專利名稱：：狂犬病病毒Flury-LEP疫苗株反向遺傳操作系統(tǒng)及LEP綠色熒光蛋白重組病毒載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及重組病毒疫苗領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及狂犬病病毒Flury-LEP疫苗株反向遺傳操作系統(tǒng)，其包括編碼LEP全長基因組cDNA的重組載體，及其輔助質(zhì)粒系統(tǒng)，其中所述輔助質(zhì)粒系統(tǒng)分別編碼LEP的核蛋白N、磷酸蛋白P及聚合酶蛋白L。本發(fā)明還涉及由該反向遺傳操作系統(tǒng)構(gòu)建的LEP綠色熒光蛋白重組病毒載體。更具體地，所述狂犬病病毒Flury-LEP疫苗株反向遺傳操作系統(tǒng)是pCI-LEP及其輔助質(zhì)粒系統(tǒng)pCAGG-N、pCAGG-P和pCAGG-L，所述LEP綠色熒光蛋白重組病毒載體是pCI-LEP-EGFP。本發(fā)明還涉及由所述狂犬病病毒Flury-LEP疫苗株反向遺傳操作系統(tǒng)及LEP綠色熒光蛋白重組病毒載體二者分別拯救的重組病毒，以及它們的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：狂犬病即瘋狗癥，又名恐水癥，是由狂犬病病毒RV引起的、侵害中樞神經(jīng)系統(tǒng)的急性病毒性人獸共患性傳染病。幾乎所有的溫血動物都對狂犬病病毒易感。犬類動物在傳播人狂犬病過程中起主要作用，是本病的主要宿主之一。此外，貓、浣熊、狐貍和蝙蝠等也會患病并傳播病毒?？袢鞑ネ緩街饕峭ㄟ^動物咬傷后，唾液中的狂犬病病毒經(jīng)破損皮膚侵入機體。此外，還可通過消化道、呼吸道以及動物密切接觸等途徑傳播?？袢∈瞧駷橹谷祟惒∷缆首罡叩募毙詡魅静。坏┌l(fā)病，病死率可高達100%。據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，在世界范圍內(nèi)每年約有60,000余人死于狂犬病，引起嚴重的公共健康問題，主要分布在亞洲、非洲和拉丁美洲等發(fā)展中國家。中國也是受狂犬病危害最為嚴重的國家之一?？袢〔《緦儆趶棤畈《究?、狂犬病毒屬，為不分節(jié)段單股負鏈RNA病毒，其基因組長約12kb，共編碼5個結(jié)構(gòu)蛋白核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基質(zhì)蛋白(M)、糖蛋白(G)和RNA聚合酶(L)?？袢〉念A(yù)防主要通過疫苗免疫的方式進行?？袢∫呙绶N類繁多，效果不一。自從1940年，Koprowski等人從病死女孩腦內(nèi)分離到狂犬病病毒Flury株，經(jīng)1日齡雛雞腦內(nèi)、雞胚卵黃囊傳代后，再經(jīng)雞胚傳代178代以上，無論神經(jīng)內(nèi)、外接種都對動物喪失致病力，但對于新生乳鼠和猴，在腦內(nèi)接種時仍具有殘留毒力[1]。在雞胚傳代68代以前的稱為"LEP"(雞胚低代株)，高于136代的稱為"HEP"(雞胚高代株)。Flmy-LEP株具有優(yōu)良的免疫原性，被廣泛用作人或動物的狂犬病滅活疫苗種毒株，還被包括中國在內(nèi)的許多國家用作預(yù)防犬狂犬病的弱毒疫苗?？蒲泄ぷ髡咭恢辈婚g斷地對狂犬病疫苗進行改進和創(chuàng)新，取得了豐碩的成果，但仍然存在很多不足。我國目前生產(chǎn)ERA株和Flmy株活疫苗。狂犬病弱毒疫苗在體內(nèi)的增殖過程與病原感染機體的過程相似，能誘導(dǎo)產(chǎn)生細胞免疫和體液免疫，且產(chǎn)生的免疫反應(yīng)較強，持續(xù)時間較長，在我國狂犬病防制工作中曾起到一定的積極作用。但有的疫苗毒株本身對乳鼠致病，對懷孕動物、免疫機能不全的動物和幼小動物使用不安全，而且存在毒力回升、返祖的潛在危險。因此，存在獲得更加安全的減毒活病毒疫苗株的需要。反向遺傳學(ReverseGenetics)是相對于經(jīng)典遺傳學而言的，經(jīng)典遺傳學是從生物的表型、性狀到遺傳物質(zhì)來研究生命的發(fā)生與發(fā)展規(guī)律的(由表及里)，反向遺傳學則是直接從生物的遺傳物質(zhì)入手來闡述生物生命發(fā)生的本質(zhì)現(xiàn)象(由里及表)，故與之相關(guān)的各種技術(shù)統(tǒng)稱為反向遺傳學技術(shù)。反向遺傳學通過DNA重組等技術(shù)有目的地、精確定位地改造改造基因的精細結(jié)構(gòu)以確定這些變化對表型、性狀的直接影響。RNA病毒的反向遺傳學技術(shù)是指由病毒的cDNA克隆獲取RNA病毒的一項技術(shù)，該技術(shù)通過人為加入DNA基因片段，實現(xiàn)了在DNA水平上對RNA病毒基因組的人工操作。反向遺傳系統(tǒng)可以對RNA病毒直接進行遺傳操作，為RNA病毒的分子生物學研究提供了一種強大的工具。自20世紀70年代后期第一例RNA病毒感染性克隆構(gòu)建成功以來，RNA病毒的分子生物學研究取得了長足的進展，這在很大程度上歸功于各種RNA病毒反向遺傳系統(tǒng)的建立。正鏈RNA病毒全長基因組RNA轉(zhuǎn)染進入真核細胞，可以導(dǎo)致病毒蛋白表達和病毒復(fù)制。相比之下，負鏈RNA病毒基因組RNA的存在并無感染性。啟動病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，除病毒基因組外，同時需要病毒聚合酶復(fù)合體的共表達；此外，還要求病毒基因組與核衣殼蛋白結(jié)合形成復(fù)合體。對基因組cDNA進行突變、缺失或外源基因插入修飾后，通過反向遺傳操作系統(tǒng)(reversegeneticsystem,RGS)可獲得相應(yīng)的突變或重組的負鏈RNA病毒。目前，反向遺傳操作技術(shù)廣泛用于研究病毒的生命周期，病毒裝配，病毒蛋白在其致病性中的作用以及病毒蛋白與宿主細胞的相互關(guān)系，同時也為我們開發(fā)弱毒活疫苗和病毒載體開辟了新的捷徑[2]。目前，在國內(nèi)外尚未有Flmy-LEP株反向遺傳操作系統(tǒng)的報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及狂犬病病毒Flmy-LEP疫苗株反向遺傳操作系統(tǒng)以及由該反向遺傳操作系統(tǒng)構(gòu)建的LEP綠色熒光蛋白重組病毒載體。更具體地，所述狂犬病病毒Flmy-LEP疫苗株反向遺傳操作系統(tǒng)包括pCI-LEP及其輔助質(zhì)粒系統(tǒng)，其中所述輔助質(zhì)粒系統(tǒng)分別編碼LEP的核蛋白N、磷酸蛋白P及聚合酶蛋白L，并且優(yōu)選地，所述LEP綠色熒光蛋白重組病毒載體是pCI-LEP-EGFP，所述輔助質(zhì)粒系統(tǒng)包括pCAGG-N、pCAGG-P和pCAGG-L。本發(fā)明還涉及由所述狂犬病病毒Flmy-LEP疫苗株反向遺傳操作系統(tǒng)及LEP綠色熒光蛋白重組病毒載體二者分別拯救的重組病毒，以及它們的應(yīng)用。在第一方面中，本發(fā)明通過將LEP全長基因組cDNA(SEQIDNO:1)克隆至攜帶CMV啟動子的質(zhì)粒中，并且構(gòu)建LEP的輔助質(zhì)粒系統(tǒng)，從而構(gòu)建了狂犬病病毒Flury-LEP株反向遺傳操作系統(tǒng)，并在此基礎(chǔ)上成功構(gòu)建了表達綠色熒光蛋白重組病毒載體。所述LEP的輔助質(zhì)粒系統(tǒng)包括pCAGG-N、pCAGG-P和pCAGG-L，其分別編碼LEP的核蛋白(N)、磷酸蛋白(P)及聚合酶蛋白(L)。具體而言，所述攜帶CMV啟動子的質(zhì)粒包括，但不限于，pCI和pCAGG等。利用攜帶CMV啟動子的質(zhì)粒的優(yōu)點在于，攜帶CMV啟動子的質(zhì)粒利用細胞內(nèi)的RNA聚合酶II進行轉(zhuǎn)錄，而無需傳統(tǒng)的T7聚合酶系統(tǒng)，因此理論上可以在任何真核細胞系中拯救病毒。5在一個優(yōu)選實施方案中，所述狂犬病病毒Flury-LEP株反向遺傳操作系統(tǒng)是pCI-LEP及其輔助質(zhì)粒系統(tǒng)，其中pCI-LEP通過將LEP全長基因組cDNA克隆至pCI質(zhì)粒中而構(gòu)建，并且所述輔助質(zhì)粒系統(tǒng)是pCAGG-N、pCAGG-P和pCAGG-L。所述表達綠色熒光蛋白重組病毒載體是pCI-LEP-EGFP，其通過將編碼綠色熒光蛋白EGFP的核苷酸克隆至上述pCI-LEP中而構(gòu)建。在第二方面中，利用本發(fā)明第一方面的狂犬病病毒Flury-LEP株反向遺傳操作系統(tǒng)，從Flmy-LEP疫苗株基因組cDNA克隆成功獲得拯救病毒株rLEP，并且利用上述表達綠色熒光蛋白的LEP重組病毒載體和輔助質(zhì)粒系統(tǒng)，成功拯救了表達外源綠色熒光蛋白EGFP的感染性重組病毒株rLEP-EGFP。在第三方面中，本發(fā)明鑒定了拯救的Fhiry-LEP(rLEP)的生物學特性。本發(fā)明人檢測了野生型LEP(wtLEP)和在第二方面中拯救的重組LEP(rLEP)在神經(jīng)元細胞NA和非神經(jīng)元細胞BHK-21上的生長動力學曲線，如圖5所示，rLEP在兩種細胞上的的生長性能與wtLEP沒有顯著差異，這表明從LEP基因組全長cDNA拯救的rLEP的生長特性與wtLEP是一致的。此外，本發(fā)明人還檢測了wtLEP和rLEP的嗜神經(jīng)指數(shù)，結(jié)果顯示在表4中，wtLEP和rLEP的嗜神經(jīng)指數(shù)均為0.8，沒有差異。最后，本發(fā)明人還檢測了wtLEP和rLEP對小鼠的致病性，測定了wtLEP和rLEP的LD5Q，分別為8.8個FFU和2個FFU。結(jié)果表明，rLEP與wtLEP對小鼠的致病性沒有顯著差異。通過以上幾項關(guān)于rLEP和wtLEP的生物學特性的測定，可見以LEP基因組全長cDNA克隆獲救的rLEP與野生毒株wtLEP在生物學特性上并無顯著差異。這表明，重組狂犬病病毒株rLEP具有作為預(yù)防狂犬病的活載體疫苗應(yīng)用的潛力。因此，本發(fā)明第一方面構(gòu)建的狂犬病病毒Flmy-LEP株反向遺傳操作系統(tǒng)和表達綠色熒光蛋白重組病毒載體可以作為在分子水平研究、構(gòu)建和改造狂犬病病毒疫苗的有效平臺。在第四方面中，本發(fā)明提供第一方面所述的狂犬病病毒Flury-LEP株反向遺傳操作系統(tǒng)和表達綠色熒光蛋白重組病毒載體的應(yīng)用。利用本發(fā)明的反向遺傳操作系統(tǒng)，可對Flmy-LEP株基因組毒力相關(guān)位點進行定點突變修飾，獲得更加安全的減毒活毒疫苗株，研究不同毒力毒株的分子致病機理。另外，表達EGFP的重組Flury-LEP的成功構(gòu)建還表明所述狂犬病病毒Flury-LEP株反向遺傳操作系統(tǒng)還是一個很好的表達外源蛋白的載體，既可在病毒基因組插入導(dǎo)致病毒減毒和增強免疫反應(yīng)的外源基因，也可插入額外的G基因以增強免疫原性，或者是從基因組中刪除某個完整的病毒基因，使病毒無法繁殖而失去毒力。因此，狂犬病病毒Flury-LEP株反向遺傳操作系統(tǒng)還可以用于構(gòu)建表達犬瘟熱等其它重要病原保護性免疫原的重組病毒，研制出可同時預(yù)防狂犬病及犬瘟熱等其它疫病的重組二聯(lián)活載體疫苗。所述表達綠色熒光蛋白重組病毒載體也是構(gòu)建表達其它外源蛋白的重組病毒載體的基礎(chǔ)，由其拯救的表達EGFP的LEP重組病毒rLEP-EGFP可以用于直接觀察病毒的增殖狀態(tài)，分析LEP病毒的擴散和致病性，等等。從下面結(jié)合附圖的詳細描述中，本發(fā)明的上述特征和優(yōu)點將更明顯，其中-圖1顯示狂犬病病毒Flury-LEP疫苗株全長基因組cDNA的重組載體pCI-LEP的構(gòu)建示意圖2顯示從亞基因組cDNA片段構(gòu)建rLEP-EGFPcDNA的策略。(a).通過PCR在LEP基因組4卯6位后定點突變，引入PmeI位點，(b).經(jīng)PCR在EGFP基因5'端引入Pmel位點、GE、GS，在3'端引入Pmel位點，EGFP基因經(jīng)Pmel位點插入pCI-LEP的G和L之間的基因間隔區(qū)；圖3是感染拯救病毒rLEP的NA細胞的間接免疫熒光照片。(a)感染拯救病毒rLEP的NA細胞的間接免疫熒光分析照片；(b)以陰性血清為一抗觀察IFA結(jié)果；圖4顯示rLEP-EGFP感染BHK-21細胞48小時后熒光顯微鏡觀察顯示出自發(fā)熒光。(a)rLEP-EGFP感染BHK-21細胞48小時后熒光顯微鏡觀察的自發(fā)熒光，(b)空白BHK-21細胞熒光顯微鏡下觀察結(jié)果；圖5顯示野生型LEP(wtLEP)和拯救的rLEP病毒在NA細胞(a)和BHK-21細胞(b)上的生長動力學曲線；圖6顯示質(zhì)粒pCAGG(a)和pCI系列載體(b)的圖譜。具體實施例方式以下通過實施例來進一步闡明本發(fā)明。但是應(yīng)該理解，所述實施例只是舉例說明的目的，并不意欲限制本發(fā)明的范圍和精神。實施例1狂犬病病毒Flury-LEP株反向遺傳操作系統(tǒng)及其表達綠色熒光蛋白的重組病毒載體的構(gòu)建和生物學活性1材料1.1質(zhì)粒、細胞株和病毒質(zhì)粒pCAGG、pCI-RBz購自中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所，pBluescriptllSK(+)購自clonetech。BHK-21細胞(ATCCCC1-10)和293T細胞(CRL—11268)購自ATCC，培養(yǎng)基均為含10%胎牛血清的DMEM，小鼠腦神經(jīng)瘤細胞NA細胞購自軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的MEM，狂犬病病毒Flury-LEP購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，在BHK-21細胞上擴增，-70匸凍存?zhèn)溆谩?.2主要試劑和儀器T4DNA連接酶，限制性內(nèi)切酶MzeI，5^1，M"，五coiI，I等均購自大連TaKaRa公司。PhusionTM超保真DNA聚合酶，限制性內(nèi)切酶化rII購自NEB公司。RNA提取試劑Trizol，SuperScript"^m反轉(zhuǎn)錄試劑盒，無血清培養(yǎng)基Opti-MEM，轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000均購自Invitrogen公司。犢牛血清購自Gibco公司。LB培養(yǎng)基成分均購自O(shè)XOID公司。膠回收試劑盒(GelExtractionMiniKit)及質(zhì)粒小量提取試劑盒(PlasmidMiniKit)均購自O(shè)MEGA公司。質(zhì)粒中量提取試劑盒QIAfilterPlasmidMidiKit購自QIAGEN公司。鼠抗狂犬病病毒高免血清由本研究室按本領(lǐng)域常規(guī)方法制備。FITC標記的羊抗鼠熒光二抗購自Sigma公司。普通顯微鏡，購自O(shè)LYMPUS公司；熒光顯微鏡，購自ZEISS公司。PCR儀購自AppliedBiosystem公司。核酸測序采用BECKMANCEQ8000自動測序儀，所用試劑為BECKMAN公司產(chǎn)品。P2級生物安全柜購LABCONCO自公司。二氧化碳培養(yǎng)箱購自ThermoElectron公司。不同型號離心機均購自BECKMAN8公司。-70^超低溫冰箱購自仰8公司。普通冰箱冰柜購自海爾公司。全自動凈水機MILI-Q購自BIOCEL公司。各種規(guī)格細胞培養(yǎng)瓶及細胞培養(yǎng)板均購自CORNING公司。1.3引物參照GeneBank中所提供的Flury-HEP株基因組序列(GeneBank序列號AB085828)禾口Flury-LEP序列(GeneBank序列號DQ099524)，將Flury-LEP全長基因組cDNA序列(SEQIDNO:1)分為3段，艮P，F(xiàn)l，F(xiàn)2禾口F3，分別設(shè)計PCR弓1物。其中，片段F1為Flury-LEP全長基因組cDNA序列的1-4063核苷酸序列(SEQIDNO:2)，片段F2為Flury-LEP全長基因組cDNA序列的4013-8254核苷酸序列(SEQIDNO:3)，片段F3為Flury-LEP全長基因組cDNA序列的8187-11925核苷酸序列(SEQIDNO:4)。構(gòu)建上述全長基因組cDNA所用引物(表l)和構(gòu)建輔助質(zhì)粒所用引物(表2)均由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。_表lRT-PCR和全長基因組cDNA構(gòu)建所用的引物引物名稱引物序列F1-PF」G7rACGCTTAACAACAAAACCAAAGAA-3'F卜PR5'-GGCACGCGTACTCCACATAACTTGAGTTTGC-3'F2-PF5'-AGGCCTGTATAAGTCTTTAAAGGGAGCA-3'F2-PR5'-ATCGGGGTTCCCGGCCTCTTGACACAAC-3'F3-PF5'-TATGCTAGCTCTGGTTAAGCTCCCACGAATC-3'_AQ-3'_注cDNA片斷與圖l相一致。下劃線部分為病毒特異序列，黑體表示酶切位點，錘頭狀核酶(HamRz)和丁肝病毒核酶(HdvRz)用斜體表示。_表2輔助質(zhì)粒構(gòu)建所用的引物_引物名稱引物序列_^_L-N-PF5'-GGCGAATTCGCC4CCATGGATGCCGACAAGATTGT-3'L-NPR5'-CCGGGTACCTC,TATGAGTCACTCGAATACG-3,L-P-PF5'-GGCGAATTCGCC4CCATGAGCAAGATCTTTGTTAA-3'L-P-PR5'-CCGGGTACqXg^fTTAGCATGATGTGTAGCGATCC-3'L-L—PF5'-GGCGAATTCGCC4CCATGCTGGATCCGGGAGAGGTTTA-3'L-L-PR5'-CCGGGTACCITTAITTACAAACAACTGTAGTCTA-3'注下劃線部分為病毒特異序列，黑體表示酶切位點，突變堿基用字符邊框表示，Kozak序列用斜體表示。1.4病毒基因組的提取、反轉(zhuǎn)錄和PCR取Flury-LEP病毒液250pL，加入750pLTrizol，經(jīng)常規(guī)方法提取基因組RNA。提取的RNA用SuperScript，III反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(反轉(zhuǎn)錄引物見表l)，按該試劑盒說明書方法進行，獲得末端部分重疊的3個病毒cDNA片段Fl、F2和F3片段。1.5RT-PCR產(chǎn)物的克隆以1.4中獲得的末端部分重疊的3個病毒cDNA片段Fl、F2和F3片段為模板，將整個基因組分為末端部分重疊的3個片斷進行RT-PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)lQ/^瓊脂糖凝膠電泳，以膠回收試劑盒(購自O(shè)MEGA公司)回收Fl、F2和F3片段，分別克隆至pBluscriptIIKS(+/-)(Clontech)多克隆位點，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5(x，提取陽性質(zhì)粒，測序確保克隆的基因組片段與病毒基因組RNA序列完全一致。1.6Fhiry-LEP基因組全長cDNA克隆的構(gòu)建利用基因組cDNA片段Fl、F2和F3相鄰重疊部分存在的限制酶切位點進行連接組裝(示意圖見圖l)。具體地，參見圖l，首先將F3段cDNA經(jīng)A^eI和及wII位點克隆進pCI-RBz(pCI質(zhì)粒圖譜見圖6b)，所得質(zhì)粒命名為pCI-F3，再將Fl段經(jīng)iWzeI和MwI插入至UpCI-F3，所得質(zhì)粒命名為pCI-F31，最后將F2段經(jīng)5^/2I和MwI克隆進pCI-F31，至此Flury-LEP全基因組cDNA組裝完成，構(gòu)建成的病毒基因組轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒命名為pCI-LEP。該克隆在CMV啟動子之下、兩個核酶之間的全長cDNA可以在真核細胞RNA聚合酶的作用下得到轉(zhuǎn)錄，并且由于核酶的自身催化功能，可以保證轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的3'末端與病毒基因組精確一致。1.7表達EGFP重組基因組全長cDNA克隆的構(gòu)建為了救獲表達EGFP基因的重組LEP病毒，在病毒基因組轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒pCI-LEP的基礎(chǔ)上，利用兩對引物F2-PF和PmeI-PR，F(xiàn)2-PR和PmeI-PF，通過PCR方法在LEPcDNA第4906nt后引入PmeI限制性酶切位點(GTTTAAAC)。獲得的兩個PCR片段通過PmeI連接成一個完整的片段，并利用該片段兩端的酶切位點(同F(xiàn)2段)替換pCI-LEP上的F2段，從而構(gòu)建成重組基因組轉(zhuǎn)錄載體pCI-LEP-Pmel(見圖2a);再以pIRES-EGFP(Clonetech)為模板，以EGFP-PF和EGFP-PR為引物,通過PCR，在EGFP的ORF的5'端引入戶/^I限制酶識別序列和LEP自身聚合酶L識別的轉(zhuǎn)錄終止序列GE(AGAAAAAAA)及轉(zhuǎn)錄起始序列GS(AACATCCCT)，在EGFP的ORF的3'端引入PweI酶切位點識別序列；PCR產(chǎn)物經(jīng)戶weI酶切插入pCI-LEP-PmeI，構(gòu)建的表達EGFP重組基因組全長cDNA克隆命名為pCI-LEP-EGFP(見圖2b)。表3用于構(gòu)建表達EGFP基因的重組LEP基因組全長cDNA的PCR引物引物名稱引物序列_PmeI-PR5'-GACTTGAAGTTTAAACAGGATGACCGGCCTTCACAGTCTGGT-3'PmeI-PF5'-GTCATCCTGTTTAAACTTCAAGTCCCGAGGATAACCTCC-3'EGFP-PF5'-ATGCGTTTAAACAGAAAAAAATAACATCCCTCGCC4CCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3'EGFP-PR5'-GCATGTTTAAACTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3'_注下劃線部分為EGFP基因特異序列，黑體表示酶切位點，Kozak序列用斜體表示，基因起始信號和基因結(jié)束信號用字符邊框表示。1.8輔助質(zhì)粒系統(tǒng)的構(gòu)建以已成功構(gòu)建的pCI-LEP為模板，PCR擴增編碼核蛋白(N)、磷酸蛋白(P)及聚合酶蛋白(L)基因的開放閱讀框架(ORF)cDNA(核苷酸序列分別為SEQIDNOs:5-7，引物序列見表2)，分別克隆在pCAGG質(zhì)粒的多克隆位點(MCS)(pCAGG質(zhì)粒圖譜見圖6a)。在起始密碼子前引入Kozak序列(GCCACC)，以增強蛋白表達[3'4];在原有終止密碼子后增加一個終止密碼子，以有效終止輔助質(zhì)粒mRNA的轉(zhuǎn)錄。構(gòu)建成的輔助質(zhì)粒分別命名為pCAGG-N、pCAGG-P和pCAGG-L。1.9病毒拯救由LEP病毒基因組轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒pCI-LEP拯救LEP病毒轉(zhuǎn)染前一天，將293T細胞傳到35mm6孔板上，在10^DMEM培養(yǎng)基中37°。下培養(yǎng)，當細胞密度達到80%以上時即可進行轉(zhuǎn)染。將上述已構(gòu)建成功的pCI陽LEP、pCAGG-N、pCAGG-P、pCAGG-L分別以4嗎、2昭、l嗎、1]ig的量加入到250iLil無血清培養(yǎng)基OPTI-MEM中，混勻；取15^1LipofectamineTM2000溶于250(！1OPTI-MEM中，混勻后在室溫靜置5分鐘；然后將LipofectamineTM2000與轉(zhuǎn)染質(zhì)粒混合均勻，室溫孵育30分鐘。在此期間用OPTI-MEM洗滌293T細胞兩次，然后每孔加入OPTI-MEMlml，最后將LipofectamineTM2000-質(zhì)?；旌弦?0(^l加入細胞培養(yǎng)孔中，置于37。CC02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8小時后，吸棄轉(zhuǎn)染液，加入10XDMEM繼續(xù)培養(yǎng)。72小時后，仔細吹落培養(yǎng)板上的細胞，將培養(yǎng)液及細胞混合物全部接種BHK-21細胞。72小時后，在BHK-21細胞上用間接免疫熒光(IFA)檢測病毒滴度，簡言之，即以鼠抗狂犬病病毒高免血清為一抗，相同倍數(shù)稀釋的小鼠陰性血清為對照，熒光素(FITC)標記的羊抗鼠IgG(Sigma)為二抗，最后用熒光顯微鏡觀察結(jié)果。收獲上清液，獲救病毒株，獲救的病毒株命名為rLEP株。1.10重組病毒的拯救由pCI-LEP-EGFP拯救rLEP-EGFP重組病毒將pCI-LEP-EGFP與三個輔助質(zhì)粒pCAGG-N、pCAGG-P、pCAGG-L按上述1.9的方法共轉(zhuǎn)染293T細胞。72小時后，仔細吹落培養(yǎng)板上的細胞，將培養(yǎng)液及細胞混合物全部接種BHK-21細胞，48小時后用熒光顯微鏡觀察EGFP在感染細胞的表達情況。陰性對照為熒光顯微鏡下直接觀察空白BHK-21細胞。收獲上清液，獲救重組病毒株，獲救的重組病毒株命名為rLEP-EGFP株。1.11種毒的制備及滴定將獲救的病毒在BHK-21細胞上進行擴增，在5XDMEM培養(yǎng)基中，37。C培養(yǎng)72小時，收獲上清，制備種毒，存于一70。C。在NA細胞或BHK-21細胞上培養(yǎng)48小時后，以IFA(步驟同1.9)確定病毒滴度。病毒滴度用12病灶形成單位(focusformingunit)FFU表示。1.12病毒生長動力學曲線的測定為測定病毒生長動力學曲線，以M.O丄為0.01分別感染單層NA細胞和BHK-21細胞。感作1小時后，用無菌PBS洗2次后，分別加含0.2%FBS的MEM2ml和2%DMEM2ml于37。C培養(yǎng)。分別于接種后24小時、72小時和120小時取細胞培養(yǎng)液上清，在NA細胞和BHK-21細胞上測定滴度，繪制病毒生長動力學曲線。1.13小鼠半數(shù)致死量(LD5。)的測定將rLEP和野生病毒wtLEP用滅菌PBS作10倍倍比稀釋至lCr、將l(T410'7的各稀釋度分別取30|11，分別腦內(nèi)接種5只56周齡的Balb/c雌性小鼠。連續(xù)觀察21天，記錄每組小鼠的平均體重變化和死亡情況。利用Reed-Muench法計算小鼠半數(shù)致死量(LD5())[5]。2.結(jié)果2.1Flury-LEP株基因組全長cDNA的構(gòu)建為建立Flmy-LEP株的反向遺傳操作系統(tǒng)，必須首先構(gòu)建相應(yīng)基因組的全長cDNA克隆，作為基因組負鏈RNA轉(zhuǎn)錄模板，為此構(gòu)建了覆蓋整個基因組的三個cDNA克隆片段，利用各個片斷間重疊部分的酶切位點，在轉(zhuǎn)錄載體質(zhì)粒pCI上連接組裝獲得了11925nt的完整cDNA克隆，且cDNA片斷兩端加具有自我催化功能的錘頭狀核酶和丁肝核酶。構(gòu)建完成的質(zhì)粒命名為pCI-LEP。2.2輔助質(zhì)粒的構(gòu)建核蛋白(N)、磷酸蛋白(P)和聚合酶蛋白(L)組合形成的核糖核蛋白復(fù)合物(RNP)是啟動病毒復(fù)制必不可少的。將N、P和L基因克隆于pCAGG的MCS，使之在真核啟動子CMV的作用下轉(zhuǎn)錄mRNA，三種必需蛋白得到瞬時表達，從而啟動病毒RNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。2.3從全長cDNA克隆拯救病毒將質(zhì)粒pCI-LEP及表達RVN、P、L蛋白的輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞。3天后收獲細胞及上清，盲傳一代后IFA檢測是否成功拯救出病毒，結(jié)果以RV高免血清為一抗的細胞孔內(nèi)觀察到熒光信號(圖3a),以小鼠陰性血清為一抗的細胞孔內(nèi)觀察不到熒光信號(圖3b)。結(jié)果表明，通過反向遺傳技術(shù)，利用Flury-LEP疫苗株基因組cDNA克隆成功獲得拯救病毒株rLEP。2.4從全長cDNA克隆拯救重組病毒為了評估Flury-LEP疫苗株作為載體表達外源基因的可行性，將pCI-LEP-EGFP與三個輔助質(zhì)粒pCAGG-N、pCAGG-P、pCAGG-L共轉(zhuǎn)染293T細胞。用拯救的重組病毒感染BHK-21，48小時后熒光顯微鏡下可觀察到自發(fā)綠色熒光(圖4)。結(jié)果表明，運用反向遺傳操作技術(shù)成功地拯救了表達外源基因EGFP的感染性重組病毒株rLEP-EGFP。2.5拯救的Flury-LEP(rLEP)生物學特性的鑒定2.5.1動力學曲線野生型LEP(wtLEP)和拯救的LEP(rLEP)在神經(jīng)元細胞NA和非神經(jīng)元細胞BHK-21上的生長動力學曲線如圖5所示，rLEP在兩種細胞上的的生長性能與wtLEP沒有顯著差異，這表明從基因組全長cDNA拯救出來的rLEP的生長特性與wtLEP是一致的。2.5.2嗜神經(jīng)指數(shù)狂犬病病毒的體外嗜神經(jīng)指數(shù)是指病毒在NA細胞相對于BHK-21細胞上的感染性比例，嗜神經(jīng)指數(shù)為1即表示病毒在神經(jīng)表元細胞上感染的能力比在非神經(jīng)細胞上的高10倍[6]。表4可見wtLEP和rLEP的嗜神經(jīng)指數(shù)均為0.8，沒有差異。表4wtLEP和rLEP的體外嗜神經(jīng)性毒株滴度(ffu/mla)NABHK-21—體外嗜神經(jīng)指數(shù)bwtLEP3.7X1085.3X1070.8rLEP2.0X1083.3X1070.8a同一種毒在NA細胞和BHK-21細胞上的滴度b體外嗜神經(jīng)指數(shù)-log(NA上的滴度)—log(BHK-21上的滴度)2.5.3對小鼠的致病性為了確定wtLEP和rLEP對小鼠的致病性，每只小鼠腦內(nèi)接種病毒105FFU/30pl。感染wtLEP和rLEP的小鼠表現(xiàn)出麻痹、興奮、體重減輕等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床癥狀，所有的老鼠在11天內(nèi)全部死亡。此外，我們測定了wtLEP和rLEP的LD5。，分別為8.8個FFU和2個FFU。結(jié)果表明，rLEP與wtLEP對小鼠的致病性沒有顯著差異。通過以上幾項rLEP和wtLEP的生物學特性的測定，可見以基因組全長cDNA克隆獲救的rLEP與野生毒株wtLEP在生物學特性上并無顯著差異。3.討論自1994年Conzelmann等[7]第一次從基因組cDNA拯救了狂犬病病毒，至今已成功拯救出的狂犬病病毒株SADB19、Flury-HEP[8]、RC-HL[9〗、SHBRV-18[1Q]、Nishigahaga[11]、Ni-CE[12]。本研究首次構(gòu)建了弱毒疫苗株Flury-LEP的完整基因組cDNA克隆及其輔助質(zhì)粒系統(tǒng)，并且成功拯救出子代病毒。該反向遺傳系統(tǒng)利用胞內(nèi)RNA聚合酶II，而無需傳統(tǒng)的T7聚合酶系統(tǒng)，因此，理論上可以在任何真核細胞系中拯救出病毒。我們在BHK-21細胞、293T細胞上都成功拯救出病毒，但是拯救效率不一。因為在病毒拯救過程與質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率、CMV啟動子的活性、核酶的剪切活性、轉(zhuǎn)錄的速度和比例、病毒mRNA和基因組RNA的復(fù)制、病毒蛋白的翻譯、組裝和病毒粒子的出芽等都息息相關(guān)，與轉(zhuǎn)染細胞的狀態(tài)也有很大的關(guān)系。因此，要提高病毒的拯救效率還需要注意到更多的細節(jié)，如全長基因組cDNA質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒的比例、轉(zhuǎn)染細胞狀態(tài)等。研究通過反向遺傳技術(shù)拯救的Flmy-LEP弱毒疫苗株的生物學特性包括在神經(jīng)細胞NA細胞和非神經(jīng)細胞BHK-21細胞上的生長動力學曲線、嗜神經(jīng)指數(shù)以及對小鼠的致病性與親本株Flmy-LEP十分相似。這表明，重組狂犬病病毒rLEP具有作為預(yù)防狂犬病的活載體疫苗應(yīng)用的潛力。因此，本發(fā)明構(gòu)建的狂犬病病毒Flury-LEP株反向遺傳操作系統(tǒng)和表達綠色熒光蛋白重組病毒載體可以作為在分子水平研究、構(gòu)建和改造狂犬病病毒疫苗的有效平臺。許多研究表明，狂犬病毒糖蛋白是主要的致病因子，第333位上的精氨酸(R)或賴氨酸(&)病毒的毒力有很大的決定作用[13'14'15]。利用反向遺傳技術(shù)或通過單抗篩選發(fā)現(xiàn)，將該位點精氨酸(R)或賴氨酸(K)替換為谷氨酰胺、絲氨酸或谷氨酸時病毒毒力顯著下降。Takayama-Ito等將Flury-HEP的G蛋白第333位谷氨酰胺突變?yōu)榫彼酭后，小鼠腦內(nèi)接種致死。Flury-LEP在傳代過程中已高度致弱，但是G蛋白第333位仍為精氨酸(R)，且小鼠腦內(nèi)接種能感染致死。將Flury-LEP的G333突變?yōu)槠渌被幔涠玖κ欠駮档停芙档投嗌?，抑或有其他相關(guān)致病位點這些問題都還尚未解答。此外，狂犬病病毒還是一個很好的表達外源蛋白的載體[16]，既可在病毒基因組插入導(dǎo)致病毒減毒和增強免疫反應(yīng)的外源基因，也可插入額外的G基因以增強免疫原性，或者是從基因組中刪除某個完整的病毒基因，使病毒無法繁殖而失去毒力。同時，本發(fā)明構(gòu)建的狂犬病病毒Flury-LEP株反向遺傳操作系統(tǒng)也為構(gòu)建表達犬瘟熱等其它重要病原保護性免疫原的重組病毒，研制出可同時預(yù)防狂犬病及犬瘟熱等其它疫病的重組二聯(lián)活載體疫苗奠定了基礎(chǔ)。Flury-LEP弱毒疫苗株反向遺傳系統(tǒng)的建立和表達EGFP的重組Flmy-LEP的成功拯救為在分子水平研究狂犬病病毒的致病性提供了一個平臺，同時也為開發(fā)高效、安全的狂犬疫苗提供了基礎(chǔ)。另外，所述表達綠色熒光蛋白重組病毒載體也是構(gòu)建表達其它外源蛋白的重組病毒載體的基礎(chǔ)，由其拯救的表達EGFP的LEP重組病毒rLEP-EGFP可以用于直接觀察病毒的增殖狀態(tài)，分析LEP病毒的擴散和致病性，等等。應(yīng)該理解，盡管參考其示例性的實施方案，已經(jīng)對本發(fā)明進行具體地顯示和描述，但是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該理解，在不背離由后附的權(quán)利要求所定義的本發(fā)明的精神和范圍的條件下，可以在其中進行各種形式和細節(jié)的變化，可以進行各種實施方案的任意組合。參考文獻KoprowskiH,BlackJ，NelsenDJ.Studiesonchick-embryo-adapted-rabiesvirus.VI.Furtherchangesinpathogenicpropertiesfollowingprolongedcultivationinthedevelopingchickembryo,//w聽wo/,1954,72(1》94-106.NeumannG,WhittMA,KawaokaYAdecadeafterthegenerationofanegative-senseRNAvirusfromclonedcDNA-whathavewelearned/(JeM腸/,2002，83(Pt11):2635-62.KozakM.AtleastsixnucleotidesprecedingtheAUGinitiatorcodonenhancetranslationinmammaliancells.J"A/o/5z'o/,1987,196(4》947-50.KretzschmarE,BuonocoreL，SchnellMJ，&a/.High-efficiencyincorporationoffunctionalinfluenzavirusglycoproteinsintorecombinantvesicularstomatitisviruses./Fz>o/，1997,71(8):5982-9.Reed，LJ，Muench，H.Asimplemethodofestimatingfiftypercentendpoints,Xm.//;;g，1938，27:493~497.MorimotoK，HooperDC,CarbaughH,a/.Rabiesvirusquasispecies:implicationsforpathogenesis.尸racA^/Jm<i/Sc/1998，95(6》3152-6.[7]SchnellMJ,MebatsionT,'ConzelmannKK.InfectiousrabiesvirusesfromclonedcDNA.五細0/，1994，13(18):4195-203.InoueK，ShojiY，KuraneI，&<a/.AnimprovedmethodforrecoveringrabiesvirusfromclonedcDNA./Wra/她/Zzo成2003，107(2):229-36.[9]ItoN,TakayamaM,YamadaK，aa/.RescueofrabiesvirusfromclonedcDNAandidentificationofthepathogenicity-relatedgene:glycoproteingeneisassociatedwithvirulenceforadultmice./Wra/,2001，75(19):9121-8.[10]FaberM,PulmanausahakulR，NagaoK,Wa/.Identificationofviralgenomicelementsresponsibleforrabiesvirusneuroinvasiveness./VocTVof/爿cac/5W,.2004，101(46):16328-32.YamadaK，ItoN，Takayama-ItoM，Multigenicrelationtotheattenuationofrabiesvirus.M/cra6/o//m羅wo/，2006,50(1):25-32.ShimizuK,ItoN,MitaT，Involvementofnucleoprotein，phosphoprotein,andmatrixproteingenesofrabiesvirusinvirulenceforadultmice.Wniw，2007,123(2):154-60.DietzscholdB,"WunnerWH,WiktorTJ,a/.Characterizationofanantigenicdeterminantoftheglycoproteinthatcorrelateswithpathogenicityofrabiesvirus.7Vo^/爿c^/5Wt/5^，1983，80(l):70-4.TuffereauC,LebloisH,B6n句eanJ，Arginineorlysineinposition333ofERAandCVSglycoproteinisnecessaryforrabiesvirulenceinadultmice,1989,172(1):206-12.Takayama-ItoM,InoueK，ShojiY,AhighlyattenuatedrabiesvirusHEP-Flurystrainrevertstovirulentbysingleaminoacidsubstitutiontoarginineatposition333inglycoprotein.2006，119(2):208-15.MebatsionT，SchnellMJ,CoxJH,Wa/.Highlystableexpressionofaforeigngenefromrabiesvirusvectors./VociV"http://^cadSc/t/&4，1996，93(14):7310-4.SEQUENCELISTING〈110〉哈爾濱獸醫(yī)研究所<120>狂犬病病毒Flury-LEP疫苗株反向遺傳操作系統(tǒng)及LEP綠色熒光蛋白重組病毒載體<130>IB091967<歸7<170>Patentlnversion3.1<210>1<211〉11925〈212>DNA<213〉狂犬病病毒Flury-LEP<400>1acgcttaacaacaaaaccaaagaagaagcagacagcgtcagttgcaaagcaaaaatgtaa60cacccctacaatggatgccgacaagattgtgttcaaagtcaataatcaggtggtctcttt120gaagcccgagattatcgtggatcaatatgagtacaagtaccctgctatcaaagatttgaa1803aagccttgtataaccctagggaaagcccccgatttaaacaaagcttacaaatcagtt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-4中任一項的狂犬病病毒Flury-LEP疫苗株的反向遺傳操作系統(tǒng)拯救的病毒株rLEP，其與野生毒株wtLEP在生物學特性上無顯著差異。7.由權(quán)利要求5的表達綠色熒光蛋白的LEP重組病毒載體拯救的表達綠色熒光蛋白的LEP重組病毒株rLEP-EGFP。8.權(quán)利要求1-4中任一項的狂犬病病毒Flmy-LEP疫苗株的反向遺傳操作系統(tǒng)的應(yīng)用，其用于對Flury-LEP株基因組毒力相關(guān)位點進行定點突變修飾，在所述病毒基因組插入導(dǎo)致病毒減毒或增強免疫反應(yīng)的外源基因，插入額外的G基因以增強免疫原性，或者從基因組中刪除某個完整的病毒基因等。9.權(quán)利要求1-4中任一項的狂犬病病毒Flury-LEP疫苗株的反向遺傳操作系統(tǒng)的應(yīng)用，其用于構(gòu)建預(yù)防狂犬病和其它疫病的重組二聯(lián)活載體疫苗。10.權(quán)利要求7的表達綠色熒光蛋白的LEP重組病毒株rLEP-EGFP的應(yīng)用，其用于直接觀察病毒的增殖狀態(tài)，分析LEP病毒的擴散和致病性等。全文摘要本發(fā)明涉及狂犬病病毒Flury-LEP疫苗株的反向遺傳操作系統(tǒng)，其包括編碼LEP全長基因組cDNA的重組載體，及其輔助質(zhì)粒系統(tǒng)，其中所述輔助質(zhì)粒系統(tǒng)分別編碼LEP的核蛋白N、磷酸蛋白P及聚合酶蛋白L。本發(fā)明還涉及由該反向遺傳操作系統(tǒng)構(gòu)建的LEP綠色熒光蛋白重組病毒載體。更具體地，所述狂犬病病毒Flury-LEP疫苗株反向遺傳操作系統(tǒng)是pCI-LEP及其輔助質(zhì)粒系統(tǒng)pCAGG-N、pCAGG-P和pCAGG-L，所述LEP綠色熒光蛋白重組病毒載體是pCI-LEP-EGFP。本發(fā)明還涉及由所述狂犬病病毒Flury-LEP疫苗株反向遺傳操作系統(tǒng)及LEP綠色熒光蛋白重組病毒載體二者拯救的重組病毒，以及它們的應(yīng)用。文檔編號C12Q1/70GK101586120SQ20091008897公開日2009年11月25日申請日期2009年7月15日優(yōu)先權(quán)日2009年7月15日發(fā)明者步志高,王喜軍,葛金英,陶麗紅申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所