專利名稱：白及乙酸乙酯提取物的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及白及乙酸乙酯提取物的新用途。
背景技術(shù)：
感染類疾病,一直被視為極其兇險的疾病,直至Alexander Fleming于1928年偶然發(fā)現(xiàn)青霉素并用于臨床后，人類與感染性疾病的斗爭才有了一個重大突破。然而隨著抗生素的廣泛使用，濫用抗生素的危害遠遠超出人們的想象英國的Jevons就首次發(fā)現(xiàn)了耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)，MRSA從發(fā)現(xiàn)至今感染幾乎遍及全球，已成為院內(nèi)感染的重要病原菌之一。研究發(fā)現(xiàn)，MRSA除對甲氧西林耐藥外，對其它所有與甲氧西林相同結(jié)構(gòu)的內(nèi)酰胺類和頭孢類抗生素均耐藥，MRSA還可通過改變抗生素作用靶位，產(chǎn)生修飾酶，降低膜通透性產(chǎn)生大量PABA等不同機制，對氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、氟喹喏 酮類、磺胺類、利福平均產(chǎn)生不同程度的耐藥，即具有廣譜耐藥性，而萬古霉素成為了攻克MRSA感染的最后一道防線。由此可見，細菌耐藥性產(chǎn)生的速度遠遠超出了新藥研發(fā)的速度，如果繼續(xù)發(fā)展，終有一天會因為耐藥性而導(dǎo)致現(xiàn)有所有抗生素無效，人們生病可能“無藥可救”由此進入后抗生素時代。正當人類面對耐藥菌和機體耐藥性迅速發(fā)展的嚴峻現(xiàn)實而焦頭爛額之時，中醫(yī)藥作為新的抗菌藥物脫穎而出，以其抗菌性強、毒副作用小而受到廣大患者的青睞。白及，又名甘根、白友、白根等，為蘭科植物白及Bletilla striata (Thunb.)Reichb. f.的干燥塊莖，主產(chǎn)于浙江、貴州、湖北、四川、湖南、河南、陜西等地。含有聯(lián)芐類、二氫菲類、聯(lián)菲類、芘類等化合物。中醫(yī)認為，其性澀而收，能入肺止血，生肌治瘡。研究表明，白及具有止血、抗癌、保護胃粘膜、代血漿、促進角質(zhì)細胞游走的形成、促進血管內(nèi)皮細胞黏附生長、抗?jié)儭㈩A(yù)防腸粘連、促進傷口愈合、免疫促進等藥理作用。臨床可用于上呼吸道等出血、褥瘡、燒燙傷、腫瘤、肺結(jié)核、痤瘡、百日咳等的治療。經(jīng)文獻檢索發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)藥理研究主要集中在白及止血等效用上，抑菌活性的研究國內(nèi)鮮有報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供白及乙酸乙酯提取物的新用途。本發(fā)明提供了白及乙酸乙酯提取物在制備抗菌藥物中的用途。進一步地,所述藥物是抗臨床耐藥菌的藥物。更進一步地，所述臨床耐藥菌為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌。進一步地，所述藥物是抗革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌的藥物。更進一步地，所述革蘭氏陰性菌為支氣管文血鮑特菌、卡他莫拉菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌或大腸埃希菌；所述革蘭氏陽性菌為金黃色葡萄球菌、巨型球菌、腐生葡萄球菌、糞腸球菌或表皮葡萄球菌。其中，所述藥物是治療細菌感染性疾病的藥物。
其中，所述白及乙酸乙酯提取物是由如下方法制備的取白及，乙醇提?。淮继嵋夯厥找掖己蟮慕?，再按系統(tǒng)溶劑法提取，取乙酸乙酯部分，即得白及乙酸乙酯提取物。進一步地，所述乙醇濃度為80 95%V/V。進一步地，所述系統(tǒng)溶劑法中，依次用石油醚、乙酸乙酯進行提取。其中，所述藥物是以白及乙酸乙酯提取物為活性成分制備而成的口服劑、注射劑或外用制劑。白及乙酸乙酯提取物對各種革蘭氏陰性菌、陽性菌以及耐藥菌均有良好的抑制作用，能夠有效保護細菌感染個體，其藥效活性與抗生素相當，尤其是該提取物還可以有效對抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，為臨床用藥提供了更好的選擇。
具體實施例方式本發(fā)明所述的白及乙酸乙酯提取物，按照中藥化學領(lǐng)域中常規(guī)的系統(tǒng)溶劑法提取即可，具體操作可以參見下述實施例制備方法。除此之外，也可以直接按照現(xiàn)有文獻報道的方法進行提取，如陸波等，白及不同提取部位對家兔血小板聚集的影響，解放軍藥學學報，2005年5期。實施例1白及乙酸乙酯提取物的制備方法稱取白及藥材250g，粉碎，加95%v/v乙醇加熱回流提取兩次，第一次10倍量，第二次8倍量，每次各I小時。將兩次提取液合并，過濾，濾液減壓回收溶劑，得粗浸膏31g。取粗浸膏，加水約250ml，超聲混懸，轉(zhuǎn)移至IOOOml分液漏斗中，加石油醚萃取8次，每次300ml，余下的水層再用乙酸乙酯萃取10次，每次250ml，減壓回收乙酸乙酯，得乙酸乙酯提取物8g。實施例2白及乙酸乙酯提取物的制備方法稱取白及藥材500g，粉碎，加80%v/v乙醇加熱回流提取兩次，第一次10倍量，第二次8倍量，每次各I小時。將兩次提取液合并，過濾，濾液減壓回收溶劑，得粗浸膏。取粗浸膏，干燥后，加石油醚振搖提取5次，余下的水層再用乙酸乙酯振搖提取5次，合并乙酸乙酯部位，減壓回收乙酸乙酯，得乙酸乙酯提取物。實施例3白及乙酸乙酯提取物的制備方法稱取白及藥材100g，粉碎，加90%v/v乙醇加熱回流提取兩次，第一次12倍量，第二次10倍量，每次各I小時。將兩次提取液合并，過濾，濾液減壓回收溶劑，得粗浸膏。取粗浸膏，干燥后，加石油醚溫浸3次，余下的水層再用乙酸乙酯溫浸5次，合并乙酸乙酯部位，減壓回收乙酸乙酯，得乙酸乙酯提取物。以下通過試驗例說明本發(fā)明的有益效果。試驗例I抗菌試驗I材料與儀器1.1藥物及制備供試藥物，白及，購自北京同仁堂成都分店，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學鑒定教研室馬云桐老師鑒定為蘭科植物白及Bletilla striata(Thund. ) Reichb. f.的干燥塊莖。白及的四個活性部位分別采取以下方法制備。陽性藥物，注射用鹽酸萬古霉素，規(guī)格50萬單位，浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠，批號111204;注射用頭孢噻肟鈉，規(guī)格1. 0g，華北制藥河北華民藥業(yè)有限責任公司，批號XF3120707 ;頭孢克肟片，規(guī)格O. 2g/片，浙江海正藥業(yè)有限公司，批號120501。造模藥物Mucinform Porcine Stomach (Type II ),規(guī)格IOOg, SIGMA-ALDRICH,批號018Κ0079ο1.1.1乙酸乙酯部位的提取方法稱取白及藥材250g，粉碎，加95%v/v乙醇加熱回流提取兩次，第一次10倍量，第二次8倍量，每次各I小時。將兩次提取液合并，過濾，濾液減壓回收溶劑，得粗浸膏31g。剩余藥渣備用。取粗浸膏，加水約250ml，超聲混懸，轉(zhuǎn)移至IOOOrnl分液漏斗中，加石油醚萃取8次，每次300ml，減壓回收石油醚。水層再用乙酸乙酯萃取10次，每次250ml，減壓回收乙酸乙酯，得乙酸乙酯部位Sg (即本發(fā)明白及乙酸乙酯提取物)。剩余水層備用。 1.1. 2醇提后水煎液部位取“1.1.1”中剩余的藥渣，加8倍量的水(約2000ml)煎煮I小時，用紗布過濾，濾液加熱至60°C，減壓濃縮，得醇提后水煎液部位95g。1.1. 3正丁醇部位的提取方法取“1.1.1”中剩余的水層，加入正丁醇萃取10次，每次250ml，減壓回收正丁醇，得正丁醇部位提取物7g。剩余水層備用。1.1. 4萃取后水部位取“1.1. 3”中剩余的水層液，加熱至60°C，減壓濃縮，得萃取后水部位提取物12g。1. 2 菌株1. 2.1標準菌株大腸埃希菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC25923 (四川抗菌素工業(yè)研究所贈送)。1. 2. 2受試菌株經(jīng)VITEK-32、VITEK-60自動微生物鑒定分析儀進行鑒定，再經(jīng)Biolog細菌鑒定儀(美國)及API20E、20NE、Staph系列和常規(guī)方法重新鑒定的10個種屬的22株臨床分離病原菌。1. 3 儀器及試劑 Mueller-Hinton agar (0X0ID,批號729683)，營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(杭州微生物試劑有限公司，批號=20100831-02)，一次性無菌培養(yǎng)皿(江蘇康健生物有限公司)，Mcfarland Standard (bioMerieux, Inc.批號821772701)等。2 方法2.1體外抑菌活性試驗采用瓊脂平板二倍稀釋法分別測定白及乙酸乙酯部位、醇提后水煎液部位、萃取后水部位和正丁醇部位對11個種屬26株病原菌和標準菌株的體外抑菌活性。2.1.1含藥平板制備4個不同部位分別用蒸餾水或DMSO稀釋液進行倍比稀釋，分別稀釋成 1:1、1 : 2、1 4、1 8、1 16、1 32、1 64、1 128，I 256 共 9 個梯度。在一次性無菌培養(yǎng)皿中分別加入上述不同濃度梯度的稀釋藥液Iml和14ml滅菌的MH培養(yǎng)基，充分混勻，晾干備用。2.1. 2菌液配置將受試菌株和藥敏質(zhì)控菌株用無菌生理鹽水調(diào)至菌液濃度1.5X106CFU/ml。2.1. 3最低抑菌濃度測定采用多點接種儀將實驗菌株的菌液加入不同濃度梯度的含藥平板和陽性對照平板，并以生理鹽水代替菌液作陰性對照。37°C恒溫培養(yǎng)18 24h，觀察各菌株在含不同濃度梯度藥物平板中的生長情況。在陰、陽性對照均成立的情況下，以培養(yǎng)皿中無細菌生長的最小質(zhì)量濃度為試驗部位對該菌的最低抑菌質(zhì)量濃度(MIC)。
2. 2體內(nèi)抗菌活性試驗2. 2.1 預(yù)試驗實驗菌株毒力的測定37°C恒溫培養(yǎng)受試耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌至對數(shù)生長期，用生理鹽水稀釋成不同濃度梯度的菌液。取不同濃度的菌液與10%胃膜素等量混合，按O. 5ml/20g的菌液量腹腔注射小鼠，并以5%胃膜素做對照。在對照小鼠不死亡的前提下，記錄小鼠14d內(nèi)的死亡率，測定小鼠全部死亡的最低細菌量，即該菌液的最小致死量(MLD)。體內(nèi)有效劑量的預(yù)試設(shè)置多個不同劑量組對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌所引起的感染模型小鼠進行腹腔注射，每組4只，I次/d，并提前2天給藥，在第3天 給藥后O. 5h攻毒，觀察動物14d內(nèi)的死亡情況，確定正式試驗給藥劑量。2. 2. 2體內(nèi)抗菌活性取18 22g SPF級KM小鼠，雌雄各半，每組10只，分為注射用鹽酸萬古霉素組，注射用頭孢噻肟鈉組，頭孢克肟片組，白及1、0. 5,0. 25,0. 125g/kg組，生理鹽水空白組，模型組，胃膜素對照組。均提前2天給藥，I次/d，在第3天給藥后O. 5h攻毒，即選取含5%胃膜素的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌菌液腹腔注射。其中以生理鹽水代替藥物為模型組；以既不給藥也不攻毒為空白組；以不給藥只注射不含細菌的5%胃膜素為胃膜素對照組。觀察小鼠攻毒后14d內(nèi)的存活情況，統(tǒng)計其存活率。3 結(jié)果3.1白及不同活性部位的體外抗菌活性采用瓊脂平板二倍稀釋法測定了白及4個部位對26株臨床分離病原菌和標準菌株的MIC，結(jié)果見表I。表1:白及4個部位對受試菌株的體外抑菌活性
權(quán)利要求
1.白及乙酸乙酯提取物在制備抗菌藥物中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述藥物是抗臨床耐藥菌的藥物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于所述臨床耐藥菌為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用途，其特征在于所述藥物是抗革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌的藥物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于所述革蘭氏陰性菌為支氣管文血鮑特菌、卡他莫拉菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌或大腸埃希菌；所述革蘭氏陽性菌為金黃色葡萄球菌、巨型球菌、腐生葡萄球菌、糞腸球菌或表皮葡萄球菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任意一項所述的用途，其特征在于所述藥物是治療細菌感染性疾病的藥物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述白及乙酸乙酯提取物是由如下方法制備的 取白及，乙醇提??；醇提液回收乙醇后的浸膏，再按系統(tǒng)溶劑法提取，取乙酸乙酯部分，即得白及乙酸乙酯提取物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于所述乙醇濃度為8(T95%V/V。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于所述系統(tǒng)溶劑法中，依次用石油醚、乙酸乙酯進行提取。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9任意一項所述的用途，其特征在于所述藥物是以白及乙酸乙酯提取物為活性成分制備而成的口服劑、注射劑或外用制劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了白及乙酸乙酯提取物在制備抗菌藥物中的用途。白及乙酸乙酯提取物對各種革蘭氏陰性菌、陽性菌以及耐藥菌均有良好的抑制作用，能夠有效保護細菌感染個體，其藥效活性與抗生素相當，尤其是該提取物還可以有效對抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，為臨床用藥提供了更好的選擇。
文檔編號A61K36/898GK102988765SQ20121059032
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月31日
發(fā)明者彭成, 萬峰, 彭芙, 熊亮, 曹小玉 申請人:成都中醫(yī)藥大學, 四川大學