一種制備高純度兒茶素沒食子酸酯cg的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種制備高純度兒茶素沒食子酸酯CG的方法，尤其涉及表型兒茶素異構(gòu)體化合物的高溫轉(zhuǎn)化及其單體化合物的制備、分離和純化的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]茶葉中的兒茶素主要為表型兒茶素，即表沒食子兒茶素沒食子酸酯EGCG、表沒食子兒茶素EGC、表兒茶素沒食子酸酯ECG、表兒茶素EC，它們約占兒茶素總量的60?80%。其中EGCG是綠茶茶多酚中含量最高的物質(zhì)，也是目前公認(rèn)的茶葉中最主要的抗氧化成分。然而現(xiàn)有研究已經(jīng)證實，表型兒茶素的異構(gòu)體如兒茶素沒食子酸酯CG等(其化學(xué)結(jié)構(gòu)如附圖1所示)在某些方面表現(xiàn)出較強(qiáng)的生理活性，如抗氧化和清除自由基活性等。
[0003]兒茶素單體化合物主要是從茶葉或茶葉提取物中進(jìn)行提取，常用的分離純化方法有液液萃取、柱層析、中低壓柱色譜、高壓制備液相色譜和高速逆流色譜分離等。兒茶素的分離純化不乏其他方法，也常常采用兩種或多種方法聯(lián)合使用。文獻(xiàn)及專利中常見表沒食子兒茶素沒食子酸酯EGCG、表兒茶素沒食子酸酯ECG等的分離純化報道，但制備兒茶素沒食子酸酯CG單體化合物的方法較少。公開專利CN 102120738 A《一種非表型兒茶素單體的制備方法》，以兒茶素單體化合物為原料，經(jīng)高溫加壓熱轉(zhuǎn)化和凝膠介質(zhì)分離等過程制備非表型兒茶素。如以表兒茶素沒食子酸酯ECG為原料，制得了純度98.6%的兒茶素沒食子酸酯CG單體化合物，但該方法原料成本高；同時，在轉(zhuǎn)化過程中加入鈉鹽或鉀鹽的堿金屬，引入了無機(jī)鹽等雜質(zhì)，且采用凝膠分離純化的方法，所制備的單體化合物純度較低。
[0004]鑒于兒茶素沒食子酸酯CG良好的營養(yǎng)保健和生理藥理作用，在茶葉及茶葉相關(guān)制品的質(zhì)量控制、生產(chǎn)工藝的優(yōu)化及其基礎(chǔ)功效學(xué)的研究過程中，需要高純度的兒茶素沒食子酸酯CG單體化合物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是制備兒茶素沒食子酸酯CG純度大于99%的高純單體化合物。本發(fā)明研制的高純度兒茶素沒食子酸酯CG單體化合物，可用于茶葉及其制品中相關(guān)物質(zhì)含量監(jiān)測的質(zhì)量控制，相關(guān)物質(zhì)基礎(chǔ)營養(yǎng)、保健、生理、藥理學(xué)功效的研究，以及相關(guān)物質(zhì)對照品和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制等領(lǐng)域。
[0006]本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的，其制備流程如附圖2所示。
[0007]步驟1.茶多酚溶液的配制步驟1-1.茶多酚樣品的篩查
綠茶茶多酚中兒茶素的含量較高，優(yōu)選綠茶茶多酚。市售綠茶茶多酚中兒茶素(總量)的含量有20%、40%、60%、80%、90%、95%、98%等諸多品種，優(yōu)選兒茶素(總量)含量較高的品種。市售綠茶茶多酚中咖啡因的含量為0%?50%不等，優(yōu)選咖啡因含量較低的品種。
[0008]步驟1-2.料液的配制
稱取步驟1-1優(yōu)選的一定量的綠茶茶多酚樣品，加適量溶劑，攪拌超聲溶解，配制一定濃度的料液。溶劑可選擇超純水、甲醇、乙腈、乙醇等或其混合溶液，優(yōu)選超純水作為溶劑；料液濃度可以配制100?1000 mg/mL，優(yōu)選300 mg/mL。
[0009 ]步驟2.料液的高溫轉(zhuǎn)化
取適量配制的料液，于適當(dāng)溫度轉(zhuǎn)化一定時間。轉(zhuǎn)化溫度可選100?150° C，優(yōu)選130° C。轉(zhuǎn)化時間可選10~300 min，優(yōu)選120 min。
[0010]步驟3.轉(zhuǎn)化液的快速制備液相色譜分離步驟3-1.快速制備液相色譜分離
快速制備液相色譜可以選擇多種類型的色譜填料，如Cl 8、C8、C4等，優(yōu)選Cl 8填料。填料粒徑可以選擇5?100 μπι，優(yōu)選20?40 μπι的填料?？焖偕V柱的尺寸規(guī)格以及填料裝填質(zhì)量可以選擇多種，本發(fā)明使用裝填質(zhì)量為120 g的填料。
[0011]快速制備液相色譜分離中，可以選擇多種流動相體系，如水、甲醇、乙腈、乙醇等，或其適當(dāng)比例的混合液，本發(fā)明中采用甲醇-水體系。流動相中可以添加不同種類及不同含量的調(diào)節(jié)劑，如甲酸、乙酸、磷酸等，或其相應(yīng)的緩沖鹽體系，本發(fā)明采用水相中添加0.1%(體積比)的乙酸。
[0012]快速制備液相色譜分離中，可以優(yōu)化多種分離條件，如上樣量、流速、等度或梯度洗脫方式等。本發(fā)明采用粒徑為20?40 μπι，填料質(zhì)量120 g的快速制備液相色譜柱，優(yōu)化的快速制備液相色譜分離條件如下:流動相A:甲醇，流動相B:含0.1%(體積比)乙酸的水溶液；流速:50 mL/min;梯度洗脫:15%A (O min) - 20%A (5 min) - 25%A (10 min) - 30%A(25 min) - 35%A (30 min) - 50%A (40 min);上樣量:3 mL;檢測波長:278 nm。
[0013]取適量步驟2制備的轉(zhuǎn)化液，用0.22Mi微孔濾膜過濾，在步驟3-1優(yōu)選的快速制備液相色譜分離條件下，收集33.2?34.7 min的兒茶素沒食子酸酯CG餾分。多次進(jìn)樣，收集合并兒茶素沒食子酸酯CG餾分。
[0014]步驟3-2.快速制備液相色譜收集兒茶素沒食子酸酯CG餾分純度的檢測
采用高效液相色譜法檢測快速制備液相色譜收集兒茶素沒食子酸酯CG餾分的純度，結(jié)果顯示純度大于95%。
[0015]所使用的高效液相色譜分析方法如下:色譜柱:C18，5μπι, 4.6*250mm;色譜柱溫度:35 ° C;流動相A:甲醇;流動相B:含0.1%(體積比)乙酸的水溶液;等度洗脫:30%A;流速:ImL/min;檢測波長:278 nm;進(jìn)樣量:10 yLo
[0016]步驟3-3.對步驟3-1快速制備液相色譜收集的兒茶素沒食子酸酯CG餾分，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的方法去除甲醇，濃縮液再經(jīng)過冷凍干燥，制得兒茶素沒食子酸酯CG單體化合物粗品O
[0017]步驟4.兒茶素沒食子酸酯CG單體化合物粗品的高壓制備液相色譜分離步驟4-1.高壓制備液相色譜上樣液的配制
稱取一定量步驟3-3制備的兒茶素沒食子酸酯CG單體化合物粗品，加適量溶劑溶解，配制一定濃度的溶液。本發(fā)明中，濃度為40 mg/mL，溶劑為30%(體積比)甲醇水溶液。
[0018]步驟4-2.高壓制備液相色譜分離
高壓制備液相色譜分離中，可選擇不同種類和不同粒徑的色譜填料，以及不同尺寸規(guī)格和填料質(zhì)量的色譜柱。本發(fā)明中，在優(yōu)選條件下，采用C18填料，填料粒徑為10 μπι，色譜柱尺寸為21.5*250 mm。
[0019]對優(yōu)選的高壓制備液相色譜柱，可以優(yōu)化多種分離條件，如上樣量、流速、等度或梯度洗脫方式等。本發(fā)明中優(yōu)化的高壓制備液相色譜分離條件如下:流動相A:甲醇;流動相B:含0.1%(體積比)乙酸的水溶液;等度洗脫:30%A;流速:25 mL/min;上樣量:2 mL;檢測波長:278 nm。
[0020]在優(yōu)化的高壓制備液相色譜分離條件下，收集兒茶素沒食子酸酯CG餾分。多次進(jìn)樣，收集并合并兒茶素沒食子酸酯CG餾分。
[0021]步驟4-3.高壓制備液相色譜收集兒茶素沒食子酸酯CG餾分純度的檢測
對高壓制備液相色譜收集的兒茶素沒食子酸酯CG餾分，進(jìn)行高效液相色譜分析，分析方法如步驟3-2，結(jié)果顯示兒茶素沒食子酸酯CG的含量大于99%。
[0022]步驟4-4.高壓制備液相色譜收集兒茶素沒食子酸酯CG餾分的濃縮干燥
對步驟4-2高壓制備液相色譜收集的兒茶素沒食子酸酯CG餾分，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、冷凍干燥和真空干燥，制得兒茶素沒食子酸酯CG高純單體化合物。
[0023]步驟4-5.兒茶素沒食子酸酯CG高純單體化合物純度的檢驗
分別稱取一定量步驟4-4制備的兒茶素沒食子酸酯CG高純單體化合物，加適量50%(體積比)甲醇溶液溶解，配制濃度為0.5 mg/mL的溶液，進(jìn)行高效液相色譜分析檢測，分析方法如步驟3-2所示。采用面積歸一化法計算相應(yīng)主成分的含量，結(jié)果顯示兒茶素沒食子酸酯CG的HPLC純度大于99%。
[0024]本發(fā)明以綠茶茶多酚為原料，經(jīng)過高溫轉(zhuǎn)化、快速制備液相色譜和高壓制備液相色譜分離純化，制備了高純度兒茶素沒食子酸酯CG單體化合物，本發(fā)明具有如下有益效果:
本發(fā)明所用原料市場供應(yīng)充足，綠茶茶多酚中兒茶素含量較高，適于作為原料制備本發(fā)明所述的兒茶素沒食子酸酯CG高純單體化合物。
[0025]本發(fā)明采用高溫轉(zhuǎn)化的方法，提高了綠茶茶多酚溶液中兒茶素沒食子酸酯CG的含量。
[0026]本發(fā)明采用快速制備液相色譜的方法進(jìn)行料液的初步分離，茶多酚轉(zhuǎn)化液中組成成分復(fù)雜，含有大量的表型兒茶素及其他化合物，快速制備液相色譜采用C18填料，分離效率較高，采用粒徑20?40 Mi的填料，上樣量大，制備效率高。
[0027]本發(fā)明采用高壓制備液相色譜的方法，產(chǎn)物的雜質(zhì)含量少，HPLC純度高。
[0028]本發(fā)明制備的產(chǎn)物含量高，HPLC純度大于99%，無機(jī)金屬、水分及揮發(fā)性等雜質(zhì)含量低。
[0029]本發(fā)明可同時制備兒茶素C、表兒茶素EC、表沒食子兒茶素EGC、表兒茶素沒食子酸酯ECG、表沒食子兒茶素沒食子酸酯EGCG、沒食子兒茶素沒食子酸酯GCG和沒食子兒茶素GC等高純單體化合物。
[0030]本發(fā)明技術(shù)路線簡單，采用快速制備液相色譜結(jié)合高壓制備液相色譜分離純化，單次分離時間短，方法優(yōu)化過程便捷。
[0031]本發(fā)明易于放大，高溫轉(zhuǎn)化、快速制備液相色譜及高壓制備液相色譜分離等過程單元均可進(jìn)行克級至公斤級的制備。
[0032]本發(fā)明綠色環(huán)保，避免了傳統(tǒng)提取、萃取分離中使用乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷等有機(jī)溶劑;本發(fā)明制備分離中使用的甲醇在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)過程中可以回收;本發(fā)明未引入無機(jī)鹽、重金屬等雜質(zhì)。
【附圖說明】
[0033]圖1為兒茶素沒食子酸酯CG的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
[0034]圖2為兒茶素沒食子酸酯CG高純單體化合物的制備技術(shù)流程。
[0035]圖3為快速制備液相色譜分離綠茶茶多酚高溫轉(zhuǎn)化液的色譜圖。
[0036]圖4為高壓制備液相色譜分離兒茶素沒食子酸酯CG單體化合物粗品的色譜圖。
[0037]圖5為兒茶素沒食子酸酯CG高純單體化合物高效液相色譜法純度檢測的色譜圖，HPLC 純度為99.80%。
【具體實施方式】
[0038]以下結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0039]如圖2所示，茶葉及其制品中兒茶素沒食子酸酯CG的含量較低，本發(fā)明中采用綠茶茶多酚為原料，料液經(jīng)高溫轉(zhuǎn)化，茶多酚中表兒茶素沒食子酸酯ECG部分地轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的異構(gòu)體兒茶素沒食子酸酯CG，提高了料液中兒茶素沒食子酸酯CG的含量。在兒茶素單體化合物的制備分離中，需要考慮分離純化效率、成本以及是否環(huán)境友好等。傳統(tǒng)的方法如液液萃取技術(shù)雖然操作簡單，但提純效率差，有時還需要使用有毒溶劑等;硅膠柱層析等方法，雖然上樣量較大，但也存在分離提純效率低，制備的單體化合物純度較低;高速逆流色譜可以得