沒食子酸乙酯在治療骨肉瘤方面的新用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種沒食子酸乙酯的藥物應(yīng)用，尤其是在治療U2-0S型骨肉瘤作用的藥物的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]骨肉瘤(Osteosarcoma)是起源于骨骼的惡性腫瘤，其發(fā)病率在原發(fā)性骨惡性腫瘤中占居首位。骨肉瘤患者中75%為青少年，男性患者是女性患者的1.5倍，其惡性程度甚高，容易發(fā)生早期肺轉(zhuǎn)移，預(yù)后極差，既往一經(jīng)發(fā)現(xiàn)多采取截肢手術(shù)治療，即便如此，患者術(shù)后5年存活率也僅為5-20%，這為患者及其家庭帶來極大的精神傷害，也為社會乃至國家都帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前保肢手術(shù)輔以大劑量化療逐步成為骨肉瘤的首選治療方案，但仍有20-40%患者死于轉(zhuǎn)移。
[0003]在前期研究中，我們從二色補(bǔ)血草中分離得到了沒食子酸乙酯，其又稱3，4，5-三羥基苯甲酸乙酯，英文名稱是Ethyl gallate，除了存在于二色補(bǔ)血草中，很多植物如狼毒大戟，赤芍，翻白草，亮葉圍涎樹，美麗芍藥，南天竹種子，芡實(shí)，中華補(bǔ)血草，澤漆，窄葉芍藥以及雞尾木等植物中也發(fā)現(xiàn)了其的存在。它不僅以天然產(chǎn)物形式存在于多種植物中，也可以方便的被合成。
[0004]沒食子酸乙酯除了用作油脂的抗氧化劑、食品添加劑及某些藥品的中間體，還發(fā)現(xiàn)對小鼠腎上腺嗜鉻瘤細(xì)胞株P(guān)C12有一定的抑制作用，對結(jié)腸癌L0V0細(xì)胞、肺癌A549細(xì)胞、口腔鱗癌CAL-27細(xì)胞的生長均具有一定的抑制作用，體外可顯著抑制人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲、運(yùn)動以及黏附能力，對過氧化氫造模的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y的氧化損傷模型，具有一定的保護(hù)作用。
[0005]盡管沒食子酸乙酯的作用陸續(xù)被研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)，但其在治療骨肉瘤，特別是U2-0S型骨肉瘤方面的研究仍未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明旨在提供一種沒食子酸乙酯的新的藥物應(yīng)用用途，尤其是在治療U2-0S型骨肉瘤作用的藥物的用途。
[0007]本發(fā)明中所用PBS緩沖液配制方法如下:8 gNaCl,0.2 gKCl，1.44 gNa2HP04，0.20gKH2P04，加超純水至1000 mL，調(diào)節(jié)PH7.2-7.4，高壓高溫(121 °C )滅菌20min，4°C冷藏備用。
[0008]本發(fā)明中所用胰酶配制方法如下:稱取胰蛋白酶粉0.50 g和EDTA 1 g，溶于200mL PBS緩沖液中。低溫下攪拌4 h，充分溶解后，調(diào)整PH 7.2-7.4。0.22 μ m濾膜過濾除菌，用15 mL試管分裝，-20°C凍存?zhèn)溆谩?br>[0009]本發(fā)明中所用RPMI1640培養(yǎng)基配制方法如下:將RPMI Medium 1640固體粉末培養(yǎng)基6.75 g溶于500 mL超純水中，加入32.5 mg青霉素、50 mg鏈霉素、1 g NaHC03，充分溶解；0.22 μπι濾膜過濾除菌，在超凈工作臺內(nèi)向100mL瓶分裝，每瓶85 mL，4°C冷藏備用。使用時(shí)每瓶加入10 mL馬血清、5 mL胎牛血清，配置成15%培養(yǎng)基。
[0010]本發(fā)明中所用MTT配制方法如下:稱取20 mg MTT于5 mL試管中，加入4 mL PBS緩沖液，使用渦旋儀使其完全溶解，即成5 mg/mL MTT液；用0.22 Mm微孔濾器除菌后_20°C冷凍保存。
[0011]本發(fā)明中所用酸液配制方法如下:稱取120 g重鉻酸鉀加入1000 mL超純水中，加熱輔助使其完全溶解；將該溶解液緩慢加入200 mL濃硫酸中，并不斷攪拌，至其冷卻。
[0012]本發(fā)明的步驟如下:
1、細(xì)胞株復(fù)蘇:在敞口瓶中加入蒸餾水，放入38°C恒溫水槽中，待其溫度恒定后將凍存于-198°C液氮中的細(xì)胞取出，快速放入敞口瓶中，晃動，使凍存管內(nèi)液體于1-2 min內(nèi)溶化。用酒精棉擦拭凍存管，放入工作臺內(nèi)，將細(xì)胞液吸入15 mL試管內(nèi)，同時(shí)加入10 mL該細(xì)胞株的新鮮培養(yǎng)基，1000 rpm離心4 min。棄去上清液，移液槍注入1 mL新鮮培養(yǎng)基吹打分散后，注入已裝有7 mL新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶內(nèi)，輕旋蓋子，于0)2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
[0013]2、細(xì)胞換液:將細(xì)胞培養(yǎng)瓶抒緊蓋子后從培養(yǎng)箱中拿出，觀察瓶內(nèi)培養(yǎng)基的顏色及是否渾濁，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況。用酒精棉將培養(yǎng)瓶擦拭后放入超凈工作臺，取下蓋子，倒掉培養(yǎng)基。用移液槍吸取2 mL PBS打入培養(yǎng)瓶內(nèi)，蓋上蓋子后，晃動幾次，倒掉PBS，重復(fù)此操作一次。用移液槍吸取8 mL新鮮培養(yǎng)基注入培養(yǎng)瓶內(nèi)，蓋上蓋子，觀察細(xì)胞狀態(tài)。酒精擦拭瓶身及瓶口后放入培養(yǎng)箱內(nèi)。
[0014]3、細(xì)胞消化:將細(xì)胞培養(yǎng)瓶抒緊蓋子后從培養(yǎng)箱中拿出，觀察瓶內(nèi)培養(yǎng)基的顏色及是否渾濁，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況。用酒精棉將培養(yǎng)瓶擦拭后放入超凈工作臺，取下蓋子，倒掉培養(yǎng)基。用加樣器吸取2 mL PBS打入培養(yǎng)瓶內(nèi)，蓋上蓋子后，晃動幾次后，倒掉PBS，重復(fù)此操作一次。用移液槍吸取1 mL胰酶，注入培養(yǎng)瓶內(nèi)，旋緊蓋子，平放培養(yǎng)瓶使胰酶均能浸潤培養(yǎng)面。于倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞變成單個(gè)圓形，則需要終止胰酶的消化。酒精棉擦拭后放入超凈工作臺，移液管吸取1 mL新鮮培養(yǎng)基打入培養(yǎng)瓶中，用移液槍吸取培養(yǎng)瓶內(nèi)液體吹打培養(yǎng)瓶的細(xì)胞培養(yǎng)面，液體變成渾濁狀態(tài)。將該消化后液體移入10 mL試管中，旋緊蓋子，1000 rpm離心4 min，棄去上清液。用移液槍吸取2 mL PBS注入試管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液。
[0015]4、細(xì)胞傳代:將消化好的細(xì)胞用移液槍注入2 mL新鮮培養(yǎng)基，并吹打分散后，分別吸取1 mL液體移入已裝有7 mL新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，旋緊蓋子，放入C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0016]5、細(xì)胞計(jì)數(shù):將上述消化好的細(xì)胞，用移液槍注入4 mL新鮮培養(yǎng)基，并吹打分散，吸取細(xì)胞懸液少許，滴加在蓋玻片邊緣，使懸液充滿蓋玻片和計(jì)數(shù)板之間。靜置幾分鐘后，于倒置顯微鏡下觀察，計(jì)數(shù)細(xì)胞板中四個(gè)大格細(xì)胞總數(shù)。
[0017]計(jì)數(shù)原則:以細(xì)胞格線為準(zhǔn)。記上不記下，計(jì)左不計(jì)右。
[0018]計(jì)算公式:細(xì)胞數(shù)/mL=四大格細(xì)胞總數(shù)/4 X 104個(gè)。
[0019]6、MTT測定法:實(shí)驗(yàn)前先將96孔板于超凈工作臺中，紫外燈照射3h。將上述已經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)的細(xì)胞懸液，加入一定的培養(yǎng)基稀釋，調(diào)整細(xì)胞濃度為5000個(gè)/100 μ Lo用移液槍吸取200 uL的細(xì)胞懸液于96孔板的孔中，其中96孔板的四周不加，只加中間的6行10列，共60個(gè)孔。96孔板的四周加入PBS緩沖液，防止邊緣效應(yīng)。蓋上蓋子，并記錄日期和時(shí)間，酒精噴板后，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0020]培養(yǎng)12 h后于倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞貼壁后，酒精噴板，放入超凈工作臺中，用200 移液槍將孔內(nèi)的培養(yǎng)基吸出，加入不同濃度的含藥物的培養(yǎng)基培養(yǎng)，每孔200 ^Lo蓋上蓋子，于倒置顯微鏡下觀察，酒精噴板，放入培養(yǎng)箱中。
[0021]培養(yǎng)24、48 h、60或72小時(shí)后于超凈工作臺中每孔加入10 MTT，蓋上蓋子，酒精噴板后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4 h后用移液槍吸出孔內(nèi)液體，每孔加入150 uL DMS0，振搖均勻后，放入酶標(biāo)儀中，570 nm下讀數(shù)。
[0022]7、計(jì)算公式:腫瘤細(xì)胞生長抑制率％ = (0D對照-0D樣品)/0D對照X 100 %
8、實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ驮O(shè)置:實(shí)驗(yàn)組:將試驗(yàn)藥物用DMS0溶解，然后用培養(yǎng)基稀釋使DMS0最終濃度為0.5%。每個(gè)單體化合物設(shè)三個(gè)劑量組，每個(gè)計(jì)量樣品做3個(gè)孔的平行實(shí)驗(yàn)?？瞻讓?shí)驗(yàn)組:只含有培養(yǎng)基，每塊96孔板中留有3個(gè)孔的平行實(shí)驗(yàn)。陽性對照組:含有一定濃度陽性藥物5-氟尿嘧啶(5-FU)的培養(yǎng)基，每塊96孔板中有3個(gè)孔的平行實(shí)驗(yàn)。陰性對照組:含有0.5%DMS0的培養(yǎng)基，每個(gè)樣品做3個(gè)孔的平行實(shí)驗(yàn)。
【具體實(shí)施方式】
[0023]下面結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)一步進(jìn)行描述，但其不代表為本發(fā)明的唯一實(shí)施方式。
[0024]實(shí)施例1:經(jīng)過復(fù)蘇的U2-0S型骨肉瘤細(xì)胞株，在培養(yǎng)過程中，根據(jù)需要進(jìn)行細(xì)胞換液，在細(xì)胞貼壁生長面積達(dá)到細(xì)胞瓶底部的80%后，倒掉培養(yǎng)基，用加樣器吸取2 mL PBS打入培養(yǎng)瓶內(nèi)，蓋上蓋子后，晃動幾次后，倒掉PBS，重復(fù)此操作一次。用移液槍吸取1 mL胰酶，注入培養(yǎng)瓶內(nèi)，旋緊蓋子，平放培養(yǎng)瓶使胰酶均能浸潤培養(yǎng)面。于倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞變成單個(gè)圓形，則需要終止胰酶的消化。酒精棉擦拭后放入超凈工作臺，移液管吸取1mL新鮮培養(yǎng)基打入培養(yǎng)瓶中，用移液槍吸取培養(yǎng)瓶內(nèi)液體吹打培養(yǎng)瓶的細(xì)胞培養(yǎng)面，液體變成渾濁狀態(tài)。將該消化后液體移入10 mL試管中，旋緊蓋子，1000 rpm離心4 min，棄去上清液。用移液槍吸取2 mL PBS注入試管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，進(jìn)行細(xì)胞傳代，將消化好的細(xì)胞用移液槍注入2 mL新鮮培養(yǎng)基，并吹打分散后，分別吸取1 mL液體移入已裝有7 mL新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，旋緊蓋子，放入0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。經(jīng)傳代后的細(xì)胞，倒掉培養(yǎng)基，用加樣器吸取2 mL PBS打入培養(yǎng)瓶內(nèi)，蓋上蓋子后，晃動幾次后，倒掉PBS，重復(fù)此操作一次。用移液槍吸取1 mL胰酶，注入培養(yǎng)瓶內(nèi)，旋緊蓋子，平放培養(yǎng)瓶使胰酶均能浸潤培養(yǎng)面。于倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞變成單個(gè)圓形，則需要終止胰酶的消化。酒精棉擦拭后放入超凈工作臺，移液管吸取1 mL新鮮培養(yǎng)基打入培養(yǎng)瓶中，用移液槍吸取培養(yǎng)瓶內(nèi)液體吹打培養(yǎng)瓶的細(xì)胞培養(yǎng)面，液體變成渾濁狀態(tài)。將上述消化好的細(xì)胞，用新鮮培養(yǎng)基稀釋，并吹打分散，吸取細(xì)胞懸液少許，滴加在蓋玻片邊緣，使懸液充滿蓋玻片和計(jì)數(shù)板之間。靜置幾分鐘后，于倒置顯微鏡下觀察，計(jì)數(shù)細(xì)胞板中四個(gè)大格細(xì)胞總數(shù)。調(diào)整細(xì)胞濃度為5000個(gè)/100 μ L。用移液槍吸取200 的細(xì)胞懸液于96孔板的孔中，其中96孔板的四周不加，只加中間的6行10列，共60個(gè)孔。96孔板的四周加入PBS緩沖液，防止邊緣效應(yīng)。蓋上蓋子，并記錄日期和時(shí)間，酒精噴板后，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)12 h后于倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞貼壁后，酒精噴板，放入超凈工作臺中，用200 移液槍將孔內(nèi)的培養(yǎng)基吸出，加入100 Mg.mL \20 Mg.mL \4 μ g.mL 1的含藥物的培養(yǎng)基培養(yǎng)，每孔200^Lo蓋上蓋子，于倒置顯微鏡下觀察，酒精噴板，放入培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)24h后于超凈工作臺中每孔加入10 uL MTT，蓋上蓋子，酒精噴板后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4 h后用移液槍吸出孔內(nèi)液體，每孔加入150 Ml DM