專利名稱：作物脂肪氧化酶同功酶lox－1.lox－2.lox－3的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生化檢測方法，更具體地說是一種水稻、大豆等作物中酶的檢測方法。
脂肪氧化酶(Lipoxygenase，LOX)廣泛存在于植物特別是高等植物體內(nèi)，脂肪氧化酶具有三種同功酶即LOX-1，LOX-2和LOX-3，目前還不完全清楚LOX酶的生理功能，但其活力直接影響食品原料如大豆、小麥、水稻等種子的貯藏和加工品質(zhì)。許多研究表明水稻稻谷貯藏過程中的陳化作用以及大豆加工中的豆腥味均與脂肪氧化酶有直接的關(guān)系，所以通過植物遺傳改良的方法選育LOX酶缺失的農(nóng)作物新品種。是解決稻米陳化、大豆腥味等問題的最有效途徑。然而發(fā)展簡便、快速的LOX酶活力檢測技術(shù)，特別是開發(fā)方便實(shí)用的檢測試劑盒是作物脂肪氧化酶缺失品種選育及產(chǎn)品收購、貯藏實(shí)用化的關(guān)鍵所在。
LOX酶的活性可用多元不飽和脂肪酸如亞油酸、亞麻酸及花生四烯酸等作為反應(yīng)基質(zhì)，利用氧電極和分光光度法來測定1．1氧電極法根據(jù)基質(zhì)濃度一定，反應(yīng)體系中的溶解氧濃度的變化與酶活力大小呈線性相關(guān)的原理進(jìn)行測定，即由于LOX催化耗氧，溶液中氧濃度的減小速率與酸活力大小成正比。氧電極法測定的LOX活力常因低物種類酶濃度、低物濃度、溫度等條件所左右，較適于柱層析過程中的酶的監(jiān)測。
1．2分光光度法在反應(yīng)體系中LOX使多元不飽和脂肪酶氧化形成具有共軛雙產(chǎn)生的過氧化氫物，此化合物在234nm波長處有吸收峰、峰高度與酶活力有顯著的正相關(guān)。分光光度法的結(jié)果受溫度、時間、酶濃度等影響較大。
1．3薄層等電聚焦電泳技術(shù)利用在一定試驗(yàn)條件下LOX酶電泳然后通過考馬斯亮藍(lán)蛋白質(zhì)染色使LOX同功酶帶顯色出來，該方法也會因一種LOX的缺失而發(fā)生其它LOX等電點(diǎn)正極漂移現(xiàn)象。
1．4單克隆抗體檢測法利用純化的LOX酶作為抗原誘發(fā)哺乳動物如小白鼠免等產(chǎn)生專一性的抗體，形成雜交瘤，利用雜交瘤產(chǎn)生對LOX酶專一性的單克隆抗體，檢測時通過抗原抗體結(jié)合的反應(yīng)，顯示酶的活性大小，該法結(jié)果可靠準(zhǔn)確，但需要較高的技術(shù)條件和昂貴的儀器設(shè)備。
目前使用的方法均需要一定較高的試驗(yàn)條件特定的專業(yè)技術(shù)人員才能完成，不宜廣泛推廣應(yīng)用。
本發(fā)明的目的是提供一種新的作物脂肪氧化酶同功酶LOX-1、LOX-2、LOX-3的檢測方法，快速、直觀便捷地測定大豆、水稻中LOX-1、LOX-2、LOX-3酶的有無或多少。
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
一種作物脂肪氧化酶同功酶LOX-1、LOX-2、LOX-3的檢測方法，其特征在于將作物果實(shí)研成粉末加入檢測液，振蕩3～10分鐘，并放置10～15分鐘后，再加入指示液，指示液的顏色變淺或消褪，則表示該作物中存在脂肪氧化酶同功酶LOX-1或LOX-2或LOX-3，如指示液顏色不變，則表示LOX-1或LOX-2或LOX-3酶缺失。
所述作物為水稻或大豆。
檢測水稻脂肪氧化酶同功酶LOX-1時，a、檢測液的組成為PH4.0～5.0，150mM～250mM的醋酸緩沖液，0～2.0％(W/V)吐溫20，.0～15％(V/V)的甘油；b、指示液的組成為PH4.0～5.0，150～250mM硼醋酸緩沖液20～30ml，50～150μM次甲基藍(lán)3～7ml，5～15mM亞油酸鈉3～7ml，蒸餾水3～7ml。
檢測水稻脂肪氧化酶同功酶LOX-2時，a、檢測液的組成為PH5.0～6.0，150mM～250mM的醋酸緩沖液，含0～2.0％(W/V)吐溫20，.0～15％(V/V)的甘油；
b、指示液的組成為二硫蘇糖醇120～180mg，PH5～6，150～250mM醋酸緩沖液20～30ml，50～150μM次甲基藍(lán)3～7ml，丙酮3～7ml，5～15mM亞油酸鈉3～7ml。
檢測水稻脂肪氧化酶同功酶LOX-3時，a、檢測液的組成為PH6.0～7.0，150～250mM磷酸緩沖液，含0～2.0％(W/V)吐溫20，0～15％(V/V)的甘油；b、指示液的組成為PH6～7，150～250mM磷酸緩沖液20～30ml，5～15mM亞油酸鈉3～7ml，蒸餾水3～7ml，β-葫蘿卜素+丙酮1/2～1/10飽和度3～7ml。
檢測水稻脂肪氧化酶同功酶LOX-1時，a、檢測液的組成為PH4.6，200mM的醋酸緩沖液，含1.5％(W/V)吐溫20，10％(V/V)的甘油；b、指示液的組成為PH4.6，200mM醋酸緩沖液25ml，100μM次甲基藍(lán)5ml，10mM亞油酸鈉5ml，蒸餾水5ml。
檢測水稻脂肪氧化酶同功酶LOX-2時，a、檢測液的組成為PH5.6，200mM醋酸緩沖液，含1.5％(W/V)吐溫20，10％(V/V)甘油；b、指示液的組成為二硫蘇糖醇154mg，PH5.6，200mM醋酸緩沖液25ml，100μM次甲基藍(lán)5ml，丙酮5ml，10mM亞油酸鈉5ml。
檢測水稻脂肪氧化酶同功酶LOX-3時，a、檢測液的組成為PH6.6，200mM磷酸緩沖液，含1.5％(W/V)吐溫20，10％(V/V)的甘油；b、指示液的組成為PH6.6，200mM磷酸緩沖液25ml，10mM亞油酸鈉5ml，蒸餾水5ml，1/2～1/10飽和度β-葫蘿卜素+丙酮5ml。
檢測大豆脂肪氧化酶同功酶LOX-1時，a、檢測液為蒸餾水或PH8.5～9.5，150～250mM硼酸緩沖液，含0～30mMCaCL2b、指示液的組成為PH8.5～9.5，150～250mM硼酸緩沖液20～30ml，50～150μM次甲基藍(lán)3～7ml，5～15mM亞油酸鈉3～7ml，蒸餾水3～7ml。
檢測大豆脂肪氧化酶同功酶LOX-2時，a、檢測液為蒸餾水或PH5.8～6.4，150～250mM磷酸緩沖液，含0～30mMCaCL2；b、指示液的組成為二硫蘇糖醇120～180mg，PH5.8～6.4，150～250mM磷酸緩沖液20～30ml，50～150μM次甲基藍(lán)3～7ml，丙酮3～7ml，5～15mM亞油酸鈉3～7ml。
檢測大豆脂肪氧化酶同功酶LOX-3時，a、檢測液為PH6.5～7.0，150～250mM磷酸緩沖液或蒸餾水，0～30mMCaCL2；b、指示液組成為PH6.5～7.0，150～250mM磷酸緩沖液20～30ml，5～15mM亞油酸鈉3～7ml，蒸餾水3～7ml，1/2～1/10飽和度β-葫蘿卜素+丙酮3～7ml。
檢測大豆脂肪氧化酶同功酶LOX-1時，a、檢測液PH9.0 200mM硼酸緩沖液，含20mM CaCL2；b、指示液組成為PH9.0，200mM硼酸緩沖液25ml，100μM次甲基藍(lán)5ml，10mM亞油酸鈉5ml，蒸餾水5ml。
檢測大豆脂肪氧化酶同功酶LOX-2時，a、檢測液PH6.0 200mM磷酸緩沖液，20mM CaCL2b、指示液為二硫蘇糖醇154mg，PH6.0，200mM磷酸緩沖液25ml，100μM次甲基藍(lán)5ml，丙酮5ml，10mM亞油酸鈉5ml。
檢測大豆脂肪氧化酶同功酶LOX-3時，a、檢測液為PH6.6，200mM磷酸緩沖液，20mM CaCL2；b、指示液的組成為PH6.6，200mM磷酸緩沖液25ml，10mM亞油酸鈉5ml，蒸餾水5ml，1/2～1/10飽和度β-葫蘿卜素+丙酮5ml。
該發(fā)明利用LOX酶能偶聯(lián)氧化類胡蘿卜素甲基藍(lán)等氧化還原指示劑產(chǎn)生漂白反應(yīng)的顯色過程。利用β-胡蘿卜素作為LOX-3的指示劑，用次甲基藍(lán)作為LOX-1和LOX-2的指示劑，通過目測LOX酶和指示劑反應(yīng)的結(jié)果，判斷作物品種LOX同功酶的缺失，缺失同功酶的種類以及LOX酶的活性大小。
上述測試方法加以完善簡化制成專用的試劑盒，根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康?、檢測對象、試劑特點(diǎn)進(jìn)行組合，以確保試劑的穩(wěn)定性，便于較長時間保存，其中指示液宜用深棕色容器并充氮?dú)獍b。
本方法的優(yōu)點(diǎn)及用途優(yōu)點(diǎn)①用該方法具有簡便、快速，結(jié)果準(zhǔn)確等特點(diǎn)，因?yàn)樘峁㎜OX存在和缺失的陰、陽對照，對結(jié)果判別一目了然。
②不需復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)條件和高精密的試驗(yàn)儀器。
③易于制成試劑盒，便于攜帶和推廣。
④對使用者來說，不要求較高的文化，步驟簡單，并可根據(jù)對照進(jìn)行結(jié)果判斷，易于操作。
用途①可供農(nóng)作物育種者在選擇LOX缺失的材料、品系、品種中，根據(jù)LOX酶活性有無判斷LOX酶基因是否缺失，決定該材料的利用價值。
②糧食部門(特別是國家、地方、部隊(duì)專用糧貯備庫、大豆貯備庫)中長期種子庫、農(nóng)民貯糧大戶；豆制品、豆?jié){加工企業(yè)收購原料時作為檢測其耐貯藏性，加工品質(zhì)的依據(jù)。
③方便購買大豆原料自制豆?jié){的消費(fèi)者能保證購買到無豆腥味的大豆。
以下通過實(shí)施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。實(shí)施例一、配制檢測液和指示液水稻
大豆
二、檢測過程1、水稻品種LOX的檢測取20粒稻谷，去殼機(jī)去殼后，用取胚器將胚取出，再將其放入研缽中，加液N2充分研磨后將其移入比色管中加1mlLOXA液充分振蕩3～10min再放置15min，加入4ml B液振蕩均勻，同時作一對照觀察觀察，30～60min后顏色即變淺即證明該品種稻谷含LOX量較高。
2、大豆夢豐品種檢測稱取大豆夢豐品種粉末2.5mg加0.5ml LOX-3 A液充分振蕩3-10分鐘放置，再加入2ml B液振蕩均勻同時作一對照觀察可見顏色不變化，證明該品種LOX-3含量較低。
權(quán)利要求
1.一種作物脂肪氧化酶同功酶LOX-1、LOX-2、LOX-3的檢測方法，其特征在于將作物果實(shí)研成粉末加入檢測液，振蕩3～10分鐘，并放置10～15分鐘后，再加入指示液，指示液的顏色變淺或消褪，則表示該作物中存在脂肪氧化酶同功酶LOX-1或LOX-2或LOX-3，如指示液顏色不變，則表示LOX-1或LOX-2或LOX-3酶缺失。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的作物脂肪氧化酶同功酶LOX-1、LOX-2、LOX-3的檢測方法，其特征在于所述作物為水稻或大豆。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的作物脂肪氧化酶同功酶LOX-1、LOX-2、LOX-3的檢測方法，其特征在于檢測水稻脂肪氧化酶同功酶LOX-1時，a、檢測液的組成為PH4.0～5.0，150mM～250mM的醋酸緩沖液，0～2.0％(W/V)吐溫20，.0～15％(V/V)的甘油；b、指示液的組成為PH4.0～5.0，150～250mM硼醋酸緩沖液20～30ml，50～150μM次甲基藍(lán)3～7ml，5～15mM亞油酸鈉3～7ml，蒸餾水3～7ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的作物脂肪氧化酶同功酶LOX-1、LOX-2、LOX-3的檢測方法，其特征在于檢測水稻脂肪氧化酶同功酶LOX-2時，a、檢測液的組成為PH5.0～6.0，150mM～250mM的醋酸緩沖液，含0～2.0％(W/V)吐溫20，.0～15％(V/V)的甘油；b、指示液的組成為二硫蘇糖醇120～180mg，PH5～6，150～250mM醋酸緩沖液20～30ml，50～150μM次甲基藍(lán)3～7ml，丙酮3～7ml，5～15mM亞油酸鈉3～7ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的作物脂肪氧化酶同功酶LOX-1、LOX-2、LOX-3的檢測方法，其特征在于檢測水稻脂肪氧化酶同功酶LOX-3時，a、檢測液的組成為PH6.0～7.0，150～250mM磷酸緩沖液，含0～2.0％(W/V)吐溫20，0～15％(V/V)的甘油；b、指示液的組成為PH6～7，150～250mM磷酸緩沖液20～30ml，5～15mM亞油酸鈉3～7ml，蒸餾水3～7ml，β-葫蘿卜素+丙酮1/2～1/10飽和度3～7ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的作物脂肪氧化酶同功酶LOX-1、LOX-2、LOX-3的檢測方法，其特征在于檢測水稻脂肪氧化酶同功酶LOX-1時，a、檢測液的組成為PH4.6，200mM的醋酸緩沖液，含1.5％(W/V)吐溫20，10％(V/V)的甘油；b、指示液的組成為PH4.6，200mM醋酸緩沖液25ml，100μM次甲基藍(lán)5ml，10mM亞油酸鈉5ml，蒸餾水5ml。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的作物脂肪氧化酶同功酶LOX-1、LOX-2、LOX-3的檢測方法，其特征在于檢測水稻脂肪氧化酶同功酶LOX-2時，a、檢測液的組成為PH5.6，200mM醋酸緩沖液，含1.5％(W/V)吐溫20，10％(V/V)甘油；b、指示液的組成為二硫蘇糖醇154mg，PH5.6，200mM醋酸緩沖液25ml，100μM次甲基藍(lán)5ml，丙酮5ml，10mM亞油酸鈉5ml。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的作物脂肪氧化酶同功酶LOX-1、LOX-2、LOX-3的檢測方法，其特征在于檢測水稻脂肪氧化酶同功酶LOX-3時，a、檢測液的組成為PH6.6，200mM磷酸緩沖液，含1.5％(W/V)吐溫20，10％(V/V)的甘油；b、指示液的組成為PH6.6，200mM磷酸緩沖液25ml，10mM亞油酸鈉5ml，蒸餾水5ml，1/2～1/10飽和度β-葫蘿卜素+丙酮5ml。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的作物脂肪氧化酶同功酶LOX-1、LOX-2、LOX-3的檢測方法，其特征在于檢測大豆脂肪氧化酶同功酶LOX-1時，a、檢測液為蒸餾水或PH8.5～9.5，150～250mM硼酸緩沖液，含0～30mMCaCL2；b、指示液的組成為PH8.5～9.5，150～250mM硼酸緩沖液20～30ml，50～150μM次甲基藍(lán)3～7ml，5～15mM亞油酸鈉3～7ml，蒸餾水3～7ml。
10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的作物脂肪氧化酶同功酶LOX-1、LOX-2、LOX-3的檢測方法，其特征在于檢測大豆脂肪氧化酶同功酶LOX-2時，a、檢測液為蒸餾水或PH5.8～6.4，150～250mM磷酸緩沖液，含0～30mMCaCL2；b、指示液的組成為二硫蘇糖醇120～180mg，PH5.8～6.4，150～250mM磷酸緩沖液20～30ml，50～150μM次甲基藍(lán)3～7ml，丙酮3～7ml，5～15mM亞油酸鈉3～7ml。
11.根據(jù)權(quán)利要求2所述的作物脂肪氧化酶同功酶LOX-1、LOX-2、LOX-3的檢測方法，其特征在于檢測大豆脂肪氧化酶同功酶LOX-3時，a、檢測液為PH6.5～7.0，150～250mM磷酸緩沖液或蒸餾水，0～30mMCaCL2；b、指示液組成為PH6.5～7.0，150～250mM磷酸緩沖液20～30ml，5～15mM亞油酸鈉3～7ml，蒸餾水3～7ml，1/2～1/10飽和度β-葫蘿卜素+丙酮3～7ml。
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的作物脂肪氧化酶同功酶LOX-1、LOX-2、LOX-3的檢測方法，其特征在于檢測大豆脂肪氧化酶同功酶LOX-1時，a、檢測液PH9.0 200mM硼酸緩沖液，含20mM CaCL2；b、指示液組成為PH9.0，200mM硼酸緩沖液25ml，100μM次甲基藍(lán)5ml，10mM亞油酸鈉5ml，蒸餾水5ml。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的作物脂肪氧化酶同功酶LOX-1、LOX-2、LOX-3的檢測方法，其特征在于檢測大豆脂肪氧化酶同功酶LOX-2時，a、檢測液PH6.0 200mM磷酸緩沖液，20mM CaCL2b、指示液為二硫蘇糖醇154mg，PH6.0，200mM磷酸緩沖液25ml，100μM次甲基藍(lán)5ml，丙酮5ml，10mM亞油酸鈉5ml。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的作物脂肪氧化酶同功酶LOX-1、LOX-2、LOX-3的檢測方法，其特征在于檢測大豆脂肪氧化酶同功酶LOX-3時，a、檢測液為PH6.6，200mM磷酸緩沖液，20mM CaCL2；b、指示液的組成為PH6.6，200mM磷酸緩沖液25ml，10mM亞油酸鈉5ml，蒸餾水5ml，1/2～1/10飽和度β-葫蘿卜素+丙酮5ml。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種作物脂肪氧化酶同功酶LOX—1、LOX—2、LOX—3的檢測方法,是將被檢測作物的器官研磨粉碎加入檢測液,振蕩后放置,再加入指示液,通過觀察指示液的顏色變淺或消褪,則表示該作物種子和果實(shí)中存在脂肪氧化酶同功酶LOX—1或LOX—2或LOX—3,該方法檢測LOX酶快捷,可作為選育耐貯藏水稻,無豆腥味大豆作物新品種的依據(jù),也可作為糧食收貯企業(yè)收購大豆、水稻時判斷其耐貯藏性,加工品質(zhì)的依據(jù)。
文檔編號C12Q1/26GK1296080SQ00112539
公開日2001年5月23日 申請日期2000年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月13日
發(fā)明者吳躍進(jìn), 吳敬德, 張瑛, 童繼平, 鄭樂婭 申請人:安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所