專利名稱：一種通用型原核高效可溶性融合表達載體的構(gòu)建及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及構(gòu)建了一種原核融合表達載體，具體涉及構(gòu)建了一種適合原核表達系 統(tǒng)的融合載體，該載體能使許多在原核表達系統(tǒng)低表達、低活性的功能蛋白或細胞因子在 大腸桿菌中得到高效，可溶性表達，并具有良好的生物活性。本發(fā)明構(gòu)建的融合表達載體在 利用原核表達系統(tǒng)生產(chǎn)重組蛋白藥物、抗原診斷試劑和酶學活性功能蛋白方面具有重要的 應(yīng)用價值。
背景技術(shù)：
大腸桿菌(E. coli)因為具有遺傳背景清楚、代時短、易控制等優(yōu)點，已經(jīng)成為生 產(chǎn)重組蛋白的主要工程菌。但是并非每一種外源基因都能在其中有效表達?；蜃陨愍毺?的結(jié)構(gòu)、mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率、蛋白質(zhì)折疊的難易程度、宿主細胞蛋白酶對蛋白質(zhì)的降 解、外源基因和E. coli在密碼子利用上的差別以及蛋白質(zhì)對宿主的潛在毒性等因素影響 外源基因的表達量。同時，原核表達系統(tǒng)缺乏形成二硫鍵的能力，利用原核表達系統(tǒng)生產(chǎn)的 重組蛋白往往形成包含體，變性復(fù)性后產(chǎn)品往往生物活性很低。采用融合表達的方法可以 提高目的蛋白的表達量和可溶性。目前常用的融合伴體有GST、MBP、NusA等，利用這些融合 伴體進行融合表達雖然可以提高目的蛋白的表達量和可溶性，但生成的重組蛋白往往由于 不能形成正確的空間結(jié)構(gòu)而使獲得的重組蛋白生物活性非常低，某些蛋白在除去融合伴體 后可能重新形成聚體沉淀。大腸桿菌自身二硫鍵的形成都是在其具有氧化性環(huán)境的周質(zhì)腔進行的。而在大腸 桿菌細胞質(zhì)表達的重組蛋白因大腸桿菌細胞質(zhì)的還原性環(huán)境不易形成正確的二硫鍵和完 整的四級結(jié)構(gòu)。大腸桿菌周質(zhì)腔內(nèi)二硫鍵形成蛋白家族成員是大腸桿菌自身蛋白形成正確 二硫鍵的關(guān)鍵因素，它們具有二硫鍵氧化還原酶或異構(gòu)酶的性質(zhì)，起輔助二硫鍵形成的作 用。這些二硫鍵形成蛋白一級結(jié)構(gòu)中都含有活性位點Cys-X-X-Cys，只是中間的氨基酸組成 不同。其中，二硫鍵形成蛋白A(Disulfide bond formation protein A，DsbA)直接參與二 硫鍵的形成，是迄今所發(fā)現(xiàn)的硫氧還蛋白家族中氧化性最強的一個，在體內(nèi)和體外DsbA均 能協(xié)助蛋白質(zhì)折疊。研究發(fā)現(xiàn)，將DsbA的功能區(qū)域Cys-Pro-His-Cys中的兩個Cys定點突 變?yōu)镾er，構(gòu)成Ser-Pro-His-Ser結(jié)構(gòu)，突變后的DsbA蛋白即DsbA_蛋白不再具有氧化還 原酶的功能，但仍然具有促目的蛋白可溶和細胞定位的作用。在原核表達體系中，利用DsbA 作為融合伴體可以輔助目的蛋白正確的二硫鍵空間配對，得到具有良好生物活性的目的蛋 白-DsbA融合蛋白；利用DsbAmut蛋白作為融合伴體可以大大提高融合蛋白的可溶性和表 達量。本發(fā)明是鑒于DsbA和DsbAmut蛋白性質(zhì)特點，將二者串聯(lián)起來以DsbA-DsbAmut融 合蛋白作為原核表達系統(tǒng)融合伴體蛋白，構(gòu)建了一種通用型原核高效可溶性融合表達載體 (pET-dsbA-dsbAmut)。并以此載體實現(xiàn)了多個功能蛋白原核可溶性的融合表達，表達的目的 蛋白具有良好的生物活性。目前尚未見以DsbA-DsbA_串聯(lián)蛋白作為原核表達融合蛋白的 研究報道。因此，本發(fā)明構(gòu)建的融合表達載體(pET-dsbA-dsbAmut)在原核系統(tǒng)內(nèi)生產(chǎn)重組
3基因工程藥、診斷型試劑的研發(fā)、生產(chǎn)功能性酶類蛋白以及研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能方面等 都具有潛在的應(yīng)用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是構(gòu)建了一種通用型原核融合表達載體(pET-dsbA-dsbAmut)。利用本載體 可以實現(xiàn)功能蛋白尤其是富含二硫鍵的功能蛋白在原核系統(tǒng)中的可溶性表達，同時，本載 體生產(chǎn)的重組蛋白在保持目的蛋白生物活性方面具有明顯優(yōu)勢。融合表達載體pET-dsbA-dsbAm結(jié)構(gòu)特點1)載體以T7啟動子，表達宿主菌為BL21(DE3)系列，通過IPTG進行誘導重組蛋白 的表達。2)翻譯起始位點含有Ncol內(nèi)切酶位點，可以通過Ncol內(nèi)切酶位點獨立表達重組 蛋白。3)在DsbA與DsbAm蛋白以及DsbAm與目的蛋白之間均含有36個氨基酸組成的柔 性linker短肽，有利于DsbA行使其氧化二硫鍵形成和分子伴侶的功能以及DsbAm蛋白的 促溶和提高表達量的功能。4)在融合蛋白的N端帶有組氨酸標簽，有利于表達的融合蛋白通過金屬鏊合樹脂 進行親和純化。5)含有的多克隆位點(MCS)包括6個限制性內(nèi)切酶位點GTCGAC (Sal)、 AAGCTT (Hindlll)、GCGGCCGC (NotI)、GAATTC (EcoRI)、GCTAGC (Nhel)、CTCGAG (Xhol)，使外源 蛋白基因克隆時具有較多的選擇性。6)在多克隆位點前有凝血酶識別位點CTGGTGCCGCGCGGCAGC(LVPRGS)，可以通過 凝血酶對表達的融合蛋白酶切作用而純化出重組靶蛋白。融合表達載體(pET-dsbA-dsbAmut)的優(yōu)點1)載體以T7為啟動子和帶有提高表達量的融合伴體DsbAmut蛋白使表達的重組融 合蛋白表達量可占菌體總蛋白的40%以上。2)表達的融合蛋白中含有DsbA，該蛋白可以輔助目的蛋白的正確折疊和二硫鍵 的形成。3)在表達條件優(yōu)化的條件下可以獲得融合蛋白可溶性表達，這有利于后期的純化 和保持目的蛋白的生物活性。4)對表達的外源蛋白沒有選擇性，可以使絕大多數(shù)的真核蛋白實現(xiàn)高效可溶性表 達。


圖1是融合表達載體pET-dsbA-dsbAmut構(gòu)建的模式圖(a)和質(zhì)粒圖譜(b)；圖2是pET-dsbA-dsbAmut原核融合表達霍亂毒素B亞單位(CTB) SDS-PAGE分析 圖。利用載體表達的霍亂毒素B亞單位(Cholera toxin B Subunit, CTB)全菌體融合蛋 白、超聲破碎和親和純化SDS-PAGE分析。其中a:l.誘導的全菌體；2.無誘導全菌體對照； M. protein marker ；b :M. protein marker ；3.；4.；c :1. Hft 一步親和純化 DsbA-DsbAmut-CTB ；M. proteinmarker ；
圖3是pET-dsbA-dsbAmut原核融合表達前列腺特異性抗原(PSA) SDS-PAGE分析圖。 利用載體表達的前列腺特異性抗原(prostate specific antigen, PSA)全菌體融合蛋白、 超聲破碎、親和純化SDS-PAGE分析以及Western-Blot鑒定。其中a :M :protein marker ；
1.無誘導全菌體對照；2.誘導的全菌體；3.菌體超聲上清；4.菌體超聲沉淀；b:M :protein marker ； 1.鎳柱一步親和純化DsbA_DsbAmut-PSA蛋白； 圖4是pET-dsbA-dsbAmut原核融合表達人神經(jīng)生長因子(hNGF) SDS-PAGE分析圖。 利用載體表達的人神經(jīng)生長因子(hNGF)全菌體融合蛋白、超聲破碎、親和純化SDS-PAGE分 析以及Western-Blot和生物活性鑒定。其中a :M :proteinmarker ；1.無誘導全菌體對照；
2.誘導的全菌體；b3.菌體超聲上清；4.菌體超聲沉淀；M :protein marker ；c 1.鎳柱一 步親和純化 DsbA-DsbAmut-hNGF 蛋白；M. protein marker ；
具體實施例方式實施例1、融合表達載體的構(gòu)建1)首先以載體pET-28a(NOVagen公司)為基本框架，PCR擴增得到的dsbA序列通 過限制性內(nèi)切酶位點Ndel和BamHI克隆到載體pET_28a中構(gòu)建載體pET-dsbA。2)采用定點突變的方法將載體上原有的凝血酶識別位點進行突變，使其不在被凝 血酶識別。突變前CCATGGGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATG下劃線對應(yīng)的氨基酸序列為LVPRGS被凝血酶識別突變后CCATGGGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCACTGTTTCTAGCGATAGCCATATG下劃線對應(yīng)的氨基酸序列為TKSSRS不被凝血酶識別3)通過定點突變和重疊PCR獲得dsbAmut序列，點突變包括TGC突變?yōu)锳GC(Cys 突變?yōu)镾er)以及同義突變GGA突變?yōu)镚GT(Gly)。合成108堿基linker序列，然后再 通過重疊PCR獲得1 inker-dsbAmut-l inker序列通過限制性內(nèi)切酶位點BamHI和Xhol 克隆到載體pET-dsbA中，其中在linker-dsbAm-l inker序列的C端帶有多克隆位點 (MCS)序列分別是 GTCGAC(Sal)、AAGCTT(Hindlll)、GCGGCCGC(NotI)、GAATTC(EcoRI)、 GCTAGC (Nhel)和CTCGAG (Xhol)。在多克隆位點(MCS)前含有有凝血酶識別位點序列 CTGGTGCCGCGCGGCAGC (LVPRGS)，從而構(gòu)建完整的融合表達載體pET-dsbA_dsbAmut。構(gòu)建載體 的模式圖和質(zhì)粒圖譜見圖1。4)融合蛋白及多克隆位點核酸序列為GCGCAGTATGAAGATGGTAAACAGTACACTACCCTGGAAAAACCGGTAGCTGGCGCGCCGCAAGTGCTGGAGTTTTTCTCTTTCTTCTGCCCGCACTGCTATCAGTTTGAAGAAGTTCTGCATATTTCTGATAATGTGAAGAAAAAACTGCCGGAAGGCGTGAAGATGACTAAATACCACGTCAACTTCATGGGTGGTGACCTGGGCAAAGATCTGACTCAGGCATGGGCTGTGGCGATGGCGCTGGGCGTGGAAGACAAAGTGACTGTTCCGCTGTTTGAAGGCGTACAGAAAACCCAGACCATTCGTTCTGCTTCTGATATCCGCGATGTATTTATCAACGCAGGTATTAAAGGTGAAGAGTACGACGCGGCGTGGAACAGCTTCGTGGTGAAATCTCT
GGTCGCTCAGCAGGAAAAAGCTGCAGCTGACGTGCAATTGCGTGGCGTTCCGGCGATGTTTGTTAACGGTAAATATCAGCTGAATCCGCAGGGTATGGATACCAGCAATATGGATGTTTTTGTTCAGCAGTATGCTGATACAGTGAAATATCTGTCCGAGAAAAAAGGATCC GGTGATGAAGATGAAGATAGCATGCCC
GATTCTCTGGAAGTTCTGTTCCAAGGGCCCGGGCTCGAACGGCCGCAATGCATCATG GCGCAGTATGAAGATGGTAAACAGTACACTACCCTGGAAAAACCGGTAGCTGGCGCGCCGCAAGTGCTGGAGTTTTTCTCTTTCTTC A GCCCGCAC A GCTATCAGTTTGAAGAAGTTCTGCATATTTCTGATAATGTGAAGAAAAAACTGCCGGAAGGCGTGAAGATGACTAAATACCACGTCAACTTCATGGGTGG rT GACCTGGGCAAAGATCTGACTCAGGCATGGGCTGTGGCGATGG
CGCTGGGCGTGGAAGACAAAGTGACTGTTCCGCTGTTTGAAGGCGTACAGAAAACCCAGACCATTCGTTCTGCTTCTGATATCCGCGATGTATTTATCAACGCAGGTATTAAAGGTGAAGAGTACGACGCGGCGTGGAACAGCTTCGGGTGAAATCTCTGGTCGCTCAGCAGGAAAAAGCTGCAGCTGACGTGCAATTGCGTGGCGTTCCGGCGATGTTTGTTAACGGTAAATATCAGCTGAATCCGCAGGGTATGGATACCAGCAATATGGATGTTTTTGTTCAGCAGTATGCTGATACAGTGAAATATCTGTCCGAGAAAAAA GGTGATGAAGATGAAGATAGCATG
CCCGATTCTCTGGAAGTTCTGTTCCAAGGGCCCGGGCTCGAACGGCCGCAATGCATCATG CTGGTGCCGCGCGGCAGC \GTCGAC(Sal)AAGCTT(HindIl
l)GCGGCCGC(NotI)GAATTC(EcoRI)GCTAGC(NheI)CTCGAG(XhoI)其中黑體部分為linker序列，黑體下劃線為堿基定點突變包括TGC突變?yōu)?AGC(Cys突變?yōu)镾er)以及同義突變GGA突變?yōu)镚GT (Gly)，下劃線為凝血酶酶切位點序列 CTGGTGCCGCGCGGCAGC(LVPRGS)，框內(nèi)為多克隆位點，包括有6個限制性內(nèi)切酶位點[GTCGAC(Sal)AAGCTT(HindiII)GCGGCCGC(Not I)GAATTC(EcoRI)GCTAGC(Nhel) CTCGAG(Xhol)]實施例2、外源基因的表達純化將PCR擴增得到外源基因⑴序列通過多克隆位點(MCS)克隆到表達載體 PET-dsbA-dsbAmut上。轉(zhuǎn)化表達菌株BL21 (DE3)中，取測序正確的pET-dsbA_dsbAm-X表達 菌株BL21 (DE3)轉(zhuǎn)接卡那LB培養(yǎng)基于37°C進行活化，當菌體生長密度(0D)值約為0. 4時 加入IPTG使其終濃度為0. 3mmol。轉(zhuǎn)入29°C繼續(xù)誘導誘導7小時左右，收集表達的菌體， 6000轉(zhuǎn)/分，4°C離心5分鐘，收集沉淀菌體。取沉淀菌體加入1XPBS緩沖液4°C超聲破 菌，分別收集上清液和沉淀，利用融合蛋白N末端的His標簽通過M離子螯合樹脂對上清 里的融合蛋白進行親和層析純化。在純化所需的緩沖液體系選擇上，我們1XPBS系統(tǒng)緩沖 體系，在純化過程中，以50mmol咪唑的緩沖液洗脫結(jié)合的雜蛋白，以150mmol咪唑的緩沖液 洗脫目的蛋白。通過金屬螯合柱親和層析純化的融合蛋白DsbA-DsbAm-X經(jīng)過SDS-PAGE檢 測，純度基本都能達到> 90%。純化的融合蛋白水透析后真空冰干后_20°C冰箱保存。
實施例3、利用載體pET-dsbA-dsbAmut原核表達霍亂毒素B亞單位(CTB)霍亂毒素是引起霍亂腹瀉的主要作用物質(zhì)，由A、B2個亞單位組成，其B亞單位沒 有毒性，由5條相同的多肽鏈以非共價鍵形式連成一個五聚體環(huán)狀結(jié)構(gòu)?；魜y毒素B亞單 位(Cholera toxin B Subunit, CTB)是一種理想的制備抗病疫苗的載體和口服免疫佐劑， 目前利用原核系統(tǒng)表達的CTB蛋白都是以包含體的形式存在，未見有可溶性表達的報告。首先通過PCR擴增CTB產(chǎn)物，以限制性內(nèi)切酶SaLI、NotI雙酶切PCR產(chǎn)物，然后 在T4DNA連接酶的作用下于同樣雙酶切的質(zhì)粒質(zhì)粒pET-dsbA-dsbAm相連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21(DE3)。其次將轉(zhuǎn)化的pET-dsbA-dsbAm_CTB表達菌株BL21 (DE3)轉(zhuǎn)接卡那LB培養(yǎng)基于 37°C進行活化，當菌體生長密度(0D)值約為0.4時加入IPTG使其終濃度為0. 3mmol，轉(zhuǎn) 入29°C誘導誘導7小時左右。收集菌體加入1 XPBS緩沖液4°C超聲破菌，分別收集上清 液和沉淀，進行12% SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)果顯示經(jīng)原核表達系統(tǒng)表達后，重組融合蛋白 DsbA-DsbAm-CTB獲得較高的表達，融合蛋白可占菌體蛋白20%以上。經(jīng)過超聲破菌后發(fā)現(xiàn)， 融合蛋白DsbA-DsbAm-CTB絕大部分都是以可溶性形式存在超聲上清中(分子量為60kDa) 并占上清總蛋白的50%以上。利用融合蛋白N末端的His標簽通過M離子螯合樹脂對上清中融合蛋白 DsbA-DsbAm-CTB進行親和層析純化。以50mmol咪唑+1 XPBS的緩沖液洗脫結(jié)合的雜蛋白， 以150mmol咪唑+1 XPBS的緩沖液洗脫目的蛋白。通過金屬螯合柱親和層析純化的融合蛋 白DsbA-DsbAm-CTB，經(jīng)過SDS-PAGE檢測，純度達到> 90%。純化的融合蛋白水透析后真空 冰干后_20°C冰箱保存，冰干后的融合蛋白水溶性達到100%。以上實驗結(jié)果見圖2。 實施例4、利用載體pET-dsbA-dsbAmut原核表達前列腺特異性抗原(PSA)前列腺特異性抗原(prostate specific antigen，PSA)是診斷前列腺癌的腫瘤標 志物，其在前列腺癌篩選、診斷和術(shù)后監(jiān)測中發(fā)揮了巨大作用，同時PSA有抑制血管生成作 用，降低腫瘤形成，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲。目前應(yīng)用于臨床診斷和治療的PSA都是從精液中 提取，這種方法材料集取繁瑣，無法大批量生產(chǎn)，原核表達末有可溶性表達的報道。PCR擴增PSA核酸序列，以Not I和Sal I雙酶切與同樣雙酶切的融合表達載體 PET-dsbA-dsbAmut連接酶進行連接，將其轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21 (DE3)。取表達菌株按比例接菌到新鮮LB培養(yǎng)基中，在0D_為0. 4 0. 6時，加入誘 導物IPTG至終濃度為0. 3mmol/L，29°C誘導7h。收集菌體加入1XPBS緩沖液4°C超聲破 菌，分別收集上清液和沉淀，進行12% SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)果顯示經(jīng)原核表達系統(tǒng)表達 后，重組融合蛋白DsbA-DsbAm-PSA獲得較高的表達，融合蛋白可占菌體蛋白40%以上。經(jīng) 過超聲破菌后發(fā)現(xiàn)，融合蛋白DsbA-DsbAm-PSA部分是以可溶性形式存在超聲上清中(分子 量為74kDa)，并占上清總蛋白的50%以上。利用融合蛋白N末端的His標簽通過M離子螯合樹脂對上清中融合蛋白 DsbA-DsbAm-PSA進行親和層析純化。以50mmol咪唑+1 XPBS的緩沖液洗脫結(jié)合的雜蛋白， 以150mmol咪唑+1 XPBS的緩沖液洗脫目的蛋白。通過金屬螯合柱親和層析純化的融合蛋 白DsbA-DsbAm-PSA，經(jīng)過SDS-PAGE檢測，純度達到> 95%。純化的融合蛋白水透析后真空 冰干后_20°C冰箱保存，冰干后的融合蛋白水溶性達到100%。
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取純化的DsbA-DsbAm_PSA 融合蛋白 12% SDS-PAGE。以兔抗人 PSA 為一抗 Western 印跡分析DsbA-DsbAm-PSA融合蛋白免疫原性，Western-Blot結(jié)果顯示原核表達的融合 蛋白DsbA-DsbAm-PSA能特異的結(jié)合人源PSA抗體，說明原核系統(tǒng)表達和純化的融合蛋 白DsbA-DsbAm-PSA具有特異的免疫原性。利用載體pET-dsbA-dsbAmut表達的融合蛋白 DsbA-DsbAm-PSA可以結(jié)合人源PSA產(chǎn)生的抗體，為臨床相關(guān)疾病的監(jiān)測、診斷和治療提供 關(guān)鍵材料。以上實驗結(jié)果見圖3。實施例5、利用載體pET-dsbA-dsbAmut原核表達人神經(jīng)生長因子(hNGF)NGF(nerve growth factor)有利于中樞和周圍神經(jīng)元的存活和分化，對老年癡呆 病、周圍神經(jīng)病變和脊髓損傷有治療作用。完整的NGF由a，3，Y3種肽鏈以的y2 的形式通過非共價鍵結(jié)合而成，其中3亞基具有神經(jīng)生長因子完全的生物學功能。3亞基 即為我們通常所說的NGF，它由2個120氨基酸通過非共價鍵結(jié)合而成的二聚體，每個單位 內(nèi)有3組二硫鍵。原核表達NGF表達量低，生物活性差，目前末有原核細胞質(zhì)可溶性表達的 報道。PCR擴增hNGF核酸序列，以Sal I和Not I雙酶切與同樣雙酶切的融合表達載體 PET-dsbA-dsbAmut連接酶進行連接，將其轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21 (DE3)。取表達菌株按1 %比例接菌到新鮮LB培養(yǎng)基中，在0D_為0. 3時，加入誘導物 IPTG至終濃度為0. 3mmol/L，29°C誘導7h。收集菌體加入1XPBS緩沖液4°C超聲破菌，分 別收集上清液和沉淀，進行12% SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)果顯示經(jīng)原核表達系統(tǒng)表達后，重 組融合蛋白DsbA-DsbAmut-hNGF獲得較高的表達，融合蛋白可占菌體蛋白60%以上。經(jīng)過超 聲破菌后發(fā)現(xiàn)，融合蛋白DsbA-DsbAmut-hNGF大部分是以可溶性形式存在超聲上清中(分子 量為64kDa)，并占上清總蛋白的50 %以上。利用融合蛋白N末端的His標簽通過M離子螯合樹脂對上清中融合蛋白 DsbA-DsbAmut-hNGF進行親和層析純化。以50mmol咪唑+1 XPBS的緩沖液洗脫結(jié)合的雜蛋 白，以150mmol咪唑+1 XPBS的緩沖液洗脫目的蛋白。通過金屬螯合柱親和層析純化的融 合蛋白DsbA-DsbAmut-hNGF，經(jīng)過SDS-PAGE檢測，純度達到> 98 %。純化的融合蛋白脫鹽或 水透析后真空冰干后-20°C冰箱保存，冰干后的融合蛋白水溶性達到100%。取純化的DsbA-DsbA_-hNGF融合蛋白12 % SDS-PAGE。以兔抗人NGF為一抗 Western印跡分析DsbA_DsbAmut-hNGF免疫原性，Western-Blot結(jié)果顯示原核表達的融 合蛋白DsbA-DsbAmut-NGF能特異的結(jié)合人NGF抗體，說明原核系統(tǒng)表達和純化的融合蛋白 DsbA-DsbAmut-PSA具有特異的免疫原性。以提取的小鼠NGF為陽性對照，無菌PBS為陰性對照，利用雞胚背根神經(jīng)節(jié)培養(yǎng)實 驗鑒定融合蛋白DsbA-DsbAmut-NGF生物活性。在倒置顯微鏡(X400倍)下觀察雞胚背根 神經(jīng)節(jié)神經(jīng)突起生長情況，結(jié)果證實融合蛋白DsbA-DsbAmut-NGF能促雞胚背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng) 突起生長，具有良好的生物活性。以上實驗結(jié)果見圖4。
權(quán)利要求
一種原核高效可溶性融合表達載體pET dsbA dsbAmut，其特征在于利用大腸桿菌二硫鍵形成蛋白(Disulfide bond)家族中DsbA與DsbA突變體DsbAmut蛋白串聯(lián)后(DsbA L DsbAmut)作為目的蛋白表達的融合伴體。
2.據(jù)權(quán)利要求1中所述方法，串聯(lián)融合蛋白可以是DsbA-L-DsbAmut或DsbAmut-L-DsbA 方式。
3.據(jù)權(quán)利要求1中所述方法，串聯(lián)蛋白中L(Iinker)序列中堿基數(shù)可以是3的任意整數(shù)倍。
4.據(jù)權(quán)利要求1中所述方法，DsbA-L-DsbAmut或DsbAmut-L-DsbA融合蛋白與外源蛋白 在原核表達系統(tǒng)中表達方式可以是融合表達或共表達形式。
5.據(jù)權(quán)利要求1中所述方法，DsbA-L-DsbAmut或DsbAmut-L-DsbA融合蛋白包括自身氨 基酸序列或其它形式的氨基酸改變?nèi)绨被崛笔?、增加或置換等。
6.權(quán)利要求1所述的表達載體在醫(yī)藥研究領(lǐng)域中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及利用大腸桿菌二硫鍵形成蛋白(Disulfide bond)家族中DsbA與DsbA突變體DsbAmut蛋白串聯(lián)后(DsbA-L-DsbAmut)作為原核表達目的蛋白的融合伴體構(gòu)建一種通用型原核融合表達載體pET-dsbA-dsbAmut。DsbA-L-DsbAmut融合蛋白具有二硫鍵氧化還原酶的動能也具有分子伴侶的作用，因此構(gòu)建的融合表達載體pET-dsbA-dsbAmut可以實現(xiàn)多肽或蛋白分子尤其是富含有二硫鍵的外源蛋白以高效、可溶的方式進行表達。利用此載體在生產(chǎn)基因工程產(chǎn)品、抗原診斷試劑、酶學活性功能蛋白和研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能方面都具有非常廣泛應(yīng)用前景。
文檔編號C12N15/70GK101955969SQ200910089018
公開日2011年1月26日 申請日期2009年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月20日
發(fā)明者丁紅梅, 劉農(nóng)樂, 孫衛(wèi)國, 李少華, 沈倍奮, 邵寧生, 陳留存 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所