沒食子酸乙酯在治療骨肉瘤方面的新用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種沒食子酸乙酯的藥物應(yīng)用,尤其是在治療U2-0S型骨肉瘤作用的藥物的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]骨肉瘤(Osteosarcoma)是起源于骨骼的惡性腫瘤,其發(fā)病率在原發(fā)性骨惡性腫瘤中占居首位。骨肉瘤患者中75%為青少年,男性患者是女性患者的1.5倍,其惡性程度甚高,容易發(fā)生早期肺轉(zhuǎn)移,預(yù)后極差,既往一經(jīng)發(fā)現(xiàn)多采取截肢手術(shù)治療,即便如此,患者術(shù)后5年存活率也僅為5-20%,這為患者及其家庭帶來極大的精神傷害,也為社會乃至國家都帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前保肢手術(shù)輔以大劑量化療逐步成為骨肉瘤的首選治療方案,但仍有20-40%患者死于轉(zhuǎn)移。
[0003]在前期研究中,我們從二色補(bǔ)血草中分離得到了沒食子酸乙酯,其又稱3,4,5-三羥基苯甲酸乙酯,英文名稱是Ethyl gallate,除了存在于二色補(bǔ)血草中,很多植物如狼毒大戟,赤芍,翻白草,亮葉圍涎樹,美麗芍藥,南天竹種子,芡實(shí),中華補(bǔ)血草,澤漆,窄葉芍藥以及雞尾木等植物中也發(fā)現(xiàn)了其的存在。它不僅以天然產(chǎn)物形式存在于多種植物中,也可以方便的被合成。
[0004]沒食子酸乙酯除了用作油脂的抗氧化劑、食品添加劑及某些藥品的中間體,還發(fā)現(xiàn)對小鼠腎上腺嗜鉻瘤細(xì)胞株P(guān)C12有一定的抑制作用,對結(jié)腸癌L0V0細(xì)胞、肺癌A549細(xì)胞、口腔鱗癌CAL-27細(xì)胞的生長均具有一定的抑制作用,體外可顯著抑制人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲、運(yùn)動以及黏附能力,對過氧化氫造模的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y的氧化損傷模型,具有一定的保護(hù)作用。
[0005]盡管沒食子酸乙酯的作用陸續(xù)被研究學(xué)者發(fā)現(xiàn),但其在治療骨肉瘤,特別是U2-0S型骨肉瘤方面的研究仍未見報(bào)道。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明旨在提供一種沒食子酸乙酯的新的藥物應(yīng)用用途,尤其是在治療U2-0S型骨肉瘤作用的藥物的用途。
[0007]本發(fā)明中所用PBS緩沖液配制方法如下:8 gNaCl,0.2 gKCl,1.44 gNa2HP04,0.20gKH2P04,加超純水至1000 mL,調(diào)節(jié)PH7.2-7.4,高壓高溫(121 °C )滅菌20min,4°C冷藏備用。
[0008]本發(fā)明中所用胰酶配制方法如下:稱取胰蛋白酶粉0.50 g和EDTA 1 g,溶于200mL PBS緩沖液中。低溫下攪拌4 h,充分溶解后,調(diào)整PH 7.2-7.4。0.22 μ m濾膜過濾除菌,用15 mL試管分裝,-20°C凍存?zhèn)溆谩?br>[0009]本發(fā)明中所用RPMI1640培養(yǎng)基配制方法如下:將RPMI Medium 1640固體粉末培養(yǎng)基6.75 g溶于500 mL超純水中,加入32.5 mg青霉素、50 mg鏈霉素、1 g NaHC03,充分溶解;0.22 μπι濾膜過濾除菌,在超凈工作臺內(nèi)向100mL瓶分裝,每瓶85 mL,4°C冷藏備用。使用時(shí)每瓶加入10 mL馬血清、5 mL胎牛血清,配置成15%培養(yǎng)基。
[0010]本發(fā)明中所用MTT配制方法如下:稱取20 mg MTT于5 mL試管中,加入4 mL PBS緩沖液,使用渦旋儀使其完全溶解,即成5 mg/mL MTT液;用0.22 Mm微孔濾器除菌后_20°C冷凍保存。
[0011]本發(fā)明中所用酸液配制方法如下:稱取120 g重鉻酸鉀加入1000 mL超純水中,加熱輔助使其完全溶解;將該溶解液緩慢加入200 mL濃硫酸中,并不斷攪拌,至其冷卻。
[0012]本發(fā)明的步驟如下:
1、細(xì)胞株復(fù)蘇:在敞口瓶中加入蒸餾水,放入38°C恒溫水槽中,待其溫度恒定后將凍存于-198°C液氮中的細(xì)胞取出,快速放入敞口瓶中,晃動,使凍存管內(nèi)液體于1-2 min內(nèi)溶化。用酒精棉擦拭凍存管,放入工作臺內(nèi),將細(xì)胞液吸入15 mL試管內(nèi),同時(shí)加入10 mL該細(xì)胞株的新鮮培養(yǎng)基,1000 rpm離心4 min。棄去上清液,移液槍注入1 mL新鮮培養(yǎng)基吹打分散后,注入已裝有7 mL新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶內(nèi),輕旋蓋子,于0)2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
[0013]2、細(xì)胞換液:將細(xì)胞培養(yǎng)瓶抒緊蓋子后從培養(yǎng)箱中拿出,觀察瓶內(nèi)培養(yǎng)基的顏色及是否渾濁,于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況。用酒精棉將培養(yǎng)瓶擦拭后放入超凈工作臺,取下蓋子,倒掉培養(yǎng)基。用移液槍吸取2 mL PBS打入培養(yǎng)瓶內(nèi),蓋上蓋子后,晃動幾次,倒掉PBS,重復(fù)此操作一次。用移液槍吸取8 mL新鮮培養(yǎng)基注入培養(yǎng)瓶內(nèi),蓋上蓋子,觀察細(xì)胞狀態(tài)。酒精擦拭瓶身及瓶口后放入培養(yǎng)箱內(nèi)。
[0014]3、細(xì)胞消化:將細(xì)胞培養(yǎng)瓶抒緊蓋子后從培養(yǎng)箱中拿出,觀察瓶內(nèi)培養(yǎng)基的顏色及是否渾濁,于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況。用酒精棉將培養(yǎng)瓶擦拭后放入超凈工作臺,取下蓋子,倒掉培養(yǎng)基。用加樣器吸取2 mL PBS打入培養(yǎng)瓶內(nèi),蓋上蓋子后,晃動幾次后,倒掉PBS,重復(fù)此操作一次。用移液槍吸取1 mL胰酶,注入培養(yǎng)瓶內(nèi),旋緊蓋子,平放培養(yǎng)瓶使胰酶均能浸潤培養(yǎng)面。于倒置顯微鏡下觀察,細(xì)胞變成單個(gè)圓形,則需要終止胰酶的消化。酒精棉擦拭后放入超凈工作臺,移液管吸取1 mL新鮮培養(yǎng)基打入培養(yǎng)瓶中,用移液槍吸取培養(yǎng)瓶內(nèi)液體吹打培養(yǎng)瓶的細(xì)胞培養(yǎng)面,液體變成渾濁狀態(tài)。將該消化后液體移入10 mL試管中,旋緊蓋子,1000 rpm離心4 min,棄去上清液。用移液槍吸取2 mL PBS注入試管中,1000 rpm離心4 min,棄去上清液。
[0015]4、細(xì)胞傳代:將消化好的細(xì)胞用移液槍注入2 mL新鮮培養(yǎng)基,并吹打分散后,分別吸取1 mL液體移入已裝有7 mL新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中,旋緊蓋子,放入C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0016]5、細(xì)胞計(jì)數(shù):將上述消化好的細(xì)胞,用移液槍注入4 mL新鮮培養(yǎng)基,并吹打分散,吸取細(xì)胞懸液少許,滴加在蓋玻片邊緣,使懸液充滿蓋玻片和計(jì)數(shù)板之間。靜置幾分鐘后,于倒置顯微鏡下觀察,計(jì)數(shù)細(xì)胞板中四個(gè)大格細(xì)胞總數(shù)。
[0017]計(jì)數(shù)原則:以細(xì)胞格線為準(zhǔn)。記上不記下,計(jì)左不計(jì)右。
[0018]計(jì)算公式:細(xì)胞數(shù)/mL=四大格細(xì)胞總數(shù)/4 X 104個(gè)。
[0019]6、MTT測定法:實(shí)驗(yàn)前先將96孔板于超凈工作臺中,紫外燈照射3h。將上述已經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)的細(xì)胞懸液,加入一定的培養(yǎng)基稀釋,調(diào)整細(xì)胞濃度為5000個(gè)/100 μ Lo用移液槍吸取200 uL的細(xì)胞懸液于96孔板的孔中,其中96孔板的四周不加,只加中間的6行10列,共60個(gè)孔。96孔板的四周加入PBS緩沖液,防止邊緣效應(yīng)。蓋上蓋子,并記錄日期和時(shí)間,酒精噴板后,放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0020]培養(yǎng)12 h后于倒置顯微鏡下觀察,細(xì)胞貼壁后,酒精噴板,放入超凈工作臺中,用200 移液槍將孔內(nèi)的培養(yǎng)基吸出,加入不同濃度的含藥物的培養(yǎng)基培養(yǎng),每孔200 ^Lo蓋上蓋子,于倒置顯微鏡下觀察,酒精噴板,放入培養(yǎng)箱中。
[0021]培養(yǎng)24、48 h、60或72小時(shí)后于超凈工作臺中每孔加入10 MTT,蓋上蓋子,酒精噴板后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4 h后用移液槍吸出孔內(nèi)液體,每孔加入150 uL DMS0,振搖均勻后,放入酶標(biāo)儀中,570 nm下讀數(shù)。
[0022]7、計(jì)算公式:腫瘤細(xì)胞生長抑制率% = (0D對照-0D樣品)/0D對照X 100 %
8、實(shí)驗(yàn)?zāi)P驮O(shè)置:實(shí)驗(yàn)組:將試驗(yàn)藥物用DMS0溶解,然后用培養(yǎng)基稀釋使DMS0最終濃度為0.5%。每個(gè)單體化合物設(shè)三個(gè)劑量組,每個(gè)計(jì)量樣品做3個(gè)孔的平行實(shí)驗(yàn)??瞻讓?shí)驗(yàn)組:只含有培養(yǎng)基,每塊96孔板中留有3個(gè)孔的平行實(shí)驗(yàn)。陽性對照組:含有一定濃度陽性藥物5-氟尿嘧啶(5-FU)的培養(yǎng)基,每塊96孔板中有3個(gè)孔的平行實(shí)驗(yàn)。陰性對照組:含有0.5%DMS0的培養(yǎng)基,每個(gè)樣品做3個(gè)孔的平行實(shí)驗(yàn)。
【具體實(shí)施方式】
[0023]下面結(jié)合實(shí)施例,對本發(fā)明進(jìn)一步進(jìn)行描述,但其不代表為本發(fā)明的唯一實(shí)施方式。
[0024]實(shí)施例1:經(jīng)過復(fù)蘇的U2-0S型骨肉瘤細(xì)胞株,在培養(yǎng)過程中,根據(jù)需要進(jìn)行細(xì)胞換液,在細(xì)胞貼壁生長面積達(dá)到細(xì)胞瓶底部的80%后,倒掉培養(yǎng)基,用加樣器吸取2 mL PBS打入培養(yǎng)瓶內(nèi),蓋上蓋子后,晃動幾次后,倒掉PBS,重復(fù)此操作一次。用移液槍吸取1 mL胰酶,注入培養(yǎng)瓶內(nèi),旋緊蓋子,平放培養(yǎng)瓶使胰酶均能浸潤培養(yǎng)面。于倒置顯微鏡下觀察,細(xì)胞變成單個(gè)圓形,則需要終止胰酶的消化。酒精棉擦拭后放入超凈工作臺,移液管吸取1mL新鮮培養(yǎng)基打入培養(yǎng)瓶中,用移液槍吸取培養(yǎng)瓶內(nèi)液體吹打培養(yǎng)瓶的細(xì)胞培養(yǎng)面,液體變成渾濁狀態(tài)。將該消化后液體移入10 mL試管中,旋緊蓋子,1000 rpm離心4 min,棄去上清液。用移液槍吸取2 mL PBS注入試管中,1000 rpm離心4 min,棄去上清液,進(jìn)行細(xì)胞傳代,將消化好的細(xì)胞用移液槍注入2 mL新鮮培養(yǎng)基,并吹打分散后,分別吸取1 mL液體移入已裝有7 mL新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中,旋緊蓋子,放入0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。經(jīng)傳代后的細(xì)胞,倒掉培養(yǎng)基,用加樣器吸取2 mL PBS打入培養(yǎng)瓶內(nèi),蓋上蓋子后,晃動幾次后,倒掉PBS,重復(fù)此操作一次。用移液槍吸取1 mL胰酶,注入培養(yǎng)瓶內(nèi),旋緊蓋子,平放培養(yǎng)瓶使胰酶均能浸潤培養(yǎng)面。于倒置顯微鏡下觀察,細(xì)胞變成單個(gè)圓形,則需要終止胰酶的消化。酒精棉擦拭后放入超凈工作臺,移液管吸取1 mL新鮮培養(yǎng)基打入培養(yǎng)瓶中,用移液槍吸取培養(yǎng)瓶內(nèi)液體吹打培養(yǎng)瓶的細(xì)胞培養(yǎng)面,液體變成渾濁狀態(tài)。將上述消化好的細(xì)胞,用新鮮培養(yǎng)基稀釋,并吹打分散,吸取細(xì)胞懸液少許,滴加在蓋玻片邊緣,使懸液充滿蓋玻片和計(jì)數(shù)板之間。靜置幾分鐘后,于倒置顯微鏡下觀察,計(jì)數(shù)細(xì)胞板中四個(gè)大格細(xì)胞總數(shù)。調(diào)整細(xì)胞濃度為5000個(gè)/100 μ L。用移液槍吸取200 的細(xì)胞懸液于96孔板的孔中,其中96孔板的四周不加,只加中間的6行10列,共60個(gè)孔。96孔板的四周加入PBS緩沖液,防止邊緣效應(yīng)。蓋上蓋子,并記錄日期和時(shí)間,酒精噴板后,放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)12 h后于倒置顯微鏡下觀察,細(xì)胞貼壁后,酒精噴板,放入超凈工作臺中,用200 移液槍將孔內(nèi)的培養(yǎng)基吸出,加入100 Mg.mL \20 Mg.mL \4 μ g.mL 1的含藥物的培養(yǎng)基培養(yǎng),每孔200^Lo蓋上蓋子,于倒置顯微鏡下觀察,酒精噴板,放入培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)24h后于超凈工作臺中每孔加入10 uL MTT,蓋上蓋子,酒精噴板后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4 h后用移液槍吸出孔內(nèi)液體,每孔加入150 Ml DM