一種高效的粳稻花培方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種高效的粳稻花培方法，屬于農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 水稻花藥培養(yǎng)是用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，把發(fā)育到一定階段的水稻花藥，通過無菌 操作技術(shù)，接種在人工培養(yǎng)基上，改變花藥內(nèi)花粉粒的發(fā)育程序，誘導(dǎo)其分化，并連續(xù)進(jìn)行 有絲分裂，形成細(xì)胞團(tuán)，進(jìn)而形成一團(tuán)無分化的薄壁組織一愈傷組織，進(jìn)而分化成完整的水 稻植株的過程。
[0003] 水稻的體細(xì)胞(二倍體)具有24個(gè)染色體，性細(xì)胞(花粉細(xì)胞和卵細(xì)胞，單倍體)具 有12條染色體。由花粉長成的單倍體水稻植株只有一套染色體，即12條染色體，每一同源染 色體只有一個(gè)成員，因而每一等位基因也只有一個(gè)成員。水稻是自花授粉植物，在高度純合 的情況下不發(fā)生退化現(xiàn)象，因此由單倍體加倍得到的純合的二倍體水稻的生活力是旺盛 的，這保證了水稻單倍體可以培育出豐產(chǎn)的新品種。因此水稻花藥培養(yǎng)育種具有縮短育種 周期，提高選擇效率，加速有效性狀轉(zhuǎn)移等許多優(yōu)點(diǎn)。
[0004] 1964年，印度德里大學(xué)的兩位植物學(xué)家Guha和Maheshwari發(fā)現(xiàn)，他們培養(yǎng)的毛葉 曼陀羅花藥中長出的胚狀體是來源于花粉的單倍體植株。1968年，日本的新關(guān)Niizeki和大 野Oono通過花藥培養(yǎng)得到了單倍體水稻植株，使水稻單倍體育種成為可能。我國也于1970 年以來開展了群眾性的水稻花藥培養(yǎng)和單倍體育種工作。許多科技工作者對花藥培養(yǎng)中小 孢子發(fā)育成可育植株的許多影響因子進(jìn)行了研究，隨著研究的不斷深入，花藥培養(yǎng)技術(shù)逐 步完善，并應(yīng)用于水稻遺傳育種，現(xiàn)在水稻花藥培養(yǎng)已經(jīng)成為當(dāng)今生物技術(shù)育種中較為成 熟、實(shí)用、有效的育種新技術(shù)。
[0005] 我國自1970年開始水稻花培研究以來，經(jīng)歷了啟動(dòng)、調(diào)整、發(fā)展三個(gè)階段，在花培 方法、誘導(dǎo)手段、取材世代及群體規(guī)模等研究上不斷完善、創(chuàng)新，與常規(guī)育種手段和雜交稻 育種手段相結(jié)合，已經(jīng)育出了 40余個(gè)花培品種及恢復(fù)系、不育系等，如1975年首次育成的粳 稻品種單豐1號(hào)、中花系列、龍粳系列、京花系列、閩花系列、寧粳系列、早單7301、晚單7號(hào)、 合單76-085、合江21、浙粳66號(hào)、花寒早、花培528、南抗1號(hào)、朝花矮、協(xié)優(yōu)贛-8等。
[0006] 由于水稻秈粳稻的分化，秈稻花藥培養(yǎng)仍舊非常困難，而粳稻花藥培養(yǎng)得到迅速 的發(fā)展和應(yīng)用。我國粳稻花培經(jīng)歷了 40余年的研究、發(fā)展，已成為一種成熟而實(shí)用的粳稻育 種輔助手段，取得了豐碩成果，它的作用已被人們普遍認(rèn)可。
[0007] 然而，現(xiàn)階段粳稻花培育種在花藥培養(yǎng)方法上仍存在著工作量大、工作效率低的 矛盾，限制了花培技術(shù)在粳稻育種中的更廣泛的應(yīng)用。如何提高工作效率、加快選擇效率、 縮短育種周期、創(chuàng)新種質(zhì)材料、配合其它生物技術(shù)的應(yīng)用，快速獲得純系，充分利用花培技 術(shù)在基礎(chǔ)理論研究和育種應(yīng)用研究的雄厚基礎(chǔ)，成為我們迫切需要解決的問題。多年的實(shí) 踐經(jīng)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，花培工作效率低的最重要的原因是花培操作方法的局限性。剪穎抖藥法是目 前花藥分離最普遍的操作方法，然而，剪穎和抖藥過程既需要專業(yè)組培操作，又需要消耗大 量的勞動(dòng)，成為花培操作的限速步驟。如何快捷分離水稻花藥，并且保證分離后粳稻水稻花 藥維持活力且無污染適宜離體培養(yǎng)，是解決花培操作低效的關(guān)鍵。
[0008] 離心機(jī)是利用離心力，分離液體與固體顆粒或液體與液體的混合物中各組分的機(jī) 械。離心機(jī)主要用于將懸浮液中的固體顆粒與液體分開，或?qū)⑷闈嵋褐袃煞N密度不同又互 不相溶的液體分開。利用不同密度或粒度的固體顆粒在液體中沉降速度不同的特點(diǎn)，有的 沉降離心機(jī)還可對固體顆粒按密度或粒度進(jìn)行分級。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有粳稻花藥離體培養(yǎng)操作方法的專業(yè)操作要求高且耗時(shí) 耗力的缺陷，提供一種提高操作量、工作效率高的高效的粳稻花培方法。
[0010] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案解決的： 一種高效的粳稻花培方法，其特征在于:所述花培方法的步驟如下： (1) 取粳稻穗并低溫預(yù)處理； (2) 對預(yù)處理后的粳稻稻穗進(jìn)行滅菌； (3) 在無菌條件下將粳稻稻穗進(jìn)行機(jī)械分割，切碎的稻穗倒入離心管中密封后置于搖 床上震蕩； (4) 將初步震蕩后的離心管放入高速冷凍離心機(jī)中，離心獲得離體粳稻花藥； (5) 對離體粳稻花藥進(jìn)行接種和誘導(dǎo)培養(yǎng)出粳稻花藥愈傷組織； (6) 分化、繼代與移栽，完成該粳稻花培過程。
[0011] 所述花培方法的詳細(xì)步驟如下： (1) 取粳稻穗并低溫預(yù)處理： 取穗時(shí)間一般選擇晴天上午9:00-11:00,取材后，用75%乙醇表面消毒，然后用濕潤的 紗布包裹粳稻稻穗，保持稻穗濕潤，最后放到冰箱中，在4°C下低溫預(yù)處理2-8天； (2) 對預(yù)處理后的粳稻稻穗進(jìn)行滅菌： 預(yù)處理后，剪下稻苞，將稻苞浸泡于75%的酒精中處理3~5min，然后將該稻苞轉(zhuǎn)移于超 凈工作臺(tái)中剝離稻穗，用消毒過的紗布包裹稻穗后用濃度為0.1%的升汞滅菌并間或搖動(dòng)， 無菌水漂洗3~4次； (3) 在無菌條件下將粳稻稻穗進(jìn)行機(jī)械分割，切碎的稻穗倒入離心管中密封后置于搖 床上震蕩： 在無菌條件下將粳稻稻穗進(jìn)行機(jī)械分割，將20-30g切碎的稻穗倒入含有60-80ml 18% 蔗糖溶液的100毫升離心管中，蓋上離心管蓋并用保鮮膜將離心管蓋頭位置緊緊封閉，從超 凈工作臺(tái)中取出離心管，置于搖床上300-400rpm震蕩5-10min; (4) 將初步震蕩后的離心管放入高速冷凍離心機(jī)中，離心獲得離體粳稻花藥： 將離心管放入高速冷凍離心機(jī)中離心，完成后然后輕輕取出離心管，可發(fā)現(xiàn)破碎的粳 稻穎殼和支梗沉降到離心管底部，將離心管輕輕放回超凈工作臺(tái)中，無菌操作，輕輕撕開保 鮮膜，打開離心管蓋，將上層分離的粳稻花藥倒入盛有已滅菌的蔗糖溶液容器； (5) 對離體粳稻花藥進(jìn)行接種和誘導(dǎo)培養(yǎng)出粳稻花藥愈傷組織： 用滅菌過的合適孔徑的網(wǎng)篩勺攪動(dòng)蔗糖溶液，使粳稻花藥均勻分散，然后S出，使得花 藥均勻分散到網(wǎng)篩勺上，控出液滴，將花藥磕到裝有粳稻花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶內(nèi)，26-28°C暗培養(yǎng)，誘導(dǎo)粳稻愈傷組織； (6)分化、繼代與移栽，完成該粳稻花培過程： 待粳稻花藥愈傷組織直徑達(dá)到1.5cm后，轉(zhuǎn)接于粳稻花藥分化培養(yǎng)基上光培養(yǎng)，分化出 花培幼苗，待花培苗苗高達(dá)到3cm后轉(zhuǎn)接于生根培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)，待花培苗長至8cm后 移栽至周轉(zhuǎn)箱壯苗，10~15天后移栽入大田。
[0012] 所述步驟（1)中的取穗以粳稻劍葉葉枕距為5~8cm、稻穗中部花藥位置占穎殼的 1/3~1/2為標(biāo)準(zhǔn)取穗。
[0013] 所述步驟(2)中的稻苞是指稻苞頂枕距為7cm至穗下節(jié)間上部0.5cm的區(qū)域內(nèi)剪材 獲得的部分。
[0014] 所述步驟(2 )中的0.1%的升汞滅菌時(shí)間為10-12min。
[0015] 所述步驟(3)中的稻穗進(jìn)行機(jī)械分割的距離是2.0-2.5mm/段。
[0016] 所述步驟(4)中的離心機(jī)參數(shù)設(shè)置為：離心轉(zhuǎn)速9000-10000rpm，離心時(shí)間5-8分 鐘，離心溫度10-20°C。
[0017] 所述步驟(4)中的蔗糖溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%。
[0018] 所述步驟(5)中的合適孔徑的網(wǎng)篩勺的孔徑為50-70目。
[0019] 所述步驟(6)中的光培養(yǎng)的條件為:溫度27~29°C，光照強(qiáng)度1500-20001x、光周期 膚暗脫
[0020] 本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)有如下優(yōu)點(diǎn)： 本發(fā)明通過創(chuàng)造性地對粳稻花藥采取機(jī)械切割的方式進(jìn)行破碎，然后根據(jù)具體需要采 用不同大小的離心力對碎片進(jìn)行分離，成功提取到了純凈的粳稻花藥，并通過優(yōu)化離心介 質(zhì)和采用無菌操作，成功獲取到了活力旺盛的粳稻花藥并進(jìn)一步花培成功，獲得了健壯的 花培苗;提高操作量的同時(shí)大大提升了粳稻花培工作效率。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0022] 本發(fā)明提供的高效的粳稻花培方法的詳細(xì)技術(shù)方案為： (1) 取粳稻穗并低溫預(yù)處理 以粳稻劍葉葉枕距為5~8cm、稻穗中部花藥位置占穎殼的1/3~1/2為標(biāo)準(zhǔn)取穗，取穗 時(shí)間一般選擇晴天上午9:00-11:00;取材后，用75%乙醇表面消毒，然后塑料薄膜包住整個(gè) 稻穗，扎緊塑料袋口，保持稻穗濕潤，最后放到冰箱中，在4°C下低溫預(yù)處理2-8天； (2) 對預(yù)處理后的粳稻稻穗進(jìn)行滅菌 預(yù)處理后剪下頂枕距為7cm至穗下節(jié)間上部0.5cm的區(qū)域內(nèi)剪材獲得的粳稻稻苞，將稻 苞浸泡于70%的酒精中處理3~5min，然后將該稻苞轉(zhuǎn)移于超凈工作臺(tái)中剝離稻穗，用消毒 過的紗布包裹稻穗后用濃度為0.1%的升汞滅菌l〇-12min并間或搖動(dòng)，無菌水漂洗3~4次； (3) 在無菌條件下將粳稻稻穗進(jìn)行機(jī)械分割，切碎的稻