專利名稱：一株重組雞馬立克氏病疫苗病毒sc9-1株的構(gòu)建和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株重組雞馬立克氏病疫苗病毒SC9-1株的構(gòu)建，屬于獸用生物制品分子生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
自1968年首次分離馬立克氏病病毒(或稱馬立克氏病毒，MDV)以來，養(yǎng)雞業(yè)采用疫苗免疫來預(yù)防MD已有40多年的歷史了，隨著MDV的致病性在不斷演化，MDV的毒力和致病性逐漸增強(qiáng)，因而所用的疫苗從III型HVT單價疫苗發(fā)展到II型SB-I加HVT雙價疫苗， 最后不得不用致弱的但仍有一定致腫瘤性的I型CVI988/Rispens疫苗株。從雞群中MDV的流行來看，已從以弱病毒株(mMDV)為主，到以強(qiáng)病毒株(vMDV) 為主，以至近20年來超強(qiáng)病毒(vvMDV)株越來越普遍，10年前還出現(xiàn)了特超強(qiáng)病毒株 (vv+MDV)(Witter RL. Increased virulence ofMarek' s disease virusfieldisolates. Avian Diseases, 1997,41(1) :149-163.)?？茖W(xué)家利用各種方法構(gòu)建了各種MDV候選毒株試圖改進(jìn)疫苗的效果，但都不成功。例如，Witter和Kreager等比較了 10株新的疫苗候選株的保護(hù)性免疫效果，但結(jié)果都不比CVI988/Rispens株好(Witter RL and Kreager KS. Serotype 1 viruses modified by backpassage or insertionalmutagenesis Approaching the threshold of vaccine efficacy in Marek' s disease. Avian Dis. 2004,48 :768-782)?？磥恚鎸DV野毒株致病性增強(qiáng)的趨勢，用常規(guī)方法改進(jìn)疫苗似乎已走到了盡頭。但是，根據(jù)過去40多年中MDV演變規(guī)律，其毒力很有可能會在今后幾年變得更強(qiáng)。近年來，在我國，即使在一些已用CV1988/Rispens免疫的雞群，仍有腫瘤發(fā)生率上升的趨勢，雖然國內(nèi)還沒有相關(guān)分離到特超強(qiáng)毒株的報道，但MDV的變異卻一直在進(jìn)行著。例如，本發(fā)明人分離的野毒株GX0101，其毒力雖比Md5(超強(qiáng)毒)小，但其橫向傳播能力卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于Md5 (許曉云，孫愛軍，崔言順，等.帶有REV-LTR片段的馬立克氏病病毒重組野毒株與超強(qiáng)毒株致病性和橫向傳播性比較.微生物學(xué)報(Acta Microbiologica Sinica), 2009,49 (4) =0540-0543)。顯然，有必要在能突破CVI988/Rispens株的保護(hù)性免疫的新的致病性更強(qiáng)的MDV野毒株出現(xiàn)并開始流行以前，應(yīng)盡快地用新的方法研制更有效的疫苗。本發(fā)明人已將GX0101的全基因組克隆進(jìn)BAC載體，構(gòu)建了其感染性克隆 GX0101-BAC,將其轉(zhuǎn)染細(xì)胞，可以拯救出重組病毒MDV的bac_GX0101 (孫愛軍，2009， Chinese ScienceBulletin. 54 :2641-2647)。按如下方法敲除 MDV 的 bac-GX0101 中的 2 個meq基因，以質(zhì)粒pKD13為模板，用PCR擴(kuò)增卡那霉素抗性基因(kanamycin resistance gene，karO，上下游引物的5’端分別含有與meq基因的前后50bp序列同源的同源臂，用來進(jìn)行同源重組。引物序列如下Ameq-F 5' -AGAAACATGGGGCATAGACGATGTGCTGCTGAGAGTCACAATGCGGATCAcgtgtagg ctggagctgcttc-3，(序列 1)；Ameq-R 5' -CTTGCAGGTGTATACCAGGGAGAAGGCGGGCACGGTACAGGTGTAAAGAGcattccgg ggatccgtcgac-3'(序列2，meq基因的前后50bp同源序列用大寫字母表示，擴(kuò)增karf的序列以小寫字母表示)。
卡那霉素抗性基因的擴(kuò)增體系如下10XBuffer 2. 5 μ L，模板pKD13 (約IOOng/ μ L) 1 μ L, Mg2+(15mmol/L)2y L, dNTP (2. 5mmol/L) 2 μ L，上下游引物(25pmol/y L)各 1 μ L, Taq enzyme (5U/ μ L) 0· 1 μ L，用雙蒸水補(bǔ)至 25 μ L。PCR 擴(kuò)增程序為:95 V IOmin,按 95°C lmin，55°C lmin，72°C lmin，30個循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。擴(kuò)增產(chǎn)物用凝膠電泳進(jìn)
行鑒定。在kan1 兩端含有 flp 識別位點(flp recognition target，F(xiàn)RT)，flp 重組酶能夠識別卡那霉素抗性基因兩側(cè)34bp的FRT位點，可特異性切除2個FRT位點內(nèi)側(cè)的序列。 PCR產(chǎn)物用Dpn I酶進(jìn)行消化Ih以去除PCR產(chǎn)物中殘留的的環(huán)狀模板質(zhì)粒，消化后的PCR 產(chǎn)物利用電轉(zhuǎn)化儀轉(zhuǎn)化進(jìn)已含有GXO101-BAC的大腸桿菌EL250中(孫愛軍，2009，Chinese ScienceBulletin. 54 :2641-2647)，電轉(zhuǎn)條件為 1800V, 100 Ω，25 μ F。轉(zhuǎn)化后立即用 Iml LB 重懸細(xì)菌，320C培養(yǎng)池后取100 μ L菌液涂于含有卡那霉素抗性的LB平板中。16h后挑取單菌落利用 PCR 鑒定 kanr 是否取代了 meq 基因(Schumacher，D.，B. K. Tischer, W. Fuchs, and N. Osterrieder. 2000. Reconstitution ofMarek' s disease virus serotype 1(MDV-I) from DNA clonedas a bacterial artificial chromosome and characterization of a glycoprotein B-negative MDV-lmutant. J. Virol. 74 :11088-11098)。經(jīng)鑒定，利用卡那霉素抗性基因取代一個meq基因后，挑取菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中于32°C過夜培養(yǎng)搖振培養(yǎng)，待其OD值達(dá)到0.5時，加10%的阿拉伯糖誘導(dǎo)lh，使宿主菌內(nèi)的質(zhì)粒flp重組酶激活和表達(dá)，從而去除卡那霉素抗性基因。所得到的菌可在只含有30μ g/mL氯霉素LB瓊脂平板上生成，但不能在同時含有30 μ g/mL氯霉素和50 μ g/mL卡那霉素的LB瓊脂平板上生長。敲除一個meq基因驗證成功后，再利用同樣的方法利用karf取代另外一個meq基因， 將獲得的缺失2個meq基因的MDV GX0101的感染性克隆質(zhì)粒命名為GX0101 Δ meq-BAC，由其質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞產(chǎn)生的病毒為GX0101 Ameq。但由于在敲除第二個Meq基因的過程中又加入了一個Karf基因，按照現(xiàn)行的基因工程產(chǎn)物生物安全法，不得將帶有Karf基因的活病毒用作疫苗。為了取得可用作疫苗的毒株，還必須敲除Karf基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是通過對flp重組酶部分誘導(dǎo)從而對3個FRT片段只產(chǎn)生部分消化再結(jié)合多重篩選，以此獲取GX0101 Δ meq AKan (SC9-1株)疫苗病毒。本發(fā)明的技術(shù)方案本發(fā)明涉及的病毒是采取一種對flp重組酶和FRT部分誘導(dǎo)消化結(jié)合多重篩選的方法，該方法將已經(jīng)連續(xù)二次采用兩端含flp識別位點karf基因替代二個特定基因后馬立克氏病毒基因組上karf基因敲除，在其過程中對flp重組酶的表達(dá)僅實施部分誘導(dǎo)，從而使病毒全基因組上總共3個被flp重組酶識別的FRT片段只被部分消化，再結(jié)合對產(chǎn)生的大量克隆逐一用PCR檢測篩選，從而獲得在生物安全角度可作為疫苗用雞馬立克氏病活疫苗病毒SC9-1株。本發(fā)明還涉及一株重組的雞馬立克氏病病毒SC9-1株在制備用于預(yù)防超強(qiáng)毒或新出現(xiàn)的特超強(qiáng)毒MDV誘發(fā)的雞馬立克氏病的雞馬立克氏病疫苗中的用途；本發(fā)明同時還涉及一種預(yù)防雞馬立克氏病的方法，其中向雞給予預(yù)防有效劑量的雞馬立克氏病疫苗，所述的疫苗包含重組雞馬立克氏病疫苗病毒MDV SC9-1株。
本發(fā)明的具體描述一.在前期已發(fā)表的研究中(李延鵬馬立克氏病病毒meq基因缺失株生物學(xué)特性及其免疫效果研究，博士學(xué)位論文，2010，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院.)，利用卡那霉素抗性基因取代一個meq基因后，挑取菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中搖振培養(yǎng)，待其OD值達(dá)到0.5時，加10% 的阿拉伯糖誘導(dǎo)lh，使宿主菌內(nèi)的質(zhì)粒flp重組酶，從而去除卡那霉素抗性基因。誘導(dǎo)后將菌分別涂布于含有30μ g/mL氯霉素或50μ g/mL卡那霉素的LB瓊脂平板上32°C過夜培養(yǎng)， 如果只在含有30 μ g/mL氯霉素的LB瓊脂平板上生長但在含50 μ g/mL卡那霉素的LB瓊脂平板上不生長，表明誘導(dǎo)后的重組菌仍具備氯霉素抗性而不再具備卡那霉素抗性(KarO， 即可確定該重組菌為目的菌。但該重組質(zhì)粒中在被去掉的第一個Meq基因所在的位置仍保留一個 flp 重組酶識別的位點(flp recognition target，F(xiàn)RT)。敲除一個Meq基因并經(jīng)驗證后，再利用同樣的方法利用kar/取代另外一個meq基因，將獲得的缺失了 2個Meq基因的MDV GX0101的感染性克隆質(zhì)粒命名為 pGXOlOl Ameq-BAC0該克隆又插入了一個karf基因。鑒于在敲除前一個karf基因是留下了一個FRT位點，在質(zhì)粒GX0101 Ameq-BAC上已存在3個FRT位點(如

圖1)。如果按同樣的方法用誘導(dǎo)flp重組酶來敲除第2個karf基因，就會同時敲除MDV的一部分基因組，因而不再能拯救到新的感染性克隆病毒。另一方面，我們已發(fā)表的GX0101 AMeq病毒，雖然沒有致病性并具備很好的保護(hù)性免疫力，但它在細(xì)胞上的復(fù)制能力較差，這一特性也不適合用作商品化疫苗。為此，本發(fā)明人在構(gòu)建敲除Meq基因的GX0101的感染性克隆過程中，對與 PGX0101 Ameq-BAC同批獲得的12個質(zhì)粒克隆菌落進(jìn)行了比較篩選。將這些單獨菌落分別重新編號為PSCAMeq-BACl至pSCAMeq-BAC12。分別將不同菌落的菌體大量培養(yǎng)后制備質(zhì)粒DNA，再轉(zhuǎn)染CEF。在細(xì)胞出現(xiàn)MDV特有的蝕斑后，分別將所得到的感染性克隆病毒命名為 SCl Δ Meq至SC12 Δ Meq0分別比較這些病毒在CEF上的復(fù)制水平，從中選擇到感染性克隆質(zhì)粒pSC Δ Meq-BAC9在CEF上形成的病毒蝕斑最快最多。該感染性克隆質(zhì)粒pSC Δ Meq_BAC9 用于進(jìn)一步的敲除其中的Karf基因。為此，我們設(shè)計了 “對flp重組酶和FRT部分誘導(dǎo)消化結(jié)合多重篩選”的新方法，即在細(xì)菌培養(yǎng)時降低對flp重組酶的誘導(dǎo)條件和時間，使一部分GX0101 Ameq-BAC質(zhì)粒DNA分子上3個FRT位點中只有2個位點被flp重組酶作用， 從而使部分分子只有karf基因二側(cè)的FRT被flp重組酶識別和作用，因此這一部分分子上只有karf基因被flp重組酶消化剪輯掉，而與另一個FRT位點相關(guān)的MDV基因組均全部保
留ο已分別將每一菌落經(jīng)過多次比較篩選，最后按如下條件取得成功感染性克隆質(zhì)粒pSC Δ Meq-BAC9轉(zhuǎn)化的E250株大腸桿菌接種于LB液體培養(yǎng)基中搖振培養(yǎng)，待其OD值達(dá)到0. 5時，加5% (完全誘導(dǎo)的標(biāo)準(zhǔn)濃度為10% )的阿拉伯糖誘導(dǎo)40min(完全誘導(dǎo)的時間為60min)，使宿主菌內(nèi)的質(zhì)粒flp重組酶只被部分激活，從而使部分MDV基因組克隆質(zhì)粒分子只去除了卡那霉素抗性基因但不影響MDV基因組部分。誘導(dǎo)后將菌涂布于含有30 μ g/mL氯霉素的LB瓊脂平板上，32°C過夜培養(yǎng)。將所有具備氯霉素抗性的菌落再分別接種二類LB瓊脂平板，一類只含30 μ g/mL氯霉素(A)，另一類同時含有30 μ g/mL氯霉素和50 μ g/mL卡那霉素(B)，二類平板上接種的菌落分別一一對號。
選擇在A板上生長而在B板上不生長的菌落即已不具備抗卡那霉素活性的菌落， 再分別接種于含有30μ g/mL氯霉素的LB瓊脂平板上，在，32°C過夜培養(yǎng)。取每一個菌落的部分菌體分別提取基因組DNA，分別用karf基因和 MDVpp38 基因特異性引物(pp38-F AGGCAGGGCATGGGAAAACAGAAG,序列 3 禾Π pp38_R ACCGACTAACATACCAGCGAAAAA,序列 4)做 PCR，選擇在 PCR 中 karf 基因陰性但 MDVpp38 基因陽性的菌落再接種于含有30 μ g/mL氯霉素的LB肉湯，用plasmid Maxi kit(購自QIAGEN 公司)大量提取質(zhì)粒DNA。然后分別用以上各個質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞單層，從其中選出MDV特有的細(xì)胞蝕斑，由此拯救到了敲除了 Kanlr抗性基因的重組病毒，命名為MDV SC9 Δ Meq Δ Kan、簡稱馬立克氏病毒SC9-1。該病毒株已于2010年12月03日保藏在北京市朝陽區(qū)北辰西路1 號院3號中國科學(xué)院微生物研究所內(nèi)中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為 CGMCCNo. 4399。二、將野毒株敲除腫瘤Meq基因的馬立克氏病疫苗病毒SC9_1株的鑒別特性該病毒基因組上帶有三個位于特定位點的特定序列可作為本病毒的鑒別性標(biāo)志(1)在原有的二個Meq基因位點，在敲除Meq基因后，各留下一個34bp的FRT序列 (序列幻，敲除二個Meq基因后，SC9-1株完全沒有致病性；(2)在病毒基因組的US/TRS片段連接點的上游約370bp處插入了一段約539bp的 REV-LTR片段(序列6)，提高了 MDV SC9-1株病毒在雞群中的橫向傳播性，因而在免疫的雞群，即使少數(shù)個體由于不可避免的技術(shù)原因被漏免，也可能由于其橫向傳播性而提供免疫作用。三.MDV SC9 Δ Meq Δ Kanr株(SC9-1株)病毒對雞的致病性和保護(hù)性免疫作用在已發(fā)表的研究中，已證明了 GX0101 Ameq對雞完全沒有致病性且可誘發(fā)100% 的保護(hù)性免疫(蘇帥，李延鵬，孫愛軍，崔治中.敲除meq的馬立克氏病毒強(qiáng)毒株對超強(qiáng)毒的免疫保護(hù)作用，微生物學(xué)報，2010，50 :380-386.)，只是由于GX0101 Δ meq帶有Kanr基因， 因而不能用作為疫苗病毒。為此，本發(fā)明采用了完全敲除Karf基因的新的疫苗毒株MDV SC9-1株，按已報道的方法(蘇帥，李延鵬，孫愛軍，崔治中.敲除meq的馬立克氏病毒強(qiáng)毒株對超強(qiáng)毒的免疫保護(hù)作用，微生物學(xué)報，2010,50 :380-386)在SPF雞用同樣方法同樣條件的人工感染試驗，具體方法如下將1日齡SPF雞180只，隨機(jī)分為6組，每組30只，分別飼養(yǎng)于6個帶有正壓過濾空氣的SPF動物飼養(yǎng)隔離器內(nèi)，1日齡時，第1組雞以2000pfu/只的劑量腹腔接種GX0101 Δ meq，第2組雞以2000pfu/只的劑量腹腔接種SC9-1、第3組雞以 2000pfu/只的劑量腹腔接種CVI988/Rispen，第4組雞為攻毒對照，第5組雞為空白對照， 第6組雞第6組雞以2000pfu/只的劑量腹腔接種SC9-1。免疫接種5天后，第1、2、3和4 組雞分別以IOOOpfu/只的攻擊劑量MDV超強(qiáng)毒株w rMd5。攻毒后每周觀察及的生長態(tài)勢。實驗期間，對各組死亡雞只剖檢，并取疑似馬立克氏病特有病變臟器做石蠟切片，HE染色后進(jìn)行病理組織學(xué)觀察。在攻毒后90天，所有的存活雞均被處死并剖檢，觀察雞的病變， 同時，每組隨機(jī)選取5只，分別取心臟、脾、肝臟于10%中性福爾馬林固定，4°C保存。石蠟切片，HE染色進(jìn)行病理組織學(xué)觀察。試驗結(jié)果證明，該病毒對SPF雞沒有致病性，并對超強(qiáng)毒vvMDV病毒株Md5表現(xiàn)出同樣的保護(hù)性免疫(表1)。從表可看出，在將Karf基因敲除后，SC9-1株病毒對SPF雞的致病性和保護(hù)性免疫效力與其GX0101 Ameq完全相同。在敲除了 Karf基因后，將符合生物安全法的要求可用作疫苗。表1. SC9 Δ meq Δ Kanr與其他毒株對SPF雞的致病性和保護(hù)性免疫效力的比較
權(quán)利要求
1.一株重組的雞馬立克氏病毒SC9-1株，其特征在于該病毒株已于2010年12月03日保藏在北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所內(nèi)中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 4399，該病毒基因組上帶有三個位于特定位點的特定序列可作為本病毒的鑒別性標(biāo)志(1)在原有的二個Meq基因位點，在敲除Meq基因后，各留下一個34bp的序列FRT(序列5)敲除二個Meq基因后，SC9-1株完全沒有致病性；(2)在病毒基因組的US/TRS片段連接點的上游約370bp處插入了一段約539bp的 REV-LTR片段(序列6)，提高了 MDV SC9-1株病毒在雞群中的橫向傳播性，因而在免疫的雞群，即使少數(shù)個體由于不可避免的技術(shù)原因被漏免，也可能由于其橫向傳播性而提供免疫作用。
2.如權(quán)利要求1所述的一株重組的雞馬立克氏病毒SC9-1株，其特征在于采取一種對 flp重組酶和FRT部分誘導(dǎo)消化結(jié)合對大量克隆篩選的方法，將已經(jīng)連續(xù)二次采用兩端含 flp識別位點karf基因替代二個特定致病基因后馬立克氏病毒基因組上保留的karf基因敲除。在其過程中對flp重組酶的表達(dá)僅實施部分誘導(dǎo)，從而使病毒全基因組上總共3個被flp重組酶識別的FRT片段只被部分消化，對產(chǎn)生的大量克隆逐一用PCR檢測篩選，從而獲得在生物安全角度可作為疫苗用的不再保留karf基因的雞馬立克氏病活疫苗病毒SC9-1 株。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的一株重組的雞馬立克氏病病毒SC9-1株在制備用于預(yù)防超強(qiáng)毒或新出現(xiàn)的特超強(qiáng)毒MDV誘發(fā)的雞馬立克氏病的雞馬立克氏病疫苗中的用途。
4.一種預(yù)防雞馬立克氏病的方法，其中向雞給予預(yù)防有效劑量的雞馬立克氏病疫苗， 所述的疫苗包含權(quán)利要求1所述的重組雞馬立克氏病疫苗病毒MDV SC9-1株。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株重組雞馬立克氏病疫苗病毒SC9-1株的構(gòu)建和應(yīng)用。本發(fā)明的重組病毒構(gòu)建方法解決了連續(xù)二次采用兩端含有flp識別位點kanr基因敲除同一病毒基因組上二個特定致病基因，所獲得的重組病毒SC9-1株用作馬立克氏病活疫苗的生產(chǎn)毒株所制備的疫苗，預(yù)防超強(qiáng)毒或新出現(xiàn)的特超強(qiáng)毒MDV誘發(fā)的雞馬立克氏病，其保護(hù)性免疫效果優(yōu)越于目前國內(nèi)外市場上應(yīng)用最廣泛的CVI988/Rispens株疫苗。該重組病毒的抗原性應(yīng)比美國已發(fā)表的同類病毒rMd5Δmeq更類同于中國的流行株，不僅不會誘發(fā)腫瘤，也沒有免疫抑制作用，因而更實用于中國。
文檔編號A61P31/12GK102154224SQ20101058767
公開日2011年8月17日 申請日期2010年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月14日
發(fā)明者崔治中, 蘇帥, 趙鵬 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)