一種富含兒茶素的金花茶愈傷組織的獲取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種富含兒茶素的金花茶愈傷組織的獲取方法。
【背景技術(shù)】
[0002]金花茶是一種富含次生代謝物質(zhì)的藥用木本花卉，其中，兒茶素是一類具有抗氧化、抗炎與抑制克氏錐蟲生長(zhǎng)等作用的酚類物質(zhì)。目前對(duì)于金花茶兒茶素等藥用物質(zhì)的開發(fā)主要集中在活體植物上，其開發(fā)過程對(duì)外界環(huán)境要求較高且會(huì)對(duì)作為國(guó)家一級(jí)保護(hù)植物的金花茶的生存造成影響。
[0003]組織培養(yǎng)技術(shù)以離體材料作為初始材料，對(duì)初始材料的量要求較小，對(duì)活體植物幾乎無影響，且更容易應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)。因此，利用組織培養(yǎng)技術(shù)，以離體材料進(jìn)行大規(guī)模兒茶素生產(chǎn)極為重要。遺憾的是，迄今為止尚無此類報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種富含兒茶素的金花茶愈傷組織的獲取方法，其以金花茶幼嫩莖段為材料、以植物組織培養(yǎng)為基礎(chǔ)進(jìn)行金花茶愈傷組織的培養(yǎng)，所獲得的愈傷組織中兒茶素種類豐富且含量高，可應(yīng)用于離體生產(chǎn)金花茶兒茶素。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
一種富含兒茶素的金花茶愈傷組織的獲取方法，其包括金花茶體細(xì)胞胚培養(yǎng)、金花茶愈傷組織誘導(dǎo)、金花茶愈傷組織增殖培養(yǎng)3個(gè)步驟，具體操作如下:
1)金花茶體細(xì)胞胚的培養(yǎng):以金花茶成年植株的幼嫩莖段為材料，以MS+2.0mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂為誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)體細(xì)胞胚，80 d后將誘導(dǎo)出來的體細(xì)胞胚接種到MS+20 g/L山梨醇+40 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂的培養(yǎng)基上，于25±2 °C、12h光照+12 h黑暗條件下以周期為30 d進(jìn)行繼代培養(yǎng)；
2)金花茶愈傷組織的誘導(dǎo):以MS+0.5 mg/L KT+8.0 mg/L NAA+5mg/L AgN03+30 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂為組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，將繼代培養(yǎng)的金花茶體細(xì)胞胚切塊，于25±2 °C、黑暗條件下進(jìn)行培養(yǎng)，30d后得到愈傷組織；
3)金花茶愈傷組織的增殖培養(yǎng):以MS+4.0mg/L 6-BA+0.6 mg/L 2，4_D為增殖培養(yǎng)基，以30 d為培養(yǎng)周期，將誘導(dǎo)出的金花茶愈傷組織于25±2 °C、12h光照+12 h黑暗條件下進(jìn)行繼代培養(yǎng)。
[0006]各培養(yǎng)基在高壓滅菌前調(diào)pH值為5.8;所述高壓滅菌的溫度為121°C，滅菌時(shí)間為
20 mino
[0007]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:本發(fā)明以金花茶幼嫩莖段為材料、以植物組織培養(yǎng)為基礎(chǔ)進(jìn)行金花茶愈傷組織的培養(yǎng)，有生長(zhǎng)速度快、條件可控且不依賴于外界環(huán)境等特點(diǎn)，同時(shí)，按本發(fā)明方法進(jìn)行處理，不會(huì)對(duì)金花茶的活體植株造成傷害，且在成功誘導(dǎo)愈傷組織后可進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，具有規(guī)?；?yīng)，所獲得的愈傷組織中兒茶素種類豐富且含量高，可應(yīng)用于離體生產(chǎn)金花茶兒茶素。
【附圖說明】
[0008]圖1為金花茶體細(xì)胞胚的培養(yǎng)情況示意圖。
[0009]圖2為金花茶愈傷組織的誘導(dǎo)情況示意圖。
[0010]圖3為金花茶愈傷組織的增殖情況示意圖。
[0011]圖4為兒茶素類物質(zhì)測(cè)定的高效液相色譜圖，其中(A)為(+ )_兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品，(B)為金花茶愈傷組織干粉提取液。
【具體實(shí)施方式】
[0012]為了使本發(fā)明所述的內(nèi)容更加便于理解，下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明所述的技術(shù)方案做進(jìn)一步的說明，但是本發(fā)明不僅限于此。
[0013]1、金花茶體細(xì)胞胚的培養(yǎng)
在晴天中午取無病、健壯的金花茶成年樹的未木質(zhì)化的幼嫩莖段，先于流水下沖洗30min清除表面灰塵，然后在紫外消毒后的超凈工作臺(tái)上按75%酒精30 s，0.1%升汞3 min，無菌水I次，0.1%升汞9 min，無菌水4次的程序?qū)ν庵搀w進(jìn)行消毒，切除在消毒過程中的裸露傷口；然后將長(zhǎng)約I cm左右的金花茶幼嫩莖段接種到MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+30g/L蔗糖+6 g/L瓊脂的誘導(dǎo)培養(yǎng)上，80 d后將誘導(dǎo)出來的體細(xì)胞胚接種到MS+20 g/L山梨醇+40 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基在高壓滅菌(121 °C,20 min)前調(diào)節(jié)pH值為
5.8，于培養(yǎng)光環(huán)境為:12 h光照+12 h黑暗、培養(yǎng)溫度為25±2 °C的條件下以周期為30 d進(jìn)行繼代培養(yǎng)，得到生長(zhǎng)旺盛的金花茶體細(xì)胞胚(如圖1);
2、金花茶愈傷組織的誘導(dǎo)
在紫外消毒后的超凈工作臺(tái)上將生長(zhǎng)旺盛呈亮黃色的金花茶體細(xì)胞胚切成約0.5 cm3的方塊，并將與培養(yǎng)基接觸的一側(cè)表皮切除，然后接種到MS+ 0.5 mg/L KT+8.0 mg/L NAA+5mg/L AgN03+30 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂的組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基在高壓滅菌(121 °C，20min)前調(diào)節(jié)pH值為5.8，于培養(yǎng)光環(huán)境為黑暗、培養(yǎng)溫度為25±2 °C的條件下培養(yǎng)30d，即可從金花茶體細(xì)胞胚切塊上誘導(dǎo)出愈傷組織(如圖2);
3、金花茶愈傷組織的增殖培養(yǎng)
在紫外消毒后的超凈工作臺(tái)上小心地將誘導(dǎo)出的愈傷組織與體細(xì)胞胚切割分離，切割時(shí)盡量不損傷愈傷組織，以減少損傷引起的褐化，然后將愈傷組織接種到MS+4.0 mg/L 6-BA+0.6 mg/L 2，4-D的增殖培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基在高壓滅菌(121 °C，20 min)前調(diào)節(jié)pH值為5.8，于培養(yǎng)光環(huán)境為:12 h光照+12 h黑暗、培養(yǎng)溫度為25±2 °C的條件下以周期為30d進(jìn)行繼代培養(yǎng)(如圖3)。
[0014]所得愈傷組織增殖系數(shù)(愈傷組織增殖系數(shù)=培養(yǎng)30d后的鮮重/接入的鮮重)可達(dá)3.19?3.55。
[0015]采用香莢蘭素法測(cè)定兒茶素含量，具體是將所得金花茶愈傷組織干燥后磨碎并過20目篩，然后取0.5 g干粉，加95%乙醇20 mL，90°C水浴提取30 min，使乙醇保持微沸;過濾后冷卻，用95%乙醇定容至25 mL;吸取試液320yL，注入盛有700yL 95%乙醇的10 mL離心管中，搖勻，得金花茶愈傷組織干粉提取液;另將于秋季在金花茶成年植株上采摘的葉片按相同方法進(jìn)行處理，得金花茶葉片組織干粉提取液。然后分別在兩個(gè)提取液中加入1%香莢藍(lán)素鹽酸溶液5 mL，蓋上蓋子搖勻顯紅色;放置40分鐘后，以試劑空白作參比，用5 mm比色皿于波長(zhǎng)500 nm處比色測(cè)定吸光度。結(jié)果顯示，金花茶葉片組織干粉提取液中兒茶素的含量?jī)H為4.37-4.53 mg/g(干重)，而金花茶愈傷組織干粉提取液中兒茶素含量為27.25-28.66 mg/g(干重)。
[0016]采用高效液相色譜對(duì)所得金花茶愈傷組織干粉提取液中的兒茶素物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，高效液相條件為:以日立高效液相儀為檢測(cè)儀器，以水:乙腈:甲醇(83:6:11)為流動(dòng)相，流速為1.0 mL/min，以C-18為固定相，柱溫為25°C，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，進(jìn)樣量為40yL，每個(gè)樣品檢測(cè)40 min。結(jié)果如圖4顯示，金花茶愈傷組織干粉提取液中含有(+)-兒茶素且可能含有七種其他類型的兒茶素。
[0017]由此可見，采用本發(fā)明方法所獲得的愈傷組織中兒茶素種類豐富且含量高，可應(yīng)用于離體生產(chǎn)金花茶兒茶素。
[0018]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種富含兒茶素的金花茶愈傷組織的獲取方法，其特征在于:包括金花茶體細(xì)胞胚培養(yǎng)、金花茶愈傷組織誘導(dǎo)、金花茶愈傷組織增殖培養(yǎng)3個(gè)步驟。2.如權(quán)利要求1所述富含兒茶素的金花茶愈傷組織的獲取方法，其特征在于:所述金花茶體細(xì)胞胚培養(yǎng)的方法為:以金花茶成年植株的幼嫩莖段為材料，以MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂為誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)體細(xì)胞胚，80 d后將誘導(dǎo)出來的體細(xì)胞胚接種到MS+20 g/L山梨醇+40 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂的培養(yǎng)基上，于25±2 °C、12h光照+12 h黑暗條件下以周期為30 d進(jìn)行繼代培養(yǎng)。3.如權(quán)利要求1所述富含兒茶素的金花茶愈傷組織的獲取方法，其特征在于:所述金花茶愈傷組織誘導(dǎo)的方法為:以MS+0.5 mg/L KT+8.0 mg/L NAA+5mg/L AgN03+30 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂為組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，將繼代培養(yǎng)的金花茶體細(xì)胞胚切塊，于25 ±2 °C、黑暗條件下進(jìn)行培養(yǎng)，30d后得到愈傷組織。4.如權(quán)利要求1所述富含兒茶素的金花茶愈傷組織的獲取方法，其特征在于:所述金花茶愈傷組織增殖培養(yǎng)的方法為:以MS+4.0 mg/L 6-BA+0.6 mg/L 2，4_D為增殖培養(yǎng)基，以30 d為培養(yǎng)周期，將誘導(dǎo)出的金花茶愈傷組織于25±2 °C、12h光照+12 h黑暗條件下進(jìn)行繼代培養(yǎng)。5.如權(quán)利要求2-4所述富含兒茶素的金花茶愈傷組織的獲取方法，其特征在于:各培養(yǎng)基在高壓滅菌前調(diào)pH值為5.8; 所述高壓滅菌的溫度為121°C，滅菌時(shí)間為20 min。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種富含兒茶素的金花茶愈傷組織的獲取方法，屬于植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，其包括金花茶體細(xì)胞胚培養(yǎng)、金花茶愈傷組織誘導(dǎo)、金花茶愈傷組織增殖培養(yǎng)3個(gè)步驟。本發(fā)明以金花茶幼嫩莖段為材料、以植物組織培養(yǎng)為基礎(chǔ)進(jìn)行金花茶愈傷組織的培養(yǎng)，其具有生長(zhǎng)速度快、條件可控且不依賴于外界環(huán)境等特點(diǎn)，具有規(guī)?；?yīng)，且獲得的愈傷組織中兒茶素種類豐富且含量高，可應(yīng)用于離體生產(chǎn)金花茶兒茶素。
【IPC分類】A01H4/00
【公開號(hào)】CN105532460
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610007591
【發(fā)明人】鐘春水, 賴鐘雄, 程春振, 陳裕坤, 林玉玲, 劉生財(cái), 張梓浩
【申請(qǐng)人】福建農(nóng)林大學(xué)
【公開日】2016年5月4日
【申請(qǐng)日】2016年1月7日