專利名稱：含有表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯與索拉非尼的抗腫瘤藥物組合物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥及基因工程領(lǐng)域，涉及表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)與索拉非尼(SORA)組合及其在制備抗腫瘤藥劑中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
索拉非尼(sorafenib)是拜耳和ONYX公司共同研制的一種多靶點(diǎn)的生物靶向新藥，臨床前研究和臨床試驗(yàn)提示索拉非尼有廣泛的抗腫瘤作用。美國(guó)FDA已于2005年12月 20日批準(zhǔn)了索拉非尼用于治療晚期腎細(xì)胞癌，這是近十多年來(lái)世界上被批準(zhǔn)的治療晚期腎癌的第一個(gè)新藥，是晚期腎癌治療的重大進(jìn)展。2006年11月30日索拉非尼也在中國(guó)上市。 索拉菲尼的CAS編號(hào)為284461-73-0，分子式為C21H16C1F3N4O3，分子量為464. 83，化學(xué)名為4- {4- [3- (4-氯-3-三氟甲基-苯基)-酰脲]-苯氧基}-吡啶-2-羧酸甲胺-4-甲苯磺酸鹽。索拉非尼是首個(gè)雙芳基尿素類口服多激酶抑制劑，即酪氨酸激酶抑制劑、血管生成抑制劑和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子抑制劑。它具有雙重抗腫瘤作用，一方面通過(guò)抑制Raf/MEK/ ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路直接抑制腫瘤生長(zhǎng)，另一方面通過(guò)抑制幾種與新生血管生成和腫瘤發(fā)展有關(guān)的酪氨酸激酶受體的活性，包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-2 (VEGFR-2)，VEGFR-3，血小板衍生的生長(zhǎng)因子受體-β (PDGFR-β )和c-KIT原癌基因，阻斷腫瘤新生血管生成，間接抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，從而起到抗腫瘤作用。索拉非尼是本類化合物中第1個(gè)進(jìn)入臨床試驗(yàn)的藥物，可在抑制Raf活性的劑量下，顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖。索拉非尼對(duì)晚期肝癌也具有極佳的治療效果。索拉非尼用于治療晚期肝癌的三期臨床試驗(yàn)已經(jīng)完成，目前已在美國(guó)FDA和歐盟藥監(jiān)局進(jìn)入了快速審批程序。同時(shí)，索拉非尼也可用于轉(zhuǎn)移性黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌等癌癥的治療。索拉非尼最常見(jiàn)的不良反應(yīng)包括手足綜合征、疲乏、腹瀉、皮疹、高血壓、脫發(fā)、皮膚瘙癢和惡心或食欲下降。惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程是由多因素誘導(dǎo)和多基因參與的。索拉非尼具有獨(dú)特的多靶點(diǎn)的抗腫瘤作用，是基于對(duì)腫瘤發(fā)生的分子生物學(xué)機(jī)理認(rèn)識(shí)的基礎(chǔ)上研制成功的新藥。索拉非尼的臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，索拉非尼與化療藥物不同，其作用主要為抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和血管的形成，而非細(xì)胞毒效應(yīng)，因此毒副反應(yīng)較輕，耐受性較好。多靶點(diǎn)抑制劑在治療方面優(yōu)于單靶點(diǎn)抑制劑，索拉非尼具有潛在廣譜的抗腫瘤作用。如何進(jìn)一步提高索拉非尼的療效(如與其他藥物聯(lián)用)無(wú)疑也是目前臨床試驗(yàn)急待研究解決的問(wèn)題。雷帕霉素是一種mTOR通路抑制劑，有一定的抗腫瘤的作用。已有的臨床前研究表明，在肝癌治療中將雷帕霉素與索拉非尼聯(lián)合使用能夠極大的提高索拉非尼的療效，但是這兩種化合物聯(lián)合使用時(shí)的毒副作用較強(qiáng)。所以如何在增強(qiáng)索拉非尼抗腫瘤活性的同時(shí)，保持較低的毒副作用也是需要考慮的問(wèn)題。茶葉(tehcamellia sinensis)是深受人們喜愛(ài)的飲品之一。全世界每年生產(chǎn)大約250萬(wàn)噸，其中20%為綠茶、78%為紅茶、洲為烏龍茶。茶葉的種類雖然很多，但以綠茶為人矚目。大量的體外研究及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明綠茶提取物有多種生物活性和藥理效應(yīng)，如防癌抗癌、抗血管生成、抗突變、抗氧化、抗衰老、抗菌、抗炎、降血脂、抗血小板聚集等等，其中與癌癥的關(guān)系是研究最為廣泛、也是最復(fù)雜的有意義的重要課題。綠茶中的主要成分為茶多酚，占茶葉干重的30%左右，茶多酚中大部分為兒茶素， 表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯〔(-)_印igallocatechin gallate, (EGCG)〕含量最高，占兒茶素的80%左右。EGCG分子式為C22H18O11,分子量為458. 4。它是一種高效廣譜無(wú)毒副作用的生物抗氧化劑，俗稱沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯。沒(méi)食子酸酯能有效清除引發(fā)多種疾病和衰老的體內(nèi)自由基和過(guò)氧化物，提高人體免疫力，延緩衰老，具有優(yōu)異的抗病毒、降血脂、保鮮、美容等效能，在醫(yī)藥、保健、食品、日化等行業(yè)有廣泛的用途。但是綠茶提取物畢竟不是細(xì)胞毒類藥物，在體外對(duì)腫瘤細(xì)胞的直接殺傷作用不是很強(qiáng)。綠茶提取物及其主要成分不會(huì)也不能取代現(xiàn)有的抗腫瘤藥物，其獨(dú)特價(jià)值在于作為腫瘤化療中的生化調(diào)節(jié)劑，可增強(qiáng)現(xiàn)有抗腫瘤藥物的抗腫瘤活性，降低抗腫瘤藥物的毒性。到目前為止，還沒(méi)有EGCG與索拉非尼聯(lián)合使用的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的抗腫瘤藥物。本發(fā)明提供了一種抑制腫瘤細(xì)胞增殖的組合物，該組合物含有表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯和索拉非尼，兩者的摩爾比為200 1-4 :1。較好的，表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯和索拉非尼的摩爾比為160:1 8:1。更好的，摩爾比為120:1 8:1，或者80:1 13:1,40 1，60 :1，100 :1，32 :1，20 :1，26 :1，39 :1，52 :1 等。索拉菲尼的CAS編號(hào)為觀4461-73-0，分子式為C21H16C1F3N4O3,分子量為 464. 83,化學(xué)名為4- {4-[3- (4-氯-3-三氟甲基-苯基)-酰脲]-苯氧基}-吡啶-2-羧酸甲胺-4-甲苯磺酸鹽。源自德國(guó)拜耳公司。表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯〔(-)_印igallocatechin gallate, (EGCG)〕的分子式為C22H18O11,分子量為458. 4。EGCG購(gòu)自Sigma公司，貨號(hào)5(^99，英文全稱()-cis-2 -(3,4, 5-Trihydroxyphenyl)-3, 4-dihydro-l(2H)-benzopyran-3, 5, 7-triol 3-gallate, ( )-cis-3, 3 ' , 4 ' , 5, 5 ' , 7-Hexahydroxy-flavane-3-gallate, EGCG ;CAS 號(hào) 989-51-5。MDL 號(hào)MFCD00075940。本發(fā)明中，EGCG與臨床常用的抗肝癌藥物sorafenib在腫瘤細(xì)胞株中均具有一定的協(xié)同效應(yīng)。本發(fā)明中，將EGCG與索拉非尼的組合物用于腫瘤細(xì)胞(例如，肝癌細(xì)胞株 SK-H印1)，結(jié)果顯示，與僅使用索拉非尼相比，抑制腫瘤細(xì)胞增殖的效果明顯增強(qiáng)。EGCG和索拉非尼聯(lián)用，明顯降低了索拉非尼的使用量，其降低效果隨著EGCG用量的增加而更加明
Mo本發(fā)明中，將EGCG和索拉非尼的組合物用于裸鼠移植瘤模型，結(jié)果顯示，與僅使用索拉非尼相比，本發(fā)明的EGCG與索拉非尼組合物對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的抑制效果顯著增強(qiáng)，并且效果優(yōu)于雷帕霉素與索拉非尼組合物。同時(shí)，檢測(cè)以體重變化為指標(biāo)的給藥后藥物的毒性效應(yīng)顯示，EGCG和索拉非尼聯(lián)合使用時(shí)對(duì)裸鼠體重沒(méi)有明顯影響，而雷帕霉素和索拉非尼聯(lián)合使用則引起的裸鼠體重的降低。并且EGCG和索拉非尼聯(lián)合使用時(shí)對(duì)裸鼠的肝臟和腎臟基本沒(méi)有毒性，而雷帕霉素和索拉非尼聯(lián)合使用則對(duì)裸鼠的肝臟和腎臟有較高毒性。EGCG和索拉非尼聯(lián)用，與單獨(dú)使用EGCG或者索拉非尼相比，在抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)方面具有明顯的增效作用，而且增效作用具有EGCG和索拉非尼濃度梯度效應(yīng)。本發(fā)明的實(shí)施例列舉T EGCG和索拉非尼含量比為20 1，100 1，200 1等。實(shí)驗(yàn)表明，在兩者含量為 200:1-13:1的范圍都是有效果的。本發(fā)明中還提供了一種殺傷腫瘤細(xì)胞的方法，即在腫瘤細(xì)胞中加入EGCG和索拉非尼組合物，EGCG和索拉非尼的摩爾比為200 1-13:1。本發(fā)明中，所述的腫瘤細(xì)胞可以是HepG2、SK-hep-1、YYl、L02、或者PLC細(xì)胞。本發(fā)明的組合物，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時(shí)，可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無(wú)毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中PH通常約為7-8， 盡管PH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過(guò)常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。以本發(fā)明的EGCG與索拉非尼的組合物為例，可以將其與合適的藥學(xué)上可接受的載體聯(lián)用。這類藥物組合物含有治療有效量的蛋白質(zhì)和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的EGCG和索拉非尼可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物， 可通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無(wú)菌條件下制造。此外，本發(fā)明的EGCG與索拉非尼的組合物還可與其他治療劑一起使用。本發(fā)明中，EGCG與索拉非尼的組合物可以是針劑或者片劑。當(dāng)本發(fā)明的EGCG與索拉非尼的組合物被用作藥物時(shí)，可將治療有效劑量的該藥物施用于哺乳動(dòng)物，其中該治療有效劑量通常至少約60毫克索拉非尼+50毫克EGCG/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。本發(fā)明提供了一種新的組合物，該組合物含EGCG和索拉非尼。該組合物可用于制備抗腫瘤藥物。EGCG和索拉非尼聯(lián)用，用于制備抗腫瘤藥物，可以大大增強(qiáng)索拉非尼的抗腫瘤效果，同時(shí)相對(duì)減少了索拉非尼的用量及藥物成本。由于EGCG是天然的茶葉提取物，而茶葉又是全世界三分之二的人口經(jīng)常飲用的飲料。不僅資源豐富，價(jià)格低廉，經(jīng)過(guò)了千年以上的飲用，幾乎沒(méi)有毒副作用。EGCG作為索拉非尼的輔助藥物使用，為一種新的高效價(jià)廉抗腫瘤藥物的配伍方案，提高了腫瘤的抑制率，降低了腫瘤患者的治療成本。


圖1是SK-Ifepl細(xì)胞中EGCG與CBP、MITOC、SORA、DAU有協(xié)同作用。其中，橫坐標(biāo) fa是藥物作用效應(yīng)。圖2是H印;3B細(xì)胞和SMMC7721細(xì)胞中EGCG與SORA有協(xié)同作用。其中，橫坐標(biāo)fa 是藥物作用效應(yīng)。圖 3 是 EGCG 增效 SORA。
圖4是EGCG降低SORA用量。圖5是EGCG與SORA聯(lián)合使用對(duì)裸鼠體重?zé)o影響。圖6是EGCG與SORA聯(lián)合使用使腫瘤體積減小。圖7是EGCG與SORA聯(lián)合使用使瘤體重量減少。圖8是圖7相應(yīng)的柱狀圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 EGCG在十種肝癌細(xì)胞系中與十種抗肝癌藥物有協(xié)同效應(yīng)
我們?cè)谑N肝癌細(xì)胞系中固定EGCG的濃度，分別與四種抗肝癌藥物聯(lián)合用藥。使用金氏公式Q值來(lái)評(píng)價(jià)聯(lián)用效果。Q=Ea+b/ a+Eb-EaXm3)，Ea+b為合并用藥抑制率，Ea和 Eb分別為A藥和B藥的抑制率。分子代表實(shí)際測(cè)量的兩藥合并抑制率，分母是期待合并抑制率。Q=O. 85-1. 15范圍表示單純相加，Q=L 15-2范圍表示有增強(qiáng)，Q>2表示明顯增強(qiáng)， Q<0. 55-0. 85表示有拮抗效應(yīng)，Q<0. 55表示明顯拮抗。由表1可知，EGCG與四種抗肝癌藥物在特定的細(xì)胞株中均有一定的協(xié)同效果，說(shuō)明EGCG在特定的細(xì)胞株中可以增強(qiáng)現(xiàn)有抗肝癌藥物的抗腫瘤活性。下述細(xì)胞均來(lái)源于ATCC，均為人肝癌細(xì)胞。Carboplatin> Mitomycin C、sorafenib、Daunorubicin 分別是卡鉬、絲裂霉素 C、 索拉非尼柔紅霉素。這四種藥物的抗癌機(jī)理和作用性質(zhì)有所不同=Carboplatin是DNA合成抑制劑，Daunorubicin是DNA、RNA合成抑制劑，Mitomycin C是葉酸拮抗劑，sorafenib 是多激酶抑制劑。表1 EGCG與抗肝癌藥物的聯(lián)合用藥效果
權(quán)利要求
1.一種抑制腫瘤細(xì)胞增殖的組合物，其特征在于，該組合物含有表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯和索拉非尼，兩者的摩爾比為200 :1 4 :1。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯和索拉非尼的摩爾比為160:1 8:1。
3.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯和索拉非尼的摩爾比為120:1 8:1。
4.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯和索拉非尼的摩爾比為80:1 13:1。
5.權(quán)利要求1所述的組合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征是，所述的腫瘤是肝癌。
7.一種抑制腫瘤細(xì)胞增長(zhǎng)的方法，其特征在于，在腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液中加入權(quán)利要求1 所述組合物。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的腫瘤細(xì)胞是H印G2、SK-hep-UYYU L02、或者PLC細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥和基因工程領(lǐng)域，提供了一種抑制腫瘤細(xì)胞增殖的組合物。該組合物含有表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯和索拉非尼，兩者的摩爾比為200:1～4:1。本發(fā)明組合物中EGCG和索拉非尼聯(lián)用，一方面抑制腫瘤細(xì)胞增殖的效果比單獨(dú)使用效果的疊加更明顯；另一方面，兩者聯(lián)用對(duì)裸鼠肝臟和腎臟則基本沒(méi)有毒性，增強(qiáng)了索拉非尼的抗腫瘤效果。本發(fā)明組合物中的EGCG來(lái)自于天然的茶葉提取物，不僅資源豐富，價(jià)格低廉，且經(jīng)過(guò)常年飲用證實(shí)，幾乎沒(méi)有毒副作用，因此所述的EGCG和索拉非尼聯(lián)用，增強(qiáng)了抗腫瘤效果，減少了藥物毒性及藥物成本。
文檔編號(hào)A61K31/353GK102526046SQ20101058725
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2010年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月14日
發(fā)明者余龍, 劉祖龍, 唐麗莎, 張明君, 朱恒銳 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)