一種重組狂犬病病毒口服疫苗株及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種重組狂犬病病毒口服疫苗株，它是以SAD-B19為母本毒株，所述母本毒株G蛋白上194位的天冬氨酸突變?yōu)榻z氨酸、333位的精氨酸突變?yōu)楣劝彼?，并且所述母本毒株的基因組G基因和L基因之間被插入犬GM-CSF基因。本發(fā)明還公開了該重組狂犬病病毒口服疫苗株的制備方法。本發(fā)明的重組狂犬病病毒口服疫苗株具有良好的復制性，安全性，并且通過犬GM-CSF基因的插入增強了免疫原性，口服免疫后可以誘導高水平的中和抗體，顯著優(yōu)于LBNSE病毒（歐洲用于野生動物免疫的疫苗株），可以作為狂犬病口服疫苗的候選株。
【專利說明】一種重組狂犬病病毒口服疫苗株及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于動物疫苗【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種重組狂犬病病毒口服疫苗株及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]狂犬病是最古老的傳染病之一，是由狂犬病毒(Rabies virus，RV)引起的一種人畜共患傳染病?？袢∈瞧駷橹谷祟惒∷缆首罡叩募毙詡魅静?，一旦發(fā)病，病死率幾乎達100%。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報告，全世界每年有約55000人死于狂犬病，其中絕大多數(shù)分布在非洲和亞洲。近些年，我國平均每年死于約有3000人左右死于狂犬病，多數(shù)是由于被動物咬傷或者咬傷而被感染。疫苗免疫是預防和控制狂犬病的最有效途徑，當前廣泛應用的狂犬病疫苗主要是原代細胞培養(yǎng)疫苗和傳代細胞純化疫苗等滅活疫苗，這些疫苗雖然免疫效果較好，但價格昂貴，而且主要采用的免疫方式為肌注免疫，這樣對于一些流浪動物及野生動物的免疫接種則很難實現(xiàn)。在我國，街頭的流浪狗、貓等動物為當前主要的傳染源，因此，將流浪的動物進行有效的免疫是狂犬病防控的關(guān)鍵。
[0003]口服免疫是一種公認的易于實施的免疫方式，歐美許多國家已經(jīng)將口服疫苗應用于野生動物的狂犬病防控。目前應用的口服疫苗主要有SAD-B19 (Schneider LG, CoxJHj Muller WWj Hohnsbeen KP.Current oral rabies vaccination in Europe:an interimbalance.Rev Infect Dis1988，IOSupp14:S654-659.Wandeler Al，Capt S，KappelerA，Hauser R.0ral immunization of wildlife against rabies:concept and firstfield experiments.Rev Infect Dis.1988，10Suppl4:S649-653.)、VR_G (Kieny MPj LatheR，Drillien R，Spehner Dj Skory S，et al.Expression of rabies virus glycoproteinfrom a recombinant vaccinia virus.Nature.1984, 312:163-166.Brochier Bj KienyMPj Costy F，Coppens P，Bauduin B，et al.Large-scale eradication of rabies usingrecombinant vaccinia-rabies vaccine.Nature.1991，354:520-522.FearneyhoughMG, Wilson PJ，Clark KA，Smith DR，Johnston DHj et al.Results of an oral rabiesvaccination program for coyotes.J Am Vet Med Assoc.1998,212:498-502.Hanlon CA, Niezgoda M，Hamir AN, Schumacher Cj Koprowski H，et al.First NorthAmerican field release of a vaccinia-rabies glycoprotein recombinant virus.J Wildl Dis.1998，34:228-239)，和 SAG-2 (Flamand A，Coulon Pj Lafay Fj TuffereauC.Avirulent mutants of rabies virus and their use as live vaccine.TrendsMicrobiol.1993, 1:317-320.Cliquet Fj Robardet E，Must K，Laine Mj Peik K，etal.Eliminating rabies in Estonia.PLoS Negl Trop Dis.2012,6:el535.CliquetF，Aubert M.Elimination of terrestrial rabies in Western European countries.Dev Biol(Basel).2004，119:185-204.Niin E，Barrat Jj Kristian M，DemersonJM，Cliquet F.First oral vaccination of wildlife against rabies in Estonia.DevBiol(Basel).2006,125:145-147.)等。但這些口服疫苗均存在許多不足，例如，SAD雖然在歐美一些國家消滅了狂犬病在狐貍中的傳播，但有研究表明SAD對小鼠及本土動物具有致病性(Winkler WG, Shaddock JH, Williams Lff.0ral rabies vaccine: evaluation ofits infectivity in three species of rodents.Am J Epidemiol.1976，104:294-298.XSAG-2為從SAD株發(fā)展而來，是在SAD株中突變2個氨基酸位點而使其致病性大大降低，但 SAG-2 所產(chǎn)生的中和抗體水平較低(Hanlon CA, Niezgoda M, Morrill P, RupprechtCE.0ral efficacy of an attenuated rabies virus vaccine in skunks and raccoons.J Wildl Dis.2002,38:420-427.)。VR-G為痘病毒表達狂犬病G蛋白的重組毒株，雖然VR-G幫助歐美許多國家阻止了狂犬病在浣熊和狐貍等野生動物中的傳播，但有研究表明，VR-G暴露給人可導致嚴重的皮膚炎癥發(fā)應和全身的痘病毒感染(Mempel M, IsaG,Klugbauer N, Meyer H, Wildi G, et al.Laboratory acquired infection withrecombinant vaccinia virus containing an immunomodulating construct.J InvestDermatol.2003, 120:356-358.Rupprecht CE, Blass L, Smith K, Orciari LA,NiezgodaM, et al.Human infection due to recombinant vaccinia-rabies glycoprotein virus.N Engl J Med.2001, 345:582-586.Centers for Disease C, Prevention.Human vacciniainfection after contact with a raccoon rabies vaccine bait-Pennsylvania, 2009.MMWR Morb Mortal Wkly Rep.2009, 58:1204-1207.)。因此，一種安全有效價格便宜的狂犬病口服疫苗將對狂犬病的防控起到重要作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一株重組狂犬病病毒可以用于狂犬病口服免疫，它以SAD-B19為母本毒株，突變其2個氨基酸位點，得到LBNSE毒株，并將犬GM-CSF基因插入到LBNSE毒株基因組中，通過反向遺傳操作系統(tǒng)拯救出可以表達犬GM-CSF基因的重組狂犬病毒LBNSE-dog GM-CSF，該病毒株具有較高的復制滴度，致病性低，有較好的免疫原性，可以誘導產(chǎn)生高水平的中和抗體。
[0005]本發(fā)明的上述目的通 過以下技術(shù)方案來實現(xiàn):
[0006]所用的LBNSE毒株來源于用于歐洲野生動物口服免疫用的疫苗株SAD-B19，但在SAD-B19病毒G蛋白上將194位的天冬氨酸(AAT)突變?yōu)榻z氨酸(TCC)，將333位的精氨酸(AGA)突變?yōu)楣劝彼?GAA)，相當于另一株疫苗株SAG2 (在歐洲用于免疫野生動物的疫苗株)，大大減弱了病毒的致病性(Wen Y, Wang H, Wu H, Yang F，Tripp RA, etal.(2011)Rabies virus expressing dendritic cell-activating molecules enhancesthe innate and adaptive immune response to vaccination.J Virol85:1634-1.Rasalingam P，Rossiter JPjMebatsion T，Jackson AC.Comparative pathogenesis ofthe SAD_L16strain of rabies virus and a mutant modifying the dynein lightchain binding site of the rabies virus phosphoprotein in young mice.VirusRes.2005，111:55-60.Conzelmann KKjCox JHj Schneider LGj Thiel HJ.Molecularcloning and complete nucleotide sequence of the attenuated rabies virus SADB19.Virology.1990，175:485-499.)。另外，還將SAD-B19毒株基因組中G基因和L基因之間的假基因敲出，在G基因和L基因之間加入兩個酶切位點BsiWI和NheI作為插入外源基因的位點。[0007]狂犬病病毒疫苗株SAD-B19的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0008]本發(fā)明中的犬GM-CSF基因的克隆是通過對犬的新鮮血液中PBMCs的分離，經(jīng)過LPS的刺激后，然后用反轉(zhuǎn)錄PCR擴增得到。將擴增的犬GM-CSF基因經(jīng)測序驗證正確后插入到LBNSE毒株基因組的G基因和L基因之間，構(gòu)建出表達犬GM-CSF基因的感染性克隆LBNSE-dog GMCSF。
[0009]犬GM-CSF基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示，重組狂犬病毒LBNSE-dogGM-CSF的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0010]感染性克隆LBNSE-dog GMCSF與分別表達狂犬病毒N、P、G和L四個蛋白的輔助質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染BSR細胞后，經(jīng)免疫熒光證明拯救了可以表達犬GM-CSF基因的重組狂犬病病毒。為了驗證是否犬GM-CSF基因已經(jīng)插入到狂犬病毒基因組中，將拯救的病毒LBNSE-dogGM-CSF感染BSR細胞，然后提取病毒RNA，用反轉(zhuǎn)錄PCR進行驗證，證明了犬GM-CSF基因已插入到狂犬病毒基因組中。
[0011]本發(fā)明中的重組病毒LBNSE-dog GM-CSF在BSR細胞及NA細胞上的生長曲線與LBNSE病毒相似，表明外源基因犬GM-CSF的插入并沒有影響到病毒的生長和增殖。另外，重組病毒LBNSE-dog GM-CSF在NA和BSR細胞上的滴度分別可以達到108 25FFU/ml和IO8 5FFU/ml，達到了口服免疫滴度的要求。
[0012]將重組病毒LBNSE-dog GM-CSF腦內(nèi)接種小鼠，小鼠未出現(xiàn)任何發(fā)病癥狀，表明該重組病毒無致病性。另外，在口服免疫犬后，用棉拭子采集不同時間點的唾液樣本，用RT-PCR均未檢測到狂犬病毒,表明該病毒口服免疫后不會導致病毒向外傳播的隱患,安全性高。
[0013]將表達犬GM-CSF基因的重組狂犬病毒LBNSE-dog GM-CSF 口服免疫一次便可以誘導較高水平的中和抗體，顯著高于 母本毒株LBNSE，并且在口服免疫后第5周仍然具有較高水平抗體。
[0014]總之，本發(fā)明中重組病毒LBNSE-dog GM-CSF具有良好的復制性，安全性，并且通過犬GM-CSF基因的插入增強了免疫原性，口服免疫后可以誘導高水平的中和抗體，顯著優(yōu)于LBNSE病毒(歐洲用于野生動物免疫的疫苗株)，因此，重組病毒LBNSE-dog GM-CSF可以作為狂犬病口服疫苗的候選株。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1是LBNSE毒株與SAD-B19的堿基序列及氨基酸序列突變位點示意圖。
[0016]圖2是向LBNSE毒株基因中插入犬GM-CSF基因的示意圖。
[0017]圖3是拯救出的重組狂犬病病毒LBNSE-dog GMCSF的免疫熒光實驗檢測結(jié)果。
[0018]圖4是細胞對照的免疫熒光實驗檢測結(jié)果。
[0019]圖5重組病毒LBNSE-dog GM-CSF的反轉(zhuǎn)錄PCR檢測結(jié)果(Μ為DL2000marker，I為LBNSE毒株，2為LBNSE-dog GM-CSF毒株，3為陰性對照)。
[0020]圖6重組病毒LBNSE-dog GM-CSF在不同細胞系上的生長曲線。
[0021]圖7重組病毒口服免疫犬后的中和抗體水平。
[0022]圖8 口服免疫后I小時病毒殘留及排毒情況反轉(zhuǎn)錄PCR檢測結(jié)果(1-6為LBNSE組，7-12 為 LBNSE-GMCSF)。[0023]圖9 口服免疫后I小時病毒殘留及排毒情況反轉(zhuǎn)錄PCR檢測結(jié)果(1-6為LBNSE組，7-12 為 LBNSE-GMCSF)。
【具體實施方式】
[0024]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進行詳細說明。
[0025]實施例1重組病毒LBNSE-dog GM-CSF的設(shè)計、拯救、鑒定及免疫效力初步評價
[0026]I材料和方法
[0027]1.1 材料
[0028]1.1.1 病毒
[0029]LBNSE毒株由華中農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)微生物國家重點實驗室提供，該病毒的具體信息和構(gòu)建方法可參考有關(guān)文獻(Wen Y, Wang H, Wu H, Yang F，Tripp RA, et al.(2011) Rabiesvirus expressing dendritic cell-activating molecules enhances the innate andadaptive immune response to vaccination.J Virol85:1634-1.X
[0030]1.1.2 質(zhì)粒
[0031]用于拯救LBNSE毒株的感染性克隆pLBNSE的構(gòu)建策略及具體方法可參考有關(guān)文獻(Wen Y, Wang H, Wu H, Yang F，Tripp RA, et al.(2011) Rabies virus expressingdendritic cell-activating molecules enhances the innate and adaptive immuneresponse to vaccination.J Virol85:1634-1.X
[0032]1.1.3細胞和單克隆抗體
[0033]BSR細胞(BHK-21細胞的一個克隆細胞系)，生長于含10%胎牛血清(Fetalbovine serum, FBS) (Gibco, Grand Island, NY)的 DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’smedium, DMEM) (Mediatech, Herndon, VA)培養(yǎng)液。鼠神經(jīng)瘤細胞(Mouse neuroblastomacells, NA),生長于含10%FBS的RMPI1640培養(yǎng)液(Mediatech)。異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocyanate, FITC)標記的狂犬病毒核蛋白單克隆抗體購自Fujirebio(Melvin, PA)公司。
[0034]1.1.4實驗動物
[0035]6-8周齡的ICR小鼠，購于公司；6_7月齡的雌性比格犬購于安陸瑞科森實驗動物有限公司。
[0036]1.1.5主要試劑
[0037]膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提和大提試劑盒、RNeasy min1-kit RNA提取試劑盒及Superfect轉(zhuǎn)染試劑盒均購于QIAGEN公司，各種限制性內(nèi)切酶購于New EnglandBiolabs, Beverly, MA 公司。Superscript? RT-PCR 試劑盒購于 Invitrogen 公司。Ficoll-1077 購于 sigma-aIdrich 公司。
[0038]1.2引物的設(shè)計與合成
[0039]用于擴增犬GM-CSF基因及RT-PCR檢測犬GM-CSF基因的引物見表1，由上海金斯瑞公司合成。
[0040]表1
[0041]
【權(quán)利要求】
1. 一種重組狂犬病病毒口服疫苗株，其特征在于:它是以SAD-B19為母本毒株，所述母本毒株G蛋白上194位的天冬氨酸突變?yōu)榻z氨酸、333位的精氨酸突變?yōu)楣劝彼?，并且所述母本毒株的基因組G基因和L基因之間被插入犬GM-CSF基因。
2.一種重組狂犬病病毒口服疫苗株的制備方法，其特征在于包括以下步驟: 1)以SAD-B19為母本毒株，將所述母本毒株G蛋白上194位的天冬氨酸突變?yōu)榻z氨酸、333位的精氨酸突變?yōu)楣劝彼幔? 2)將母本毒株基因組中G基因和L基因之間的假基因敲出，在G基因和L基因之間加入兩個酶切位點BsiWI和NheI，將犬GM-CSF基因插入到G基因和L基因之間，并通過反向遺傳操作系統(tǒng)拯救出表達犬GM-CSF基因的重組狂犬病病毒。
【文檔編號】C12R1/93GK103525776SQ201310502446
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月23日
【發(fā)明者】傅振芳, 周明, 王雷, 周頌欽, 溫永俊, 趙凌, 崔旻 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學