代2-3次。

誘導(dǎo)芽的培養(yǎng)基：NMS5

滅菌后降至50℃時(shí)加入

Carb 1ml

PPT 50μl

9)芽延長培養(yǎng)基

將NMS5培養(yǎng)基上愈傷組織分化出的芽組織用刀從其與愈傷的粘合處切下置于NMS6培養(yǎng)基上，直至芽生長到1-2cm。

芽延長的培養(yǎng)基：NMS6

滅菌后降至50℃時(shí)加入

Carb 1ml

PPT 50μl

10)生根培養(yǎng)基

將延長的芽組織轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中直至生根。

生根培養(yǎng)基

滅菌后降至50℃時(shí)加入

Carb 500μl

經(jīng)過遺傳轉(zhuǎn)化，PFGC5941-L04-BnFLC.A2載體共得到66株獨(dú)立轉(zhuǎn)化的T₀代轉(zhuǎn)化苗，編號為BnA2-1-BnA2-66；經(jīng)檢測共得到T₀代陽性單株48株，最終只有只有11個(gè)T₀代陽性株系收獲到比較多的種子可以用于T₁代分析；我們分析了這11個(gè)陽性株系的T₁代發(fā)現(xiàn)只有4個(gè)單拷貝陽性株系，分別是BnA2-2、BnA2-10、BnA2-14和BnA2-37，這四個(gè)株系中轉(zhuǎn)基因T₁代陽性單株的花期顯著晚于轉(zhuǎn)基因T₁代陰性株系，晚開花23到30天(圖8)；并且其T₁代共分離檢測發(fā)現(xiàn)，開花期和相對表達(dá)量之間在0.001水平上顯著相關(guān)(r＝0.793)(表7)；以上結(jié)果最終確認(rèn)BnFLC.A2基因就是qFT-A2的目的基因。

表7 BnFLC.A2轉(zhuǎn)基因T₁代共分離檢測

實(shí)施例5：BnFLC.A2基因的啟動(dòng)子分析

前期比較測序發(fā)現(xiàn)BnFLC.A2和Bnflc.a2的啟動(dòng)子區(qū)間僅在起始密碼子上游1.8kb的位置存在3個(gè)單堿基的變化，我們推測該變異對啟動(dòng)子的功能沒有影響。為了驗(yàn)證這一推測，此外，為了探究目標(biāo)基因的表達(dá)模式，我們將BnFLC.A2和Bnflc.a2的啟動(dòng)子序列通過酶切連接的方法連接到表達(dá)載體PMDC162(圖9)上面，分別構(gòu)建了P_BnFLC.A2:GUS和P_Bnflc.a2:GUS啟動(dòng)子連接GUS載體。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序侵染法將目標(biāo)載體轉(zhuǎn)入擬南芥Col-0生態(tài)型植株中，待收獲到種子之后，利用含有潮霉素抗性的篩選培養(yǎng)基對種子進(jìn)行篩選，存活下來的苗子移到土里種植并取樣檢測。針對P_BnFLC.A2:GUS載體共篩選得到11株陽性苗，而P_Bnflc.a2:GUS共篩選得到16株陽性苗。我們選取兩個(gè)載體陽性轉(zhuǎn)化苗的T2代，并在各個(gè)生長階段取樣進(jìn)行GUS染色分析。GUS染色結(jié)果表明，BnFLC.A2和Bnflc.a2的啟動(dòng)子均具有功能，而且具有相似的功能。通過啟動(dòng)子GUS表達(dá)分析實(shí)驗(yàn)，我們證實(shí)了Bnflc.a2拷貝的啟動(dòng)子是具有正常功能的，而在早花親本L06中卻檢測不到Bnflc.a2的表達(dá)(圖10)，說明不是啟動(dòng)子區(qū)間的變異導(dǎo)致的Bnflc.a2功能喪失，結(jié)合比較測序的分析結(jié)果進(jìn)一步表明可能是長片段插入之后，導(dǎo)致Bnflc.a2的轉(zhuǎn)錄發(fā)生紊亂，進(jìn)而檢測不到該拷貝的表達(dá)。

實(shí)施例6：BnFLC.A2基因及其等位基因的表達(dá)分析

2014年10月我們將雙親L06和L04播種在湖北武漢冬油菜環(huán)境下，我們在播種后第34天開始取樣，然后每隔一段時(shí)間繼續(xù)取樣直至晚花親本L04花期結(jié)束。該過程從秋末到春天，跨越了整個(gè)冬季，一共取樣8次，分別是播種后第34天，76天，83天，105天，124天，132天，150天，174天。所有樣品取樣結(jié)束之后提RNA并進(jìn)行表達(dá)分析。我們對冬油菜環(huán)境下不同時(shí)期的樣品進(jìn)行了表達(dá)分析實(shí)驗(yàn)。如圖11A所示，RT-PCR檢測結(jié)果顯示，與L04相比，L06中均檢測不到目標(biāo)基因的表達(dá)；而L04中BnFLC.A2的表達(dá)量呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢。為了更準(zhǔn)確的反應(yīng)出雙親中BnFLC.A2的表達(dá)趨勢，我們利用熒光定量PCR(qRT-PCR)分析了BnFLC.A2在不同階段樣品中的表達(dá)情況。如圖11B所示，只有晚花親本L04中可以檢測到BnFLC.A2的表達(dá)。在播種后第34天時(shí)，屬于秋末時(shí)期，該階段還沒有連續(xù)的低溫，因而，BnFLC.A2表現(xiàn)出較高的表達(dá)水平，隨著冬季的到來，氣溫逐漸降低，BnFLC.A2的表達(dá)水平呈現(xiàn)出逐漸降低的趨勢，冬季結(jié)束之后，氣溫回升，然而BnFLC.A2依舊維持在非常低的水平。同時(shí)，我們分析了成花素基因BnFT的表達(dá)情況，如圖11C所示，播種后第34天時(shí)，L06和L04均處于非常低的水平，隨著植株的生長，早花親本L06中由于沒有BnFLC.A2基因的抑制，BnFT基因很快就能夠表達(dá)到一個(gè)很高的水平；而晚花親本L04中由于BnFLC.A2基因的抑制，BnFT基因前期一直在一個(gè)很低的水平，直到第105天時(shí)才開始逐漸上升表達(dá)。對比發(fā)現(xiàn)，晚花親本L04中，BnFLC.A2和BnFT呈現(xiàn)出相反的表達(dá)趨勢，這和擬南芥中的研究結(jié)果相似。接著我們分析了BnSOC1基因在雙親中的表達(dá)情況，如圖11D所示，同樣由于早花親本L06中由于沒有BnFLC.A2基因的抑制，BnSOC1基因很快就能夠表達(dá)到一個(gè)很高的水平；而晚花親本L04中由于BnFLC.A2基因的抑制，BnSOC1基因表現(xiàn)出逐漸升高的趨勢。這一過程同雙親中BnFT基因的表達(dá)模式類似。綜上所述，說明在甘藍(lán)型油菜中BnFLC.A2仍然可以通過抑制BnFT和BnSOC1的表達(dá)來達(dá)到抑制開花的作用，說明這一調(diào)控開花的機(jī)制在甘藍(lán)型油菜中具有一定的保守性。

表達(dá)實(shí)驗(yàn)引物序列：

qBnFLC.A2-L 5’GCGATAACCTGGTCAAGATCC 3’

qBnFLC.A2-R 5’CTCCAGCTGAACGAGGGAG 3’

qBnFT-L 5’TAACAGAGATCCTCTTGTGGTAGG 3’

qBnFT-R 5’CCACCAATCTCAACTCTTGGC 3’

qBnSOC1-L 5’AGAGAATGCAACAAGCAGACAAG 3’

qBn SOC1-R 5’TGATCAGAGAAACTTCAGCATCAC 3’

BnACTIN7-L 5’GGAAGCTCCTGGAATCCATGAGA 3’

BnACTIN7-R 5’TCTTTGCTCATACGGTCAGCAATTCC 3’

實(shí)施例7：自然群體中分析Bnflc.a2基因?qū)﹂_花期的影響

為了檢測Bnflc.a2基因在自然群體中的分布情況以及對開花期的影響，我們分析了一個(gè)包含495個(gè)甘藍(lán)型油菜不同品種及自交系材料的自然群體，該群體來自于Xu等(2016)用于甘藍(lán)型油菜開花期關(guān)聯(lián)分析的群體。我們針對該基因設(shè)計(jì)了特異引物STA2-55L/STA2-46R用來檢測Bnflc.a2基因在自然群體中的分布情況，統(tǒng)計(jì)495份材料的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)59份材料中包含有Bnflc.a2基因，結(jié)合開花期表型進(jìn)行單標(biāo)記分析發(fā)現(xiàn)8個(gè)環(huán)境下有7個(gè)環(huán)境開花期差異達(dá)到顯著水平(圖12)。由該實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，Bnflc.a2基因在該自然群體中分布較少，僅占有約12％的比例；通過Bnflc.a2基因與開花期的關(guān)聯(lián)分析表明：Bnflc.a2基因在自然群體中對開花期的影響在七個(gè)環(huán)境下均表現(xiàn)出顯著水平，說明Bnflc.a2中的長片段插入導(dǎo)致該拷貝功能喪失可能是影響甘藍(lán)型油菜開花時(shí)間的自然變異的重要因素。

特異引物序列：

STA2-55L 5’GCTTCTCGGAGACAGAAGCC 3’

STA2-46R 5’TCAGAGTGGAAGACAAATGATGC 3’。

SEQUENCE LISTING

<110> 武漢聯(lián)農(nóng)種業(yè)科技有限責(zé)任公司；華中農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> 甘藍(lán)型油菜開花期基因BnFLC.A2和Bnflc.a2的克隆及應(yīng)用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5624

<212> DNA

<213> 甘藍(lán)型油菜（Brassica napus）

<400> 1

gaggaggaag agctcatcgt gcttaatgtc ttcatcgaag caaaccaaga attgaaaact 60

attttagcat aaagtaacga atgatgatta gaataacaca gtatttaatg ctacaggtgg 120

tatgagtaat gaactagatg ttgctgtttt tattatcggg aatatatttc cccactttat 180

catttctatt ctattttatc ttctcgcgtt ctaaagttga atgttctgta accattaaaa 240

actaataaaa ttttaacaat ttaaaaagga taattgacat atccagaaat atggaaagcg 300

ggtgagatga ttggataaaa accatgccgt acattcaccc atcgattcgt ataagtacgt 360

ttcgcattaa gtttataata ataaatatag tattttctct gccacataat ttagcatata 420

gggttaatac atttcccttc tctccacaaa cgtttagttt atcgtatagg aaaattgcat 480

catctttaac tttgtagctc tttgttgggg atttttggta tacgaccttt gtgtaagttg 540

tttcttgggt ttgtattggc tcagttgcag ttttcacctg tttttggtat taatatattt 600

ttcaagttga caaaaaaaaa aaaacttttc atcctacatt atatagacga ttataatggg 660

attgcgcaaa attctaaaca aaaattaaat actaactttt gtatactatt ttctaaaaca 720

tctaaaaaat acattagtga gaacaatgtc tattaagtaa caatgtcaat taaacaacga 780

attcaacata ttaagaatat aaatttatca aaaaaaagtg ggccaaaatc tccaaatttc 840

atccttgtat aaataaagag agattttttt ctggacaaag tataaataaa gagatatttt 900

gcctaaaata gaggataaaa attatttagg caacatgttt tgaacaacca cagtgaaaca 960

aacaaaaata cattcgtcta ggcaacgagg catgtcatct aagcacatgg gctattttct 1020

aggcgcgcat cacctctcat gtaggcatcg cctactatct agttataact aatactacaa 1080

tctttttatg tttttcttcc tacttcagac ctcacatgaa agtttgcctt aaatccatca 1140

tcaaattgta cgtgccaaat tcagattaaa caattagagt ggcatatcaa acatctaaat 1200

acactagccg tccacgctaa atattctctt tggcagaaaa ataacaatca ttgttagtgg 1260

ttattcagat tggactcaga tcgaattcag acgaaatgag taatagtagt atttatatat 1320

caaactgtcc aatagatatt taagaatttt ggtttatgtt tattttttaa tcctaacaat 1380

tggtctgact tgtaggaagt aaaatattga atatgcaaga aacgaagaga aacaaaaatg 1440

tgggttaaat aaaaactctc atgtataaga agtaagataa actaaaattt ataagatcta 1500

aagagaaaaa ttaacgcctt atagacaaaa aaaaaccagt aaattttgtg ctaaataagc 1560

aaattgaaag gtttgtaggt tggctttagg tcaagttata ttattagaca cgtacgttag 1620

gtcaagttgt ctatattagt caggagtttc agtttggtca gcagattgga aaataaataa 1680

ccagatttta taacgaagtt tatgtatatt tgtcgtttaa gttataagta tagtgtaatg 1740

tgtgtaaaaa gtttgtttta agtagtatag tgtattctat tctttttggc aacagttctg 1800

cattagttaa gatataattt tccatagtat ttgagatcta accatgtaat ataacttgaa 1860

atttgaaaac ttgataaatt attcgataaa agataataaa ggcaagaggc aagagccaac 1920

gagggaactc gtcatgcggt acacgtggct gtcttgtccc tgaaccacat tggttctttc 1980

tacgaatttt tattttcatc tctctcgttt accctaataa aaagtggccc gagggagaaa 2040

aaggagagac acaaaaagaa agaaataaaa gcaaaaaaga aagaaaataa aagcaaaaat 2100

aagaaagaac aaaaaacgct cagtatctcc ggcgagagtt gaaaccgaac ctcaggatca 2160

aattagggca caaaggcttc tcggagacag aagccatggg aagaaagaaa ctagagatca 2220

agcgaattga gaacaaaagt agccgacaag tcaccttctc caaacgacgc aatggtctca 2280

tcgagaaagc tcgtcagctt tcagttctct gcgatgcatc cgtcgctctt ctcgttgtct 2340

cagcctccgg caagctttac aacttctccg ccggcgataa gtatgacttc tcctcttctg 2400

ggtcttcctt tatttgccct tttcgcttcc gttcctcttc tctttactat ttataggaaa 2460

ataaaataaa gtacaaataa aataaaataa aaaattaaaa gacactttga ttttccggca 2520

gatctcatgt ggatttctcg gttttgtgtt tgttattgtt tcttctatga acatgagaga 2580

tacatgaggt aaccagattt gagaaagaac aatgtcctga tgagctaaag cttcttactt 2640

tgttcatttc tctctctcaa tctttttctg catggatttt tttttttttt gtaaaaaaga 2700

ttgcatgtta ttcaaggtct tttgataagc tgtgatgcat acttgatgtt gtgtagtgaa 2760

gtttcaatac atctttgatt gtttaattgg atttaggact cctaattaag tatctgaaga 2820

gttccttatc agaatgagta ttagtggttt tctttttaga gtaattttgg tcgatggatc 2880

tcttgatttg taatgcaatg cacttcgggg agatctataa aaaatgtggg attaatgctt 2940

aataatagat taagagtttt aattcgaatg tatgccacat tttgcagcaa atgtgaactc 3000

cgtagaactc cttaagtatc tgaagagttc attataagaa taaataatga ttaatgtttc 3060

tatttttaga gtaattcaag tcaatgaatc tcttggagtt cgatgcaatg cacttcgggg 3120

agatctataa aattgatgta ggattaatgc agaataatag atcaagagtt ttaatatgaa 3180

tgcatatatg ccacattgtg cagccattaa cttaaaaaga taattgtaga tcttcaaaaa 3240

aaaattacct ctttgccatg gatttattgc ttgaagatta tccaaattat aaggctacta 3300

gttggttctt agtatccaca tatatgtgta aagtaatttt gaaatttggt agatttaaga 3360

aaactcagcc tcacaattag tacttaacca cacatatgct acactactta tgttctccgc 3420

gatcgccatt acaatggtgt tgaacaagga ttagctagtt gttttgatct taacttattt 3480

tgttttgtct cctcttcagc ctggtcaaga tccttgatcg atatggaaaa caacatgctg 3540

atgatcttaa agctctggta atacaaattt tttgaattag tcctgatgca gttttaagag 3600

taattagtgc ctagagggct ccatacatac tggtcaaagc caacacatgt ttaggacttc 3660

aaaactgtgg agatctagat tagagttatt gcattattga tccactcatg agccattagt 3720

tcgtcaaaag atcctatgtg aggctgtgga tccgcatgca ttcccagttt ctcaaatccc 3780

ttgttttaat tgcctattct atcccttctc cgtggacagg atcttcagtc aaaagctccg 3840

aagtatggtt cacaccatga gctactagag cttgtcgaaa ggttagtatt gtctaagact 3900

tttttttgct ctcctccttt gatgacaaag gaattagtgt ttcttggcaa actattaata 3960

tttgcagtaa gcttgtggaa tcaaattctg atgtaagcgt cgactccctc gttcagctgg 4020

aggaccacct tgagactgcc ctctccgtaa ctagagctag gaaggtacgt tcactacaaa 4080

atctcttttt ttttcttact ttcagagcgc ttatatttaa tccgttgcag acagaactaa 4140

tgttgaagct tgttgatagc ctcaaagaaa aggttagata tcttatttta tagcacttaa 4200

ttagatatct taccttgtgt cgagagcctc aaaacttttg cgtattgtat tagtttccct 4260

aagtgtgctt tatgagctgg caaatctaca ttaaacttct tcacagttca tgtagtcttt 4320

ttggggatga tgcaaatgat ttgggttcta gaatctgaaa ttaggtttag aaacttggta 4380

agtgataatc atgttgacct ttaaaacagg agaaattgct gaaagaagag aaccagggtt 4440

tggctagcca ggtaacaaag ctacattctt catatatgca aaagctaaca agcactttta 4500

cacatactct tatacttgca gatataacat gtacaataga tattatactt aaggtattat 4560

agaaaagaat atgtcgagat tagggcattt tggtttatct taattttgat gagagtatta 4620

ctgtatgaaa accaaaaatg attggtctgg atttggttgg ggaaaatttt ggtttggttc 4680

taatttggat tattataaat tagtaaaaca gttaaaaccc taacgctaaa agtaaaacct 4740

aaactctgtc ataaacctta atacttcaac aaaagtctta aaccctaatt cctaaaagta 4800

gtatagttct ttgaagttag aggatgcagc atttccttaa acttaagggt tctgagtttt 4860

actgattata tatccaaatc gaatgaagcc tggatctgga agaaaaaacc gaagtttgtg 4920

tacattttta tattcacgac tacctaaaca attcttaacc aaaagaagaa gaaaaactaa 4980

ataatctcat atgtcatttg ggtaaagtca aaataatttc ttttcaggtt gttggacatc 5040

attctgtttt ggtaatttgg ttagagattt atgaaactga atgattgttt actgttacgg 5100

tttaggttgg gatccgattg gttagtttca agtagtctta gtttttcagt tttacttgtt 5160

caggttaatc aggaaaaagt agatatatat acatgatttg agattcgtta taagcttgat 5220

gaaagaccct aaaagctcga caaattatga aaaccagatt gctatatatt tttgatggtt 5280

ggtgggaaaa gaattttctt tgtgttaatt aatgactata aatggttttg acctaaaact 5340

atattacaga tggagaagaa taatcttgcg ggagccgaag ctgataaaat ggagatgtca 5400

cctggacaaa tctctgacat caatcgtccg gtaactctcc gactgcttta ttagccacct 5460

taagtccaaa acttgtgact aaaaacaaaa ataagttatc gaactattcc cctataaggg 5520

tgaacgttgt atatcttcat tctctctggc tgagagaccc cgtgtgtaaa actacggtta 5580

gatttaagta aaaatatata tttaagacat actaattatg gatc 5624

<210> 2

<211> 196

<212> PRT

<213> 甘藍(lán)型油菜（Brassica napus）

<400> 2

Met Gly Arg Lys Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ile Glu Asn Lys Ser Ser

1 5 10 15

Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Asn Gly Leu Ile Glu Lys Ala

20 25 30

Arg Gln Leu Ser Val Leu Cys Asp Ala Ser Val Ala Leu Leu Val Val

35 40 45

Ser Ala Ser Gly Lys Leu Tyr Asn Phe Ser Ala Gly Asp Asn Leu Val

50 55 60

Lys Ile Leu Asp Arg Tyr Gly Lys Gln His Ala Asp Asp Leu Lys Ala

65 70 75 80

Leu Asp Leu Gln Ser Lys Ala Pro Lys Tyr Gly Ser His His Glu Leu

85 90 95

Leu Glu Leu Val Glu Ser Lys Leu Val Glu Ser Asn Ser Asp Val Ser

100 105 110

Val Asp Ser Leu Val Gln Leu Glu Asp His Leu Glu Thr Ala Leu Ser

115 120 125

Val Thr Arg Ala Arg Lys Thr Glu Leu Met Leu Lys Leu Val Asp Ser

130 135 140

Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Leu Lys Glu Glu Asn Gln Gly Leu Ala

145 150 155 160

Ser Gln Met Glu Lys Asn Asn Leu Ala Gly Ala Glu Ala Asp Lys Met

165 170 175

Glu Met Ser Pro Gly Gln Ile Ser Asp Ile Asn Arg Pro Val Thr Leu

180 185 190

Arg Leu Leu Tyr

195

<210> 3

<211> 8452

<212> DNA

<213> 甘藍(lán)型油菜（Brassica napus）

<400> 3

gaggaggaag agctcatcgt gcttaatgtc atcatcgaag caaaccaaga attgaaaaat 60

attttagcat aaagtaacga atgatgatta gaataacaca gtatttaatg ctacaggtgg 120

tatgagtaat gaactagatg ttgctgtttt tattatcggg aatatatttc cccactttat 180

catttctatt ctattttatc ttctcgcgtt ctaaagttga atgttctgta accattaaaa 240

actaaaattt ttttaacaat ttaaaaagga taattgacat atccagaaat atggaaagcg 300

ggtgagatga ttggataaaa accatgccgt acattcaccc atcgattcgt ataagtacgt 360

ttcgcattaa gtttataata ataaatatag tattttctct gccacataat ttagcatata 420

gggttaatac atttcccttc tctccacaaa cgtttagttt atcgtatagg aaaattgcat 480

catctttaac tttgtagctc tttgttgggg atttttggta tacgaccttt gtgtaagttg 540

tttcttgggt ttgtattggc tcagttgcag ttttcacctg tttttggtat taatatattt 600

ttcaagttga caaaaaaaaa aaaaaacttt tcatcctaca ttatatagac gattataatg 660

ggattgcgca aaattctaaa caaaaattaa atactaactt ttgtatacta ttttctaaaa 720

catctaaaaa atacattagt gagaacaatg tctattaagt aacaatgtca attaaacaac 780

gaattcaaca tattaagaat agaaatttat caaaaaaaag tgggccaaaa tctccaaatt 840

tcatccttgt ataaataaag agagattttt ttctggacaa agtataaata aagagatatt 900

ttgcctaaaa tagaggataa aaattattta ggcaacatgt tttgaacaac cacagtgaaa 960

caaacaaaaa tacattcgtc taggcaacga ggcatgtcat ctaagcacat gggctatttt 1020

ctaggcgcgc atcacctctc atgtaggcat cgcctactat ctagttataa ctaatactac 1080

aatcttttta tgtttttctt cctacttcag acctcacatg aaagtttgcc ttaaatccat 1140

catcaaattg tacgtgccaa attcagatta aacaattaga gtggcatatc aaacatctaa 1200

atacactagc cgtccacgct aaatattctc tttggcagaa aaataacaat cattgttagt 1260

ggttattcag attggactca gatcgaattc agacgaaatg agtaatagta gtatttatat 1320

atcaaactgt ccaatagata tttaagaatt ttggtttatg tttatttttt aatcctaaca 1380

attggtctga cttgtaggaa gtaaaatatt gaatatgcaa gaaacgaaga gaaacaaaaa 1440

tgtgggttaa ataaaaactc tcatgtataa gaagtaagat aaactaaaat ttataagatc 1500

taaagagaaa aattaacgcc ttatagacaa aaaaaaacca gtaaattttg tgctaaataa 1560

gcaaattgaa aggtttgtag gttggcttta ggtcaagtta tattattaga cacgtacgtt 1620

aggtcaagtt gtctatatta gtcaggagtt tcagtttggt cagcagattg gaaaataaat 1680

aaccagattt tataacgaag tttatgtata tttgtcgttt aagttataag tatagtgtaa 1740

tgtgtgtaaa aagtttgttt taagtagtat agtgtattct attctttttg gcaacagttc 1800

tgcattagtt aagatataat tttccatagt atttgagatc taaccatgta atataacttg 1860

aaatttgaaa acttgataaa ttattcgata aaagataata aaggcaagag gcaagagcca 1920

acgagggaac tcgtcatgcg gtacacgtgg ctgtcttgtc cctgaaccac attggttctt 1980

tctacgaatt tttattttca tctctctcgt ttaccctaat aaaaagtggc ccgagggaga 2040

aaaaggagag acacaaaaag aaagaaataa aagcaaaaaa gaaagaaaat aaaagcaaaa 2100

ataagaaaga acaaaaaacg ctcagtatct ccggcgagag ttgaaaccga acctcaggat 2160

caaattaggg cacaaaggct tctcggagac agaagccatg ggaagaaaga aactagagat 2220

caagcgaatt gagaacaaaa gtagccgaca agtcaccttc tccaaacgac gcaatggtct 2280

catcgagaaa gctcgtcagc tttcagttct ctgcgatgca tccgtcgctc ttctcgttgt 2340

ctcagcctcc ggcaagcttt acaacttctc cgccggcgat aagtatgact tctcctcttc 2400

tgggtcttcc tttatttgcc cttttcgctt ccgttcctct tctctttact atttatagga 2460

aaataaaata aagtacaaat aaaataaaat aaaacaatta aaagacactt tgattttccg 2520

gcagatctca tgtgcatttc tcggttttgt gtttgttatt gtttcttcta tgaacatgag 2580

agatacatga ggtaaccaga tttgaagaag aacaatgtcc tgatgagcta aagcttctta 2640

ctttgttcat ttctctctct ctcaaccttt ttctgcatgg atttttttta tctgtaaaaa 2700

aaattgcatg ttattcaagg tcttttgata agctgtgatg catacttgat gttgttttgt 2760

gaagtttcaa tacatctttg attgtttaat tggatttagg actcctaatt aagtatctga 2820

agagttcctt atcagaatga gtattagtgg ttttcttttt agagtaattt tggtcgatgg 2880

atctcttgat ttgtaatgca atgcacttcg gggagatcta taaaaaatgt gggattaatg 2940

cttaataata gattaagagt tttaattcga atgtatgcca cattttgcag caaatgtgaa 3000

ctccgtagaa ctccttaagt atctgaagag ttccttataa gaataaataa tgattaatgt 3120

ttctattttt agagtaattc aagtcaatga atctcttgga gttcgatgca atgcacttcg 3180

gggagatcta taaaattgat gtaggattga tgcagaataa tagatcaaga gttttaatat 3240

gaatgcatat atgccacatt gtgcagccat ctatatatat aaagtattgt ttgcctctct 3300

cctgtgcttc cacgtcacta attcatctct tcctagcctg ccacgtgtcc acttgaccaa 3360

aacgtacggt ttcctcattt aattgttaag ggcttcgcta ttgttttgtg ttatgttcat 3420

gggctggccc atgacacttg catcttcttc tcagtctgaa atttagggtt caccagcttt 3480

aggaatcttc cattctgtat gttaacaatt gcagttctga gattttcgta tacattttgt 3540

caataatctc aaagtccatt tatgttctga tcgttttgtc ttacctccga accgttacaa 3600

gttgcagaga ttggcataat taacacaaac ttaactcttc ctcgccacta ggaccacgat 3660

caagaattca atgaatctta ttcagtttcc agtctgtgat tctctcctat aaaaaggtaa 3720

ttattcatcc cttgaacatc atcttttcat ctcctattat cgagagattt cttatttttt 3780

ctataatggc tgcatcattt gtcttccact ctgatttgaa agcaaatgtt gttcttccac 3840

ggctgttatg tttatcaaac tctagatttt gtttgtcttt ttgtttttct ctttcctctc 3900

cataagattt gttgataaac actatggatt gcttatgctt ttgtcttata tactcttggc 3960

tcaatacaaa ccagatggag gtggaagatc ttagctgcca ctggaaaaaa gctatggcaa 4020

agattatttt tcaggagatg gagttgagat gaggatgaga gttcaggctg cgctgaaact 4080

ggaaaaagct attcccttta gtcacgagat ggaaatcatt caactcaagt tgcatgatca 4140

agctagatac gacatattgt tacagtcaca cggcagatta ttaaatatcc tgtcaaggga 4200

acttttgatc ctttagttgt tgggtaacta aagtttccat ctttatcttc tcaatacatg 4260

attttaattg cctataaggt gtttgagtta ttgtctgctt ttctcatgtc tcaatcaaat 4320

agttgtttct ctggttttgt tgtcttctgc tcagtttggt gttcgtattt taaacagatc 4380

atactacacg aaattgcggc tgtgatctcc cccaagagcc ttttacgtac agattgacac 4440

atgaggtgat gttttgtggg ttagttgtgc tttttgcaat ggctgccctc aaaccagtaa 4500

actcctcaag taaattctct gatttgagtt aatgtgattc actgtgatgt tttgtgattt 4560

tcatgtcttt tttattttaa aatcctctga tttgagatta atctgttgct atgacttact 4620

ctgatccagg gagctcagta acaacgacac caatctcatg ttctgaccaa agatgcagct 4680

ggggtgttca gtcctctaat tcaggctgtt ctactcagaa caacatttgc gcttacacgt 4740

ttcggtatgg ggatggaagt tgcacctcag ggttcttcgt ctctgatgtc ttacagttcg 4800

tttgagtact atgactcttg gccagacatg ttgtctcatt ttttatttag tgctctgctt 4860

ttcagtgttt tcttcttgca tcgcttgaac agtgatgagc ccaaggccga tgtcaccttt 4920

tagaataaca tgtaagaccc atgaatacac tagaattgat taaaaaaatt taatgcatgg 4980

agatagttca ttttaccttg atcgagtgtt gagagagtgc ttgcagtttt ggcactgaag 5040

cctcaagatg atcttcttcg tggtctaagc atgttcaacg gataacacaa atacacatca 5100

cccttaaaac aaattatgac ataaaaaaca tagagcaaaa taatcccaaa tttaaaaaca 5160

ctaataaaat tttcatatga ttttaatctg aaaggatcaa atacagaatc ataaaaacaa 5220

ctcagtccct aaaactacaa gataaatggc tcactatatt gattaagaat atctaaaaat 5260

tgctcaagat ttaactaact ggtttaattc aaacacacaa aacacacttt gtaaaaaaga 5280

agtgtctatt gtacctttga tgacacccaa aaacaacaat ccactgagat gaagaatgga 5340

tattaaaaat atcaaacaaa agaaagacca aaggagacgc catgaaaatg ttaaaatttg 5400

cagttaaaaa ttaattatct tagtatcagt tttagtacca attattttta atccaaaggg 5460

attctttgat gtttttattt acagaaatta cataatatat ctagcaataa tgacaataag 5520

taattgtagt gtaactaatt tgtttttcca aaatcattta attaaagaaa gttaatctta 5580

taattaatta tacatcatgg aacataaaca aatgtcaatc catttctaag tattttttca 5640

aataagtacc acatcaaaat tcttttaaac attaagtaaa tagtaaaatt atatagggta 5700

gtattatgtg tttttccaat aactatttta gtttgattat gtatatctga ttgaaatatt 5760

attcattttg tttaacaatt attcttttgt cattttgtag tgatctataa caaaaaaata 5820

aatgatacgt attttataaa aagcagaaga caaatcatct atcacataat ttacttaact 5880

gcattgattt tggggttcaa ttttctgaaa ttcagtataa agcgatttca tagaaataat 5940

gccctataca aaatatataa ttgaatttta gaaattattt taaaaaatca tgtcaattac 6000

ttagcgaatc cactcgccgc gcgaagcgcg gcccggccct agttaactta aaagataatt 6060

gtagatcttc aaaaaaaatt acctctttgc catggattta ttgcttgaag attatccaaa 6120

ttataaggct actaattagt atccatatat atgtgtaaag taattttgaa atttggtaga 6180

tttaagaaaa ttcagcctca caattagtac ttaaccacac atatgctaca ctacttatgt 6240

tctccgcgat tgccattaca atggtgttga acaaggatta gctagttgtt ttgatcttaa 6300

cttattttgt tttgtctcct cttcagcctg gtcaagatcc ttgatcgata tggaaaacaa 6360

catgctgatg atcttaaagc tctggtaata caattttttt gaattagtcc tgatgcagtt 6420

ttaagagtaa ttagtgccta gagggctcca tacattctgg tcaaagccaa cacatgttta 6480

ggacttcaaa actgtggaga tctagattag agtcattgca ttattgatgc acccatgagc 6540

cattagttcg tcaaaagatc ctatgtgagg ctgtggatcc acatgcattc ccagtttctt 6600

aaatcccttg ttttaattgc ctattctatc ccttctccgt ggacaggatc ttcagtcaaa 6660

agctccgaag tatggttcac accatgagct actagagctt gtcgaaaggt tagtattgtc 6720

taagactgtt tttgctctcc tcctttgatg acaaaggaat tagtgtttct tgtcaaacta 6780

ttaatatatg cagtaagctt gtggaatcaa attctgatgt aagcgtcgac tccctcgttc 6840

agctggagga ccaccttgag actgccctct ccgtaactag agctaggaag gtacgttcac 6900

tacaaaatct cttttttttt ttcttacttt cagagcgctt atatttaatt cgttgcagac 6960

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tacggttaga tttaagtaaa aatatatatt taagacatac taattatgga tc 8452