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一種疫苗組合物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法

文檔序號:823612閱讀:222來源:國知局
專利名稱:一種疫苗組合物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種預(yù)防和治療豬瘟、豬藍耳病的疫苗組合物。
背景技術(shù)
豬痕(classicalswine fever, CSF)是由豬痕病毒(classical swine fevervirus, CSFV)引起的一種嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的毀滅性傳染病。該病死亡率高達 80-90%,世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為OIE疾病名錄,我國也將其列為一類傳染病。豬瘟的防制歷來是全世界豬瘟存在國非常重視的課題,為此各國都投入了大量的人力、物力。 目前疫苗接種仍是控制豬瘟的重要手段。我國生產(chǎn)的豬瘟兔化弱毒疫苗有脾淋苗、乳兔組織苗、牛睪丸原代細(xì)胞苗及最近兩年發(fā)展起來的豬睪丸傳代細(xì)胞苗,疫苗免疫仍是我國防控豬瘟的基本手段。
豬繁殖與呼吸綜合征(又稱豬藍耳)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起的以母豬發(fā)熱、流產(chǎn),斷奶前后的仔豬死亡率升高,不同年齡豬呼吸障礙等為臨床特征的疾病。目前,該病是嚴(yán)重影響世界養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重要疾病之一。疫苗接種是預(yù)防該病最有效的方法,國內(nèi)外已有商品化的豬繁殖與呼吸綜合征疫苗。既有滅活疫苗,也有用弱毒株制備的活疫苗。由于豬場的區(qū)域性及流行病學(xué)特征不同,有的豬場免疫經(jīng)典藍耳病的弱毒苗,有的免疫高致病性藍耳病的弱毒苗,臨床上給藍耳病的免疫帶來了很多困擾。
豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)是一種正鏈RNA病毒,目前已發(fā)現(xiàn)兩種基因型 歐洲型和美洲型,目前兩種基因型在我國均有檢出。PRRSV基因組大小約15kb,有多個開放閱讀框,其中第一個開放閱讀框(ORFla和ORFlb)含有PRRSV基因組的80%的序列,其編碼有關(guān)RNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的蛋白,包括RNA依賴性RNA聚合酶。(Straw et al,Diseases of Swine, 9th edition, chapter 24(2006))。ORFla 和 ORFlb 被翻譯成一個多聚蛋白 (poly-protein),該多聚蛋白被其中含有的蛋白酶活性區(qū)域切割成多個非結(jié)構(gòu)蛋白,包括 Nspl_Nspl2(見,Vries et al, Seminarsin Virology,8 :33-47(1997) ;Allende et al, Journal of General Virology, 80 :307-315 (1999))。根據(jù)對國內(nèi)高致病性藍耳病毒株的遺傳變異分析,高致病性毒株是目前優(yōu)勢流行毒株,且變異較快。高致病性豬藍耳病為一類動物疫病,是目前嚴(yán)重危害中國養(yǎng)豬業(yè)的一類疫病,表現(xiàn)為對呼吸系統(tǒng)、繁殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、消化系統(tǒng)均有強的致病力。病毒毒力極強,豬感染高致病性豬藍耳病病毒可以產(chǎn)生高水平的病毒血癥,高致病性豬藍耳病對豬場造成的經(jīng)濟損失極大,有很多豬場因為該病遭到毀滅性打擊,高致病性豬藍耳病病毒已是我國現(xiàn)階段藍耳病流行的主導(dǎo)毒株這一事實已毋庸置疑。
PRRSV變異株各毒株0RF5基因氨基酸同源性為96% -100%,且NsP2基因都有30 個氨基酸的缺失,現(xiàn)有技術(shù)的毒株NVDC-JXA1-R,并作為預(yù)防高致病性藍耳病疫情政府招標(biāo)用疫苗株,在控制高致病性藍耳病疫情中起到重要作用。隨后又有兩株高致病性藍耳病變異株TJ M-F92株和HuN4-F112株活疫苗上市,上述毒種的效力和免疫效果上基本一致。
經(jīng)典株藍耳病毒株大多為美洲分離株,經(jīng)典藍耳病為二類動物疫病,表現(xiàn)為對仔豬呼吸系統(tǒng)和母豬繁殖系統(tǒng)有較強的致病力,病毒傳播能力較強,經(jīng)典藍耳病病毒的復(fù)制能力要比高致病性藍耳病病毒低10000倍以上,豬群一旦感染高致病性豬藍耳病病毒,經(jīng)典的藍耳病病毒就很難在豬體內(nèi)檢測到。目前主要有豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗R98株、 豬藍耳病ATCCVR-2332株、豬藍耳病CH-1R株。
目前,PRRS活疫苗使用的弱毒株均為人工馴化毒株,均經(jīng)過傳代致弱而成為無毒力,且有良好的免疫原性的弱毒疫苗株,PRRSV變異株各毒株之間的同源性很高。通過對全國各地分離的PRRSV變異株進行完整的0RF5和部分Nsp2基因序列比較分析發(fā)現(xiàn),來自不同豬場的PRRSV高度同源,新分離毒株的GP5基因相互之間也是高度同源,同源性達到 98. 5—100% (參見CN 101280292A說明書第9頁2. 2. 7序列分析)。目前,普遍使用的 PRRSV活疫苗使用的變異株毒株有NVDC-JXAl-R株、TJM-F92株和HuM-Fl 12株,雖然不同毒株在毒力和生物學(xué)特征等方面存在差異,但其免疫原性相似,因為PRRS活疫苗變異毒株之間高度同源,具有免疫原性的蛋白均存在。因此,使用不同變異毒株的活疫苗,均可取得很好的免疫效果。
藍耳病弱毒疫苗株除了變異株還有經(jīng)典毒株,目前應(yīng)用的疫苗毒株有豬繁殖與呼吸綜合征R98株、ATCCVR-2332株、CH-1R株,經(jīng)典毒株之間的同源性很高,其交叉保護性也很好,均能夠很好地抵抗經(jīng)典毒株強毒的攻擊。各毒株制備的疫苗對經(jīng)典藍耳病強毒株均有良好的免疫保護性。
豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株和經(jīng)典毒株之間的同源性僅為69. 8-86. 2%,到目前為止也有經(jīng)典毒株制備的疫苗可以保護高致病性藍耳病毒的攻擊的成功例子,但普遍認(rèn)為,經(jīng)典毒株對防控高致病性藍耳病的效果遠不如變異株的弱毒株疫苗的效果好。如果飼養(yǎng)管理水平較好,且飼養(yǎng)范圍內(nèi)未發(fā)生病藍耳病流行的,經(jīng)典株與變異株制備的疫苗也會有一定的交叉保護性。
這兩種豬的傳染病對養(yǎng)豬的危害非常嚴(yán)重,目前免疫接種仍是我國防制豬瘟、豬藍耳病的重要措施。并且有文獻表明豬藍耳病疫苗與豬瘟疫苗同 時免疫會使疫苗的效力顯著降低(湖北畜牧獸醫(yī),2009年第7期,豬藍耳病免疫對豬瘟免疫效果影響的試驗),也有文獻表明兩種抗原同時免疫基本上無免疫抑制,其所指“基本上無免疫抑制”是指不會顯著削弱對方的免疫效果(CN102727883A豬繁殖與呼吸綜合征與豬瘟二聯(lián)苗及其用途)。但在臨床免疫程序中,這兩種疫苗一般要間隔七天以上才能免疫另外一種疫苗,這也從側(cè)面說明了在現(xiàn)有條件下,這兩種疫苗同時免疫會發(fā)生干擾現(xiàn)象。但是由于兩種疫苗的免疫時間比較接近,在臨床應(yīng)用上,多針次、多劑量、多種免疫程序難以合理安排,既繁瑣、費時、費力、增加成本,且容易造成漏種,直接影響免疫效果。
杜喜忠等(“豬藍耳病免疫對豬瘟免疫效果影響的試驗”,《湖北畜牧獸醫(yī)》,2009 年第7期,第21頁,郵發(fā)代號38-352)公開了豬藍耳病弱毒苗與豬瘟活疫苗同時免疫會對豬瘟免疫產(chǎn)生一定的影響,導(dǎo)致豬瘟活疫苗抗體滴度會降低1-2個滴度。發(fā)明內(nèi)容
為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足,本發(fā)明目的在于提供一種治療和預(yù)防豬瘟、豬藍耳病的疫苗組合物,,解決現(xiàn)有疫苗同時免疫時會產(chǎn)生干擾的問題,提供了該疫苗組合物中兩類抗原的最佳配比。
本發(fā)明的主要目的在于提供一種疫苗組合物,所述疫苗組合物包括豬瘟病毒抗原和豬藍耳病病毒抗原,其中,所述豬瘟病毒為豬瘟兔弱毒化株,所述豬藍耳病抗原為高致病性豬藍耳病病毒,所述豬藍耳病抗原與豬瘟病毒抗原含量比例為100 1—100 10。
優(yōu)選地,所述豬藍耳病抗原與豬瘟病毒抗原含量比例為100 3—100 10。
優(yōu)選地,所述豬藍耳病抗原包括HuM-Fl 12株、附00及41_1 株、1'廁492株活的病毒。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種疫苗組合物,所述疫苗組合物包括豬瘟病毒抗原和豬藍耳病抗原,其中,所述豬瘟病毒為豬瘟兔弱毒化株,所述豬藍耳病抗原為經(jīng)典豬藍耳病病毒,所述豬藍耳病抗原與豬瘟病毒抗原含量比例為100 1-1000 I。
優(yōu)選地,所述豬藍耳病抗原與豬瘟病毒抗原含量比例為100 1-300 I。
優(yōu)選地,所述豬藍耳病抗原包括ATCCVR-2332株、CH-1R株、R98株活的病毒。
本發(fā)明的再一目的在于提供一種制備所述疫苗組合物的方法,所述制備方法包括
培養(yǎng)增殖豬瘟病毒,制備所述豬瘟病毒抗原;
培養(yǎng)增殖豬藍耳病病毒,制備所述豬藍耳病病毒抗原;
按照所述豬藍耳病抗原與豬瘟病毒抗原含量比例100 1-100 10進行配比, 制備所述疫苗組合物。
本發(fā)明的又一目的在于提供一種制備所述疫苗組合物的方法,所述制備方法包括
培養(yǎng)增殖豬瘟病毒,制備所述豬瘟病毒抗原;
培養(yǎng)增殖豬藍耳病病毒,制備所述豬藍耳病病毒抗原;
按照所述豬藍耳病抗原與豬瘟病毒抗原含量比例100 1-1000 I進行配比,制備所述疫苗組合物。
本發(fā)明的還一目的·在于提供所述疫苗組合物在制備預(yù)防和治療豬瘟和豬藍耳病藥物的應(yīng)用。
本發(fā)明通過調(diào)整兩種抗原之間的配比關(guān)系,找出了可以完全消除兩種抗原之間干擾作用的最佳抗原配比,真正做到了消除兩種抗原之間的免疫干擾作用,達到一針預(yù)防兩種傳染病的目的。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明,本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述更為清楚。但這些實施例僅是范例性的,并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是,在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進行修改或替換,但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
本發(fā)明實施例1 6中以豬高致病性藍耳病HuN4-F112毒株、JXAl-R毒株、 TJM-F92毒株為例說明豬瘟、藍耳病全病毒抗原配比關(guān)系對免疫效果影響;實施例7 10 中以豬藍耳病經(jīng)典毒株CH-1R、R98株為例說明豬瘟、藍耳病全病毒抗原配比關(guān)系對免疫效果影響。下列實施例中未提及的具體實驗方法,通常按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的實驗方法進行。
實施例1豬瘟病毒抗原液的制備
1.將長成良好單層的對豬瘟病毒(豬瘟兔化弱毒株由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所保藏, 保藏號AV1412)高敏感的ST細(xì)胞(購自ATCC)用含O. 125%胰酶和O. 03% EDTA的消化液, 進行消化分散,細(xì)胞計數(shù)后以合適的密度接種細(xì)胞培養(yǎng)瓶,加入1. 5-5% FBS的MEM細(xì)胞培養(yǎng)液,同時按照M. O.1. = O. 01-0. 6接毒劑量加入種毒,進一步優(yōu)選接毒劑量為M. O.1.= O. 1-0. 6,進一步優(yōu)選接毒劑量為M. O.1. = O. 2-0. 4,置于34_37°C溫箱中進行培養(yǎng),進一步優(yōu)選培養(yǎng)溫度為34-35 °C。
2.培養(yǎng)三天后進行第一次收毒,收毒后補加1. 5-3% FBS的細(xì)胞維持液,以后每隔 2天收毒一次,可連續(xù)收毒5次。收毒后將抗原混合置于-20°C儲藏。
3.將5次收獲的病毒液混合取樣后進行TCID5tl和RID測定,抗原液病毒含量 106_ 5TCID5ciAil (免疫熒光法),兔體感染劑量應(yīng)不低于500,000RID/ml (兔體反應(yīng)熱法),同時按照中國獸藥典2010年版“豬瘟活疫苗”檢驗標(biāo)準(zhǔn)進行檢測,符合規(guī)定。
實施例2豬藍耳病高致病性變異株抗原的制備方法
1.制苗用細(xì)胞的傳代與培養(yǎng)將Marc 145或MA104細(xì)胞系經(jīng)EDTA-胰酶消化液分散傳代,以細(xì)胞生長液繼續(xù)培養(yǎng),形成致密單層時,備用,用于繼續(xù)傳代或接種病毒。
2.細(xì)胞毒種的繁殖將藍耳病HUN4-F112毒株(市售)病毒液,按M.O.1.= O. 001-0. 01的劑量接入已經(jīng)生長成良好細(xì)胞單層的細(xì)胞瓶,進一步優(yōu)選接毒劑量為 M. O.1. = O. 005-0. 01,吸附I小時后,加入細(xì)胞維持液于細(xì)胞系單層,繼續(xù)培養(yǎng),當(dāng)70-80% 細(xì)胞出現(xiàn)病變后收獲,收獲的毒液凍融1-2次后置-20°C以下保存,取少量做半成品檢驗, 抗原液病毒含量106_ 5TCID5cZml,按照國家標(biāo)準(zhǔn)檢驗均符合規(guī)定。
將藍耳病JXAl-R毒株(市售)病毒液,按M. O.1. = O. 001-0. 01的劑量接入已經(jīng)生長成良好細(xì)胞單層的細(xì)胞瓶,進一步優(yōu)選接毒劑量為M. O.1. = O. 005-0. 01,吸附I小時后,加入細(xì)胞維持液于細(xì)胞系單層,繼續(xù)培養(yǎng),當(dāng)70-80%細(xì)胞出現(xiàn)病變后收獲,收獲的毒液凍融1-2次后置_20°C以下保存,取少量做半成品檢驗,抗原液病毒含量107_°TCID5(l/ml,按照國家標(biāo)準(zhǔn)檢驗均符合規(guī)定。
將藍耳病TJM-F92毒株(市售)病毒液,按M. O.1. = O. 001-0. 01的劑量接入已經(jīng)生長成良好細(xì)胞單層的細(xì)胞瓶,進一步優(yōu)選接毒劑量為M. O.1. = O. 005-0. 01,吸附I小時后,加入細(xì)胞維持液于細(xì)胞系單層,繼續(xù)培養(yǎng),當(dāng)70-80%細(xì)胞出現(xiàn)病變后收獲,收獲的毒液凍融1-2次后置_20°C以下保存,取少量做半成品檢驗,抗原液病毒含量106_5TCID5cZml, 按照國家標(biāo)準(zhǔn)檢驗均符合規(guī)定。
實施例3豬瘟、豬高致病性藍耳病(HuM-Fl 12、JXA1-R、TJM-F92)抗原與豬瘟病毒抗原不同配比后制備成二聯(lián)疫苗組合物
將實施列I制 備好的豬瘟病毒抗原(病毒含量106_5TCID5(l/ml),實施例2制備好的三種豬藍耳病病毒抗原分別按照表I的抗原含量進行配比,然后與等量的凍干保護劑混合,制成豬藍耳病、豬瘟二聯(lián)活疫苗疫苗組合物,具體情況見表I。
表I豬藍耳病抗原、豬瘟抗原的不同配比及分組
權(quán)利要求
1.一種疫苗組合物,所述疫苗組合物包括豬瘟病毒抗原和豬藍耳病抗原,其中,所述豬瘟病毒為豬瘟兔弱毒化株,所述豬藍耳病抗原為高致病性豬藍耳病病毒,所述豬藍耳病抗原與豬瘟病毒抗原含量比例為100 1—100 10。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗組合物,其中,所述豬藍耳病抗原與豬瘟病毒抗原含量比例為 100 3—100 10。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗組合物,其中,所述豬藍耳病抗原包括HUN4-F112株、NVDC-JXA1-R 株、TJM-F92 株活的病毒。
4.一種疫苗組合物,所述疫苗組合物包括豬瘟病毒抗原和豬藍耳病抗原,其中,所述豬瘟病毒為豬瘟兔弱毒化株,所述豬藍耳病抗原為經(jīng)典豬藍耳病病毒,所述豬藍耳病抗原與豬瘟病毒抗原含量比例為100 1-1000 I。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的疫苗組合物,其中,所述豬藍耳病抗原與豬瘟病毒抗原含量比例為 100 1-300 I。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的疫苗組合物,其中,所述豬藍耳病抗原包括ATCCVR-2332株、CH-1R株、R98株活的病毒。
7.一種制備權(quán)利要求1所述疫苗組合物的方法,所述制備方法包括 培養(yǎng)增殖豬瘟病毒,制備所述豬瘟病毒抗原; 培養(yǎng)增殖豬藍耳病病毒,制備所述豬藍耳病病毒抗原; 按照所述豬藍耳病抗原與豬瘟病毒抗原含量比例100 1--100 10進行配比,制備所述疫苗組合物。
8.一種制備權(quán)利要求4所述疫苗組合物的方法,所述制備方法包括 培養(yǎng)增殖豬瘟病毒,制備所述豬瘟病毒抗原; 培養(yǎng)增殖豬藍耳病病毒,制備所述豬藍耳病病毒抗原; 按照所述豬藍耳病抗原與豬瘟病毒抗原含量比例100 1-1000 I進行配比,制備所述疫苗組合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求1 3所述的疫苗組合物在制備預(yù)防和治療豬瘟和豬藍耳病藥物的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求4 6所述的疫苗組合物在制備預(yù)防和治療豬瘟和豬藍耳病藥物的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種疫苗組合物,該疫苗組合物包括豬瘟病毒抗原和豬藍耳病抗原,其中,該豬瘟病毒為豬瘟兔弱毒化株,該豬藍耳病抗原為高致病性豬藍耳病病毒,該豬藍耳病抗原與豬瘟病毒抗原含量比例為100∶1—100∶10,該疫苗組合物可以消除兩種抗原之間的干擾作用,達到一針預(yù)防兩種傳染病的目的,大大減少了免疫次數(shù)及動物應(yīng)激反應(yīng)。
文檔編號A61P31/14GK103041384SQ20121059033
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月29日
發(fā)明者張許科, 孫進忠, 白朝勇 申請人:普萊柯生物工程股份有限公司
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