專(zhuān)利名稱(chēng)：狂犬病dna疫苗的構(gòu)建及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及狂犬病疫苗領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及一種作為狂犬病DNA疫苗的表達(dá)按哺乳動(dòng)物密碼子偏嗜性?xún)?yōu)化的RV囊膜糖蛋白(G蛋白)基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒。
背景技術(shù)：
狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies virus, RV)引起的一種人獸共患傳染病，在全球范圍內(nèi)流行，以急性、漸進(jìn)性和致死性腦炎為特征，一旦出現(xiàn)神經(jīng)癥狀病死率幾乎高達(dá)100% [1’2]。全球每年死于狂犬病的人數(shù)高達(dá)5.5萬(wàn)，主要發(fā)生在亞洲和非洲的發(fā)展中國(guó)家[3’4]。自2000年以來(lái)，我國(guó)狂犬病疫情又呈現(xiàn)快速回升的趨勢(shì)，2007年死亡人數(shù)高達(dá)3，300人[5]，隨后略有下降，但仍維持在較高水平，2011年造成1，879人死亡[6]，已經(jīng)成為一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。據(jù)統(tǒng)計(jì)，99%以上人間狂犬病死亡病例因狂犬病犬咬傷所致[1]。人間狂犬病控制最有效的措施是通過(guò)疫苗接種，從源頭上控制犬狂犬病。傳統(tǒng)的狂犬病弱毒疫苗成本低廉， 但存在毒力殘留或致病性回復(fù)突變的安全隱患；滅活疫苗安全、有效，但成本昂貴[7’8]。因此，研制安全、有效，成本低廉的動(dòng)物狂犬病疫苗，仍具現(xiàn)實(shí)意義。
DNA疫苗免疫動(dòng)物后，可同時(shí)誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫，可保護(hù)動(dòng)物抵抗病原體的攻擊。同時(shí)，DNA疫苗易于構(gòu)建，大量制備工藝簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低廉，便于保存，無(wú)需冷凍運(yùn)輸，因而引起研究人員的廣泛關(guān)注[9a°]。
狂犬病病毒(Rabies virus, RV)為彈狀病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病毒屬(Lssavirus)成員[11]?？袢〔《灸夷さ鞍?RVG)是病毒的受體結(jié)合蛋白和主要毒力因子之一，決定著病毒侵入神經(jīng)系統(tǒng)或組織的路徑和致病力，也是誘導(dǎo)機(jī)體保護(hù)性免疫反應(yīng)的主要抗原[12]。本研究構(gòu)建了表達(dá)哺乳動(dòng)物密碼子優(yōu)化的RVG基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGG-RVG,并對(duì)其在靶動(dòng)物犬的免疫原性進(jìn)行了評(píng)估。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明構(gòu)建了表達(dá)按哺乳動(dòng)物密碼子偏嗜性?xún)?yōu)化的RVG蛋白(RVG)基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGG-RVG。間接免疫熒光試驗(yàn)及蛋白印跡結(jié)果表明，重組RVG在pCAGG-RVG轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞獲得正確表達(dá)。將pCAGG-RVG按500 μ g劑量經(jīng)肌肉注射途徑免疫比格犬，間隔4周以相同劑量、途徑加強(qiáng)免疫一次，并于初次免疫前、后不同時(shí)間檢測(cè)血清RV中和抗體。結(jié)果，pCAGG-RVG—次免疫即可誘導(dǎo)顯著的中和抗體反應(yīng)，二次免疫中和抗體滴度表現(xiàn)出顯著地增強(qiáng)效果。二次免疫后，中和抗體滴度經(jīng)過(guò)短暫的下降，即保持持續(xù)的平穩(wěn)，至初次免疫后第54周，7只免疫犬中和抗體滴度平均為2.88IU，且全部高于0.5IU，即全部高于對(duì)強(qiáng)毒攻擊保護(hù)的最低中和抗體滴度要求。綜上，pCAGG-RVG具有預(yù)防狂犬病的潛力，是一種有希望的狂犬病候選疫苗。
具體地，本發(fā)明提供以下各項(xiàng):
1.一種狂犬病DNA疫苗，所述狂犬病DNA疫苗包含表達(dá)按哺乳動(dòng)物密碼子偏嗜性?xún)?yōu)化的狂犬病病毒囊膜糖蛋白基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒。
2.根據(jù)第I項(xiàng)所述的狂犬病DNA疫苗，其中所述按哺乳動(dòng)物密碼子偏嗜性?xún)?yōu)化的狂犬病病毒囊膜糖蛋白基因具有如SEG ID N0.1所示的序列。3.根據(jù)第I項(xiàng)所述的狂犬病DNA疫苗，其中所述表達(dá)按哺乳動(dòng)物密碼子偏嗜性?xún)?yōu)化的狂犬病病毒囊膜糖蛋白基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒具有如SEG ID N0.2所示的序列。4.具有如SEG ID N0.2所示的序列的重組真核表達(dá)質(zhì)粒用作狂犬病DNA疫苗的用途。5.具有如SEG ID N0.2所示的序列的重組真核表達(dá)質(zhì)粒在制備狂犬病DNA疫苗中的用途。


圖1:間接免疫熒光檢測(cè)RVG蛋白在pCAGG-RVG轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞中的表達(dá)。A:pCAGG-RVG轉(zhuǎn)染的BHK細(xì)胞；B:RV弱毒疫苗株ERA感染的BHK細(xì)胞；C:pCAGGS轉(zhuǎn)染的BHK細(xì)胞。 圖2:蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)RVG蛋白在pCAGG-RVG轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞中的表達(dá)。以2yg的pCAGG-RVG或pCAGGS轉(zhuǎn)染鋪于6孔板密度約為80 %的BHK細(xì)胞，同時(shí)用RV弱毒疫苗株ERA按MOI為I感染轉(zhuǎn)染鋪于6孔板密度約為80%的BHK細(xì)胞。36小時(shí)后，收獲、裂解細(xì)胞，以裂解細(xì)胞上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上后，以鼠抗RV血清為一抗進(jìn)行Western blot分析。M:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；A:pCAGGS轉(zhuǎn)染的BHK細(xì)胞；B:RV弱毒疫苗株ERA感染的BHK細(xì)胞；C:pCAGG-RVG轉(zhuǎn)染的BHK細(xì)胞。圖3:狂犬病DNA疫苗pCAGG-RVG對(duì)犬的免疫效力。用表達(dá)RVG蛋白的重組真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGG-RVG按500 μ g/lmL/只的劑量經(jīng)肌肉注射途徑免疫7只比格犬，間隔4周以相同劑量、途徑進(jìn)行加強(qiáng)免疫。免疫前和免疫后不同時(shí)間點(diǎn)采集試驗(yàn)犬外周血，分離血清，通過(guò)中和試驗(yàn)檢測(cè)血清中RV特異中和抗體滴度。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。材料和方法1.質(zhì)粒、血清、細(xì)胞株和毒株真核表達(dá)載體pCAGGS由Y.Kawaoka博士提供[13](文獻(xiàn)13中明確公開(kāi)了載體pCAGGS的構(gòu)建方法)；抗狂犬病病毒國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)血清購(gòu)自O(shè)IE狂犬病參考實(shí)驗(yàn)室(法國(guó))；(倉(cāng)鼠腎細(xì)胞)BHK-21 =ATCC N0.CCLlO ；RV 弱毒疫苗株 ERA =CVCC N0.AV61* ；鼠抗 RV 血清(RV弱毒疫苗株ERA按106FFU/mL/只的劑量免疫6周齡小鼠，間隔3周，加強(qiáng)免疫2次，第3次免疫后2周采集小鼠血液，分離血清)；RV標(biāo)準(zhǔn)固定毒株CVSll的來(lái)源見(jiàn)參考文獻(xiàn)[14]。2.主要試劑及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物限制性?xún)?nèi)切酶、T4連接酶均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；plasmid GigaKits購(gòu)自QIAGEN公司；脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Invitrogen公司；綠色熒光素(FITC)標(biāo)記的兔抗小鼠IgG、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔抗小鼠IgG均購(gòu)自Sigma公司。比格犬購(gòu)自廣州醫(yī)藥工業(yè)研究總院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究開(kāi)發(fā)中心(國(guó)家犬類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種子中心)。
實(shí)施例1、真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGG-RVG的構(gòu)建與制備
按哺乳動(dòng)物密碼子偏嗜性?xún)?yōu)化狂犬病病毒弱毒疫苗株ERA (其完整基因組序列見(jiàn)GenBank號(hào):FJ913470)囊膜糖蛋白(G蛋白)的基因序列(優(yōu)化前的原始序列見(jiàn)SEG IDN0.3)。一種氨基酸均有幾個(gè)密碼子，也就說(shuō)這幾個(gè)密碼子均能翻譯成一種氨基酸。哺乳動(dòng)物對(duì)密碼子具有偏嗜性，即在哺乳動(dòng)物體內(nèi)一種氨基酸的幾個(gè)密碼子的翻譯效率有的高有的低，在本文中“優(yōu)化”即將氨基酸的密碼子全部改寫(xiě)為在哺乳動(dòng)物體內(nèi)翻譯效率高的密碼子。原始序列與優(yōu)化后序列的差別在于翻譯成的氨基酸序列不變，但核酸序列變化特別大。優(yōu)化后的序列見(jiàn)SEG ID N0.1，人工合成該基因，并在起始密碼子前引入Kozak序列(GCCGCCACC)，兩末端引入EcoRI和XhoI限制性?xún)?nèi)切酶序列(GAATTC和CTCGAG)，克隆至PUC57 載體(GenScript N0.SDl 176)，獲得質(zhì)粒 pUC57_RVG。以 BamH I 單酶切 pCAGGS，去除其中SV40 ori序列(SV40復(fù)制起始序列)，連接構(gòu)成質(zhì)粒pCAGGS Δ SV40 ori ;再以EcoRI和XhoI限制性?xún)?nèi)切酶雙酶切pUC57-RVG，得到RVG基因，并亞克隆至pCAGGS Δ SV40 ori相應(yīng)酶切位點(diǎn)，RVG蛋白基因位于雞β -actin轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子下游，獲得表達(dá)RVG蛋白基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGG-RVG (SEG ID N0.2)。分別以EcoRI和XhoI單酶切進(jìn)行鑒定，通過(guò)plasmidGiga Kits大量制備質(zhì)粒pCAGG-RVG(具體操作詳見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū))，用于轉(zhuǎn)染及免疫試驗(yàn)。
EcoRI和XhoI雙酶切pCAGG-RVG得到大小約為1650bp和4400bp的兩個(gè)片段，與預(yù)期結(jié)果相符，表明RVG蛋白基因在真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS中獲得重組(結(jié)果未呈現(xiàn))。
實(shí)施例2、真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGG-RVG的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染及間接免疫熒光(IFA)檢測(cè)
為了證實(shí)pCAGG-RVG表達(dá)RVG蛋白的抗原性，以pCAGG-RVG轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前準(zhǔn)備24孔板生長(zhǎng)過(guò)夜、密度約為80%的BHK細(xì)胞，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法(具體操作詳見(jiàn)Lipofectamine 2000說(shuō)明書(shū))轉(zhuǎn)染0.5 μ g的pCAGG-RVG轉(zhuǎn)染至上述細(xì)胞、轉(zhuǎn)然后5%C0237°C培養(yǎng)。同時(shí)，以RV弱毒疫苗株ERA按MOI為0.1的劑量感染BHK細(xì)胞，作為陽(yáng)性對(duì)照；以0.5 μ g的pCAGGS轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞，作為陰性對(duì)照。轉(zhuǎn)染后36小時(shí)，用PBS洗細(xì)胞3次，以預(yù)冷的3%多聚甲醛固定細(xì)胞30min ;PBS洗3次后，I % BSA封閉20min ；PBST (0.05%Tween20)洗滌后加入1: 100倍稀釋的鼠抗RV血清為一抗，室溫孵育30min ；PBST洗滌后加入I: 200倍稀釋FITC標(biāo)記的兔抗鼠IgG 二抗(Sigma N0.F9137)，室溫孵育30min ；PBS洗滌后，置于熒光顯微鏡(Leica DMIRES2)下觀察。
結(jié)果顯示，抗RV鼠血清檢`測(cè)pCAGG-RVG轉(zhuǎn)染的BHK細(xì)胞時(shí)呈現(xiàn)綠色陽(yáng)性熒光信號(hào)(圖1A)，檢測(cè)RV ERA株感染BHK細(xì)胞時(shí)也呈現(xiàn)綠色陽(yáng)性熒光信號(hào)(圖1B)，而檢測(cè)pCAGGS轉(zhuǎn)染的BHK細(xì)胞時(shí)則呈現(xiàn)陰性熒光信號(hào)(圖1C)。結(jié)果表明，pCAGG-RVG表達(dá)RVG蛋白具有良好的反應(yīng)原性。
實(shí)施例3、蛋白印跡法(Western blot)分析
為了分析重組真核表達(dá)質(zhì)粒能否表達(dá)RVG蛋白，以2 μ g的pCAGG-RVG轉(zhuǎn)染鋪于6孔板的單層BHK細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后36小時(shí)，收獲、裂解細(xì)胞，加入等體積的2XSDS裂解緩沖液，煮沸IOmin, 10，OOOXg離心IOmin后，取上清進(jìn)行SDS-PAGE (Bio-Rad)電泳；將蛋白電轉(zhuǎn)印(Bio-Rad)至尼龍膜(Ameresco)上，5%脫脂乳封閉過(guò)夜，PBST洗滌后加入1: 100倍稀釋的鼠抗RV血清為一抗，室溫作用lh，PBST洗滌后，加入I: 2500倍PBST稀釋辣根過(guò)氧化物酶(HR)標(biāo)記兔抗鼠IgG 二抗(Sigma N0.A9044)室溫作用lh，PBST洗滌后，用DAB進(jìn)行顯色。
蛋白質(zhì)印跡顯示出特異的67ku檢測(cè)蛋白，與G蛋白理論預(yù)期值相符(圖2)。結(jié)果表明，RVG蛋白在pCAGG-RVG轉(zhuǎn)染的BHK細(xì)胞中獲得表達(dá)。實(shí)施例4、血清中和試驗(yàn)檢測(cè)DNA免疫犬誘導(dǎo)中和抗體為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGG-RVG的免疫效力，以重組真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGG-RVG按500 μ g/lmL/條(不管體重如何都注射同樣的量，用磷酸鹽緩沖液PBS進(jìn)行稀釋)的劑量經(jīng)肌肉注射途徑免疫7條RV中和抗體陰性比格犬(所用比格犬12月齡，接種劑量與體重?zé)o關(guān)，注射部位為后肢股四頭肌)，間隔4周再以相同劑量、途徑加強(qiáng)免疫一次。同時(shí)，以pCAGGS為對(duì)照以相同的方法免疫5條RV中和抗體陰性比格犬，間隔4周再以相同劑量、途徑加強(qiáng)免疫一次。分別于初次免疫前、后不同時(shí)間點(diǎn)經(jīng)前肢靜脈采集血液、分離血清，用于中和抗體檢測(cè)。RV中和抗體的檢測(cè)基本參照文獻(xiàn)M在96孔板上進(jìn)行。首先將采集的血清樣品置于56°C水浴30min進(jìn)行滅活，再分別以不完全DMEM(Gibson) 9倍稀釋?zhuān)筮B續(xù)3倍稀釋?zhuān)肯♂尪润w積為50 μ L，與50 μ L約含IOOTCID5ci的標(biāo)準(zhǔn)固定毒株CVSll病毒液混合，37°C感作Ih后，每孔加入約IO5個(gè)BHK細(xì)胞，同時(shí)設(shè)陽(yáng)性、陰性及細(xì)胞對(duì)照(陽(yáng)性對(duì)照為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)血清，起始血清稀釋滴度為0.5IU/mL)，血清每個(gè)稀釋度做4個(gè)平行孔，5% C023 7°C培養(yǎng)48h后進(jìn)行IFA檢測(cè)，后置于熒光顯微鏡下觀察，并計(jì)算血清RV中和抗體滴度。初次免疫后4周，pCAGG-RVG免疫犬血清中就能檢測(cè)到RV中和抗體，而在pCAGGS免疫犬血清中檢測(cè)不到RV中和抗體。初次免疫后4周，pCAGG-RVG免疫犬血清中RV中和抗體平均滴度上升到3.23IU/mL(7.9,0.38，1.14，5.92，2.6,0.29和4.5)，加強(qiáng)免疫后2周，免疫犬血清中RV中和抗體平均滴度上升到峰值8.21IU/mL(13.50,7.79，13.5,4.5,5.92，
7.79和4.5)，隨后RV中和抗體水平逐漸下降。初次免疫后27周，免疫犬血清中RV中和抗體平均滴度下降到3.99IU/mL (7.79，3.24，2.6，2.6，2.6，0.87和1.14)，然而初次免疫后第54周，免疫犬血清中RV中和抗體平均滴度仍然可達(dá)2.88IU/mL (7.79，2.6，2.6，2.6，2.6，
0.87和1.14)。這些結(jié)果表明，pCAGG-RVG是一個(gè)具有良好免疫效力的犬狂犬病候選DNA疫苗(圖3)。討論本研究構(gòu)建了表達(dá)哺乳動(dòng)物密碼子優(yōu)化的RV囊膜糖蛋白G基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGG-RVG。間接免疫熒光試驗(yàn)和蛋白質(zhì)印跡結(jié)果表明，RVG蛋白在重組真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGG-RVG轉(zhuǎn)染的BHK細(xì)胞中獲得表達(dá)，且具有良好的反應(yīng)原性。應(yīng)用該重組真核表達(dá)質(zhì)粒作為DNA疫苗免疫比格犬，可誘導(dǎo)顯著而持久的RV中和抗體反應(yīng)。免疫動(dòng)物血清中RV中和抗體水平是評(píng)價(jià)狂犬病疫苗免疫效力的一個(gè)重要指標(biāo)。Osorio等研究結(jié)果顯示，以I個(gè)劑量(100 μ g/條)表達(dá)RV CVS株G蛋白的DNA疫苗經(jīng)肌肉注射途徑免疫犬，僅能誘導(dǎo)低水平的RV中和抗體反應(yīng)；然而將免疫劑量提高到300 μ g/條時(shí)，可增強(qiáng)RV中和抗體反應(yīng)[15]。這些研究結(jié)果提示，狂犬病DNA疫苗免疫犬可誘導(dǎo)劑量依賴(lài)性的RV中和抗體反應(yīng)；增加免疫劑量可能會(huì)獲得更高水平的RV中和抗體反應(yīng)。我們的研究結(jié)果也證實(shí)這一推測(cè)，以狂犬病DNA疫苗pCAGG-RVG按500 μ g/只的劑量免疫犬，可誘導(dǎo)顯著的RV中和抗體，初次免疫后4周免疫犬血清中RV中和抗體滴度平均值可達(dá)3.23IU/
mLo另外， Perrin等研究發(fā)現(xiàn):以I個(gè)劑量(IOOyg/只)的表達(dá)RV PV株G蛋白的DNA疫苗經(jīng)肌肉注射途徑免疫犬，僅能誘導(dǎo)低水平的RV中和抗體反應(yīng)，但間隔一定時(shí)間進(jìn)行加強(qiáng)免疫可增強(qiáng)RV中和抗體反應(yīng)[16]。這與本研究結(jié)果一致，我們以狂犬病DNA疫苗pCAGG-RVG按500 μ g/只的劑量免疫犬，可誘導(dǎo)顯著的RV中和抗體反應(yīng)，初次免疫后4周免疫犬血清中RV中和抗體滴度平均值可達(dá)3.23IU/mL ;間隔4周以相同劑量、途徑進(jìn)行加強(qiáng)免疫，可顯著增強(qiáng)RV中和抗體反應(yīng)，加強(qiáng)免疫后2周免疫犬血清中RV中和抗體滴度平均值高達(dá) 8.21IU/mL。
盡管，本研究以狂犬病DNA疫苗pCAGG-RVG免疫犬血清中RV中和抗體滴度峰值平均值(8.21IU/mL)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于我們以前的研究中分別以RVERA疫苗株(106FFU/只)、表達(dá)RVG蛋白基因的重組新城疫病毒rLa-RVG(109.3EID50/只)和表達(dá)RV G蛋白基因的重組犬瘟熱病毒r⑶V-RVG(106TCID50/只)誘導(dǎo)的RV中和抗體滴度峰值平均值(分別為70.4IU/mL、96IU/mL和96.71IU/mL) [17’18]，然而狂犬病DNA疫苗pCAGG-RVG免疫犬血清中RV中和抗體滴度下降地更為緩慢，初次免疫后54周免疫犬血清中RV中和抗體滴度平均值仍可達(dá)2.88IU/mL,而0.5IU/mL的RV中和抗體滴度是能保護(hù)動(dòng)物免受致死劑量RV街毒株攻擊的最小滴度[11’17’18]。這一結(jié)果提示:pCAGG-RVG的免疫接種能為犬提供I年以上的有效保護(hù)。因此，狂犬病DNA疫苗pCAGG-RVG是一個(gè)有希望的狂犬病候選疫苗。
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權(quán)利要求
1.一種狂犬病DNA疫苗，所述狂犬病DNA疫苗包含表達(dá)按哺乳動(dòng)物密碼子偏嗜性?xún)?yōu)化的狂犬病病毒囊膜糖蛋白基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的狂犬病DNA疫苗，其中所述按哺乳動(dòng)物密碼子偏嗜性?xún)?yōu)化的狂犬病病毒囊膜糖蛋白基因具有如SEG ID N0.1所示的序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的狂犬病DNA疫苗，其中所述表達(dá)按哺乳動(dòng)物密碼子偏嗜性?xún)?yōu)化的狂犬病病毒囊膜糖蛋白基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒具有如SEG ID N0.2所示的序列。
4.具有如SEGID N0.2所示的序列的重組真核表達(dá)質(zhì)粒用作狂犬病DNA疫苗的用途。
5.具有如SEGID N0.2所示的序列的重組真核表達(dá)質(zhì)粒在制備狂犬病DNA疫苗中的用途 。
全文摘要
本發(fā)明提供一種作為狂犬病DNA疫苗的表達(dá)按哺乳動(dòng)物密碼子偏嗜性?xún)?yōu)化的狂犬病病毒囊膜糖蛋白(G蛋白)基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒。
文檔編號(hào)A61K39/205GK103169963SQ20131012591
公開(kāi)日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2013年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月12日
發(fā)明者步志高, 王喜軍, 葛金英 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所, 哈爾濱維科生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司