本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及抗毒素SO_1445或其編碼基因在提高質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定性中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
：

質(zhì)粒廣泛存在于許多細(xì)菌以及酵母菌等生物中，是細(xì)胞染色體外能夠自主復(fù)制的很小的環(huán)狀DNA分子。質(zhì)粒是分子操作的基礎(chǔ)，經(jīng)過(guò)改造質(zhì)粒作為載體廣泛的被應(yīng)用在原核生物及真核生物的基因操作中。

目前用于生產(chǎn)各種抗生素，蛋白以及生活中常用的酶等的工程菌的構(gòu)建主要有兩種方法：第一種方法是將編碼基因或基因簇整合到基因組上，這樣外源基因編碼的產(chǎn)物就可以在細(xì)胞內(nèi)持續(xù)且穩(wěn)定的表達(dá)。這種方法的缺點(diǎn)是表達(dá)量相對(duì)低，導(dǎo)致目的產(chǎn)物的獲得量低；第二種方法是通過(guò)將表達(dá)目的產(chǎn)物的基因或者基因簇克隆到中高拷貝的表達(dá)質(zhì)粒上，通過(guò)添加誘導(dǎo)劑或利用組成型啟動(dòng)子來(lái)大量表達(dá)目的產(chǎn)物。該種方法的缺點(diǎn)是質(zhì)粒表達(dá)載體一般都不穩(wěn)定，通常需要添加抗生素來(lái)維持?？股氐奶砑硬粌H會(huì)增加生產(chǎn)成本，更重要的是會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，同時(shí)加重抗生素的擴(kuò)散問(wèn)題。不僅在生產(chǎn)中，在科學(xué)研究中，如何來(lái)維持質(zhì)粒在不同宿主中的穩(wěn)定性已成為限制質(zhì)粒使用的重要因素。

為了能夠克隆大片段DNA或增加質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率，目前生產(chǎn)以及研究中常用的質(zhì)粒通常較小，在胞內(nèi)拷貝數(shù)較高。這些載體質(zhì)粒不具有獨(dú)立的復(fù)制，且在宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定性很差，克隆載體在細(xì)菌或者細(xì)胞中的維持主要通過(guò)添加抗生素來(lái)實(shí)現(xiàn)。目前質(zhì)粒的拷貝數(shù)多少一般與質(zhì)粒的穩(wěn)定性呈反比，通過(guò)降低質(zhì)粒的拷貝數(shù)來(lái)增加質(zhì)粒的穩(wěn)定性。對(duì)于如何增加中高拷貝質(zhì)粒的穩(wěn)定性目前還很少有研究報(bào)道，而通過(guò)在質(zhì)粒上引入單獨(dú)的抗毒素來(lái)增加質(zhì)粒的穩(wěn)定性方面的研究還沒(méi)有報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
：

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供抗毒素SO_1445或其編碼基因在提高質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定性中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供抗毒素SO_1445在提高質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定性中的應(yīng)用，所述的抗毒素SO_1445的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供編碼所述的抗毒素SO_1445的抗毒素基因SO_1445在提高質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定性中的應(yīng)用。

優(yōu)選，所述的抗毒素基因SO_1445的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種含有抗毒素基因SO_1445或如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的重組質(zhì)粒，所述的抗毒素基因SO_1445的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述的質(zhì)粒優(yōu)選為pCA24N、pUC19或pACYC184。

本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種宿主細(xì)胞，其特征在于，所述的宿主細(xì)胞含有上述的重組質(zhì)粒。

所述的宿主細(xì)胞優(yōu)選為大腸桿菌BW25113。

本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供一種提高質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定性的方法，其特征在于，將抗毒素基因SO_1445或如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列連接到質(zhì)粒上構(gòu)建成重組質(zhì)粒，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中，所述的抗毒素基因SO_1445的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述的質(zhì)粒優(yōu)選為pCA24N、pUC19或pACYC184。

本發(fā)明從希瓦氏菌MR-1中克隆得到抗毒素基因SO_1445，將抗毒素基因SO_1445連接到質(zhì)粒上，在不添加抗生素的條件下，在不同天數(shù)時(shí)檢測(cè)引入抗毒素基因SO_1445的重組質(zhì)粒與空質(zhì)粒在宿主中的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)引入抗毒素基因SO_1445的重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性相較空質(zhì)粒顯著增加。本發(fā)明不僅有望減少抗生素在生產(chǎn)以及科學(xué)研究中的使用，同時(shí)為穩(wěn)定質(zhì)粒在細(xì)菌宿主中的存在提供了新的方法與策略。

具體實(shí)施方式：

以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，僅用于例證，而不是對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。

實(shí)施例1：在常用質(zhì)粒pCA24N，pUC19，pACYC184上克隆抗毒素基因SO_1445

(1)在常用質(zhì)粒pCA24N上克隆抗毒素基因SO_1445

pCA24N質(zhì)粒為模式菌大腸桿菌中的中等拷貝數(shù)表達(dá)載體，常用于特定蛋白在胞內(nèi)的表達(dá)純化等。利用Tiangen試劑盒提取野生型希瓦氏菌MR-1基因組DNA作為后續(xù)PCR克隆的模板；設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增抗毒素基因SO_1445(其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)的引物，引物序列如下：上游引物SO_1445-F(pCA24N)：5’-GCCAGCACAATCAAACCCGTGTC-3’；下游引物SO_1445-R(pCA24N)：5’-CCTTTGTGGCATGTAGGGGCTGCC-3’。以SO_1445-F(pCA24N)和SO_1445-R(pCA24N)為引物，野生型希瓦氏菌MR-1基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增抗毒素基因SO_1445的編碼區(qū)，PCR擴(kuò)增條件為：先95℃5min；然后95℃30s，56℃30s，72℃30s，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃10min。反應(yīng)結(jié)束后，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0％瓊脂糖凝膠電泳，回收并純化約300bp的目的基因片段。

再將其與經(jīng)sacI單酶切，去磷酸化處理的載體pCA24N用T4DNA連接酶(TaKaRa公司)進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌BW25113感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，PCR驗(yàn)證并送測(cè)序公司測(cè)序獲得重組質(zhì)粒pCA24N-SO_1445以及含有該重組質(zhì)粒的目的菌株。

(2)在常用質(zhì)粒pUC19上克隆抗毒素基因SO_1445

pUC19質(zhì)粒為常用的高拷貝質(zhì)粒，不含有可供目的基因使用的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，在進(jìn)行克隆時(shí)將抗毒素基因SO_1445以及SO_1445上游的啟動(dòng)子區(qū)域(上游290bp，如SEQ ID NO.1的第1～第290位堿基所示)一同克隆到pUC19中(即將SEQ ID NO.1所示的序列克隆到載體pUC19中)，pUC19采用商業(yè)化的pMD19-T(TaKaRa公司)替代。設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增抗毒素基因SO_1445以及上游啟動(dòng)子區(qū)域的引物，引物序列如下：上游引物SO_1445-F(pUC19)：5’-AAGGTCATAATGCTTCTGCGACG-3’與下游引物SO_1445-R(pUC19)：5’-CTATTTGTGGCATGTAGGGGCT-3’。以野生型希瓦氏MR-1基因組DNA為模板，以SO_1445-F(pUC19)和SO_1445-R(pUC19)為引物，PCR擴(kuò)增抗毒素基因SO_1445以及上游啟動(dòng)子區(qū)，PCR擴(kuò)增條件為：先95℃5min；然后95℃30s，56℃30s，72℃1min，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃10min。反應(yīng)結(jié)束后，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0％瓊脂糖凝膠電泳，回收并純化約600bp的目的基因片段，將其克隆入載體pMD19-T(TaKaRa公司)中，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BW25113感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，PCR驗(yàn)證并送測(cè)序公司測(cè)序獲得重組質(zhì)粒pUC19-P_{SO_1445}-SO_1445以及含有該重組質(zhì)粒的目的菌株。

(3)在常用質(zhì)粒pACYC184上克隆抗毒素基因SO_1445

pACYC184質(zhì)粒的復(fù)制起始區(qū)來(lái)源于p15A質(zhì)粒，它的特點(diǎn)是可以與ColE1類型的質(zhì)粒(pUC19，pBR322等)在細(xì)胞內(nèi)兼容。pACYC184質(zhì)粒不含有可供目的基因使用的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，因此在進(jìn)行克隆時(shí)將抗毒素基因SO_1445以及SO_1445上游的啟動(dòng)子區(qū)域(上游290bp，如SEQ ID NO.1的第1～第290位堿基所示)一同克隆到pACYC184中(即將如SEQ ID NO.1所示的序列克隆到載體pACYC184中)。與前述構(gòu)建方法相同，設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增抗毒素基因SO_1445的引物，引物序列如下：上游引物SO_1445-F(pACYC184)：5’-CTAGTCTAGAAAGGTCATAATGCTTCTGCGACG-3’(下劃線部分為XbaI酶切位點(diǎn))；下游引物SO_1445-R(pACYC184)：5’-CTAGTCTAGACTATTTGTGGCATGTAGGGGCT-3’(下劃線部分為X baI酶切位點(diǎn))。以野生型希瓦氏MR-1基因組DNA為模板，以SO_1445-F(pACYC184)和SO_1445-R(pACYC184)為引物，PCR擴(kuò)增抗毒素基因SO_1445以及上游啟動(dòng)子區(qū)域，PCR擴(kuò)增條件為：先95℃5min；然后95℃30s，56℃30s，72℃1min，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃10min。反應(yīng)結(jié)束后，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0％瓊脂糖凝膠電泳，回收并純化約600bp的目的基因片段，將純化后的目的基因片段與提純的pACYC184利用相同的限制性內(nèi)切酶XbaI進(jìn)行酶切，酶切后的pACYC184進(jìn)行去磷酸化處理，然后將具有相同粘性末端的目的片段與pACYC184用T4DNA連接酶(TaKaRa公司)進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌BW25113感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，PCR驗(yàn)證并送測(cè)序公司測(cè)序獲得重組質(zhì)粒pACYC184-P_{SO_1445}-SO_1445以及含有該重組質(zhì)粒的目的菌株。

實(shí)施例2：檢測(cè)克隆有抗毒素基因SO_1445的重組質(zhì)粒與空白質(zhì)粒在大腸桿菌中的穩(wěn)定性

對(duì)實(shí)施例1中構(gòu)建的含有重組質(zhì)粒的目的菌株進(jìn)行質(zhì)粒穩(wěn)定性測(cè)試，具體方法如下：

(l)將含有空載體pCA24N的大腸桿菌BW25113以及含有重組載體pCA24N-SO_1445的大腸桿菌BW25113目的菌株單克隆分別接種于25mL培養(yǎng)基(每升培養(yǎng)基中含有胰蛋白胨10g，酵母粉5g和NaCl 10g，120℃滅菌20min)中，在37℃，180rpm條件下振蕩培養(yǎng)12小時(shí)。

(2)每12h轉(zhuǎn)接一次，每次按照1％的接種量進(jìn)行轉(zhuǎn)接。

(3)每傳代兩次(24h)，對(duì)質(zhì)粒的丟失情況進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)方法為：將對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的菌液進(jìn)行梯度稀釋，梯度稀釋后涂布到無(wú)抗生素的LB平板(總的菌數(shù))，挑取單菌落對(duì)應(yīng)點(diǎn)在氯霉素(30μg/mL)的LB抗性平板(含有質(zhì)粒的菌數(shù))。本發(fā)明中用(含有質(zhì)粒的細(xì)菌數(shù)/總的菌數(shù)×100％)代表質(zhì)粒的維持率。

(4)統(tǒng)計(jì)不同培養(yǎng)天數(shù)下，空質(zhì)粒pCA24N與攜帶了抗毒素基因SO_1445的重組質(zhì)粒pCA24N-SO_1445在大腸桿菌中的穩(wěn)定情況(見(jiàn)表1)。

(5)利用相同的檢測(cè)方法，在大腸桿菌中檢測(cè)重組質(zhì)粒pUC19-P_{SO_1445}-SO_1445與空質(zhì)粒pUC19在對(duì)應(yīng)LB平板(總的菌數(shù))與氨芐青霉素(100μg/mL)LB抗性平板(含有質(zhì)粒的菌數(shù))的生長(zhǎng)情況，統(tǒng)計(jì)兩者在不同天數(shù)的穩(wěn)定情況(見(jiàn)表2)；在大腸桿菌中檢測(cè)重組質(zhì)粒pACYC184-P_{SO_1445}-SO_1445與空質(zhì)粒pACYC184在對(duì)應(yīng)LB平板(總的菌數(shù))與氯霉素(30μg/mL)LB抗性平板(含有質(zhì)粒的菌數(shù))的生長(zhǎng)情況，統(tǒng)計(jì)兩者在不同天數(shù)的穩(wěn)定情況(見(jiàn)表3)。以上質(zhì)粒穩(wěn)定性檢測(cè)均重復(fù)至少2次。

表1 大腸桿菌在不添加抗生素進(jìn)行傳代培養(yǎng)時(shí)胞內(nèi)的質(zhì)粒穩(wěn)定性情況

表2 大腸桿菌在不添加抗生素進(jìn)行傳代培養(yǎng)時(shí)胞內(nèi)的質(zhì)粒穩(wěn)定性情況

表3 大腸桿菌在不添加抗生素進(jìn)行傳代培養(yǎng)時(shí)胞內(nèi)的質(zhì)粒穩(wěn)定性情況

質(zhì)粒的穩(wěn)定情況統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1，2，3所示。結(jié)果顯示，實(shí)施例l中構(gòu)建的重組質(zhì)粒pCA24N-SO_1445，pUC19-P_{SO_1445}-SO_1445和pACYC184-P_{SO_1445}-SO_1445與相應(yīng)的空質(zhì)粒相比穩(wěn)定性顯著提高。與pCA24N相比，pCA24N-SO_1445在五天之后的穩(wěn)定性高于前者500倍左右；與pUC19相比，pUC19-P_{SO_1445}-SO_1445在五天之后的穩(wěn)定性高于前者3000倍左右；與pACYC184相比，pACYC184-P_{SO_1445}-SO_1445在六天之后的穩(wěn)定性高于前者60倍左右。

實(shí)施例3：克隆其它基因到質(zhì)粒pCA24N上，并不能夠增加質(zhì)粒在大腸桿菌中的穩(wěn)定性為了排除基因SO_1445增加質(zhì)粒穩(wěn)定性只是因?yàn)楦淖兞速|(zhì)粒的結(jié)構(gòu)這種可能性，我們分別對(duì)選取的陰性對(duì)照基因在相同的宿主中檢測(cè)了它們穩(wěn)定質(zhì)粒pCA24N的能力。

(1)根據(jù)實(shí)施例1步驟(1)中pCA24N重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法，將基因mqsA，mazE以及melA(AT00_02290)分別克隆到質(zhì)粒pCA24N中?；騧qsA，mazE來(lái)源于大腸桿菌基因組，melA(AT00_02290)基因來(lái)源于海洋菌Pseudoalteromonas lipolytica SCSIO 04301基因組。通過(guò)與實(shí)施例1步驟(1)方法相同的酶切，連接，轉(zhuǎn)化，得到重組質(zhì)粒：pCA24N-mqsA，pCA24N-mazE和pCA24N-melA。

(2)采取與實(shí)施例2中相同的操作方法，檢測(cè)重組質(zhì)粒pCA24N-mqsA，pCA24N-mazE和pCA24N-melA在大腸桿菌中的穩(wěn)定性。統(tǒng)計(jì)重組質(zhì)粒與空質(zhì)粒pCA24N分別在大腸桿菌中的穩(wěn)定情況。

表4 大腸桿菌在不添加抗生素進(jìn)行傳代培養(yǎng)時(shí)胞內(nèi)的質(zhì)粒穩(wěn)定性情況

質(zhì)粒的穩(wěn)定情況統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表4所示。結(jié)果顯示，本實(shí)施例中構(gòu)建的重組質(zhì)粒pCA24N-mqsA，pCA24N-mazE和pCA24N-melA與相應(yīng)的空質(zhì)粒相比穩(wěn)定性沒(méi)有顯著性差異?？梢?jiàn)，實(shí)施例2中抗毒素基因SO_1445增加質(zhì)粒在宿主中的穩(wěn)定性，并不是因?yàn)楦淖兞速|(zhì)粒的結(jié)構(gòu)引起。

序列表

<110> 中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所

<120> 抗毒素SO_1445或其編碼基因在提高質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定性中的應(yīng)用

<160> 3

<210> 1

<211> 575

<212> DNA

<213> 希瓦氏菌MR-1

<400> 1

ataatgcttc tgcgacggta ttgagtgcta agtcagccat tagccaaacc ctataaacga 60

tagcggcatg tcgccgctat cgtttttatc cttattgcga ttagattgaa gattagcgtg 120

atgacggcgt aacattagtg cccagttaag cgatacaaac tatcttctat catccttgag 180

ctgatggcgt tgctcgagca gaaaagtaaa ccgagtaatc attatttttt tgtaccacgt 240

tatgctaagg tattacctag tagtactaag cattactttt ggagtcacag atgagcacaa 300

tcaaacccgt gtcggttaaa ttagatgccg atattaaagc cagagtcgag catttagcgg 360

aaacccgtaa acgttcatca cactggatga tgcgtgaagc gatccgtgaa tatgttgaga 420

gagaagagaa acgcgaagct ttgcagcaag aagcgttacg cgcatgggaa gaacaccaga 480

catcaggctt gcatgtcacc ggtgacgaag tggtgagttg gctggagtcc tggggaagtg 540

aaaatgaaca ggcagcccct acatgccaca aatag 575

<210> 2

<211> 285

<212> DNA

<213> 希瓦氏菌MR-1

<400> 2

atgagcacaa tcaaacccgt gtcggttaaa ttagatgccg atattaaagc cagagtcgag 60

catttagcgg aaacccgtaa acgttcatca cactggatga tgcgtgaagc gatccgtgaa 120

tatgttgaga gagaagagaa acgcgaagct ttgcagcaag aagcgttacg cgcatgggaa 180

gaacaccaga catcaggctt gcatgtcacc ggtgacgaag tggtgagttg gctggagtcc 240

tggggaagtg aaaatgaaca ggcagcccct acatgccaca aatag 285

<210> 3

<211> 94

<212> PRT

<213> 希瓦氏菌MR-1

<400> 3

Met Ser Thr Ile Lys Pro Val Ser Val Lys Leu Asp Ala Asp Ile

5 10 15

Lys Ala Arg Val Glu His Leu Ala Glu Thr Arg Lys Arg Ser Ser

20 25 30

His Trp Met Met Arg Glu Ala Ile Arg Glu Tyr Val Glu Arg Glu

35 40 45

Glu Lys Arg Glu Ala Leu Gln Gln Glu Ala Leu Arg Ala Trp Glu

50 55 60

Glu His Gln Thr Ser Gly Leu His Val Thr Gly Asp Glu Val Val

65 70 75

Ser Trp Leu Glu Ser Trp Gly Ser Glu Asn Glu Gln Ala Ala Pro

80 85 90

Thr Cys His Lys

94