本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域的基因編輯技術(shù)，確切地說是一種基于維吉尼亞鏈霉菌IBL14基因cas7-5-3的基因編輯方法。

背景技術(shù)：

維吉尼亞鏈霉菌IBL14(Streptomyces virginiae IBL14)是我們從甾體藥物生產(chǎn)廠家附近的污泥中分離篩選到的一株放線菌，它能夠有效的轉(zhuǎn)化和降解孕酮，黃酮，皮質(zhì)醇和膽固醇等多種甾體類化合物_ENREF_1（Wang, F.-Q.; Zhang, C.-G.; Li, B.; Wei, D.-Z.; Tong, W.-Y., New microbiological transformations of steroids by Streptomyces virginiae IBL-14. Environmental science & technology 2009, 43 (15), 5967-5974）。CRISPR（clustered regμlarly interspaced short palindromic repeat sequences）稱為成簇規(guī)則間隔的短回文重復(fù)序列，最先于20世紀(jì)八十年代發(fā)現(xiàn)于大腸桿菌中_ENREF_1（Ishino, Y.; Shinagawa, H.; Makino, K.; Amemura, M.; Nakata, A., Nucleotide Sequence of the iap Gene, Responsible for Alkaline Phosphatase Isozyme Conversion in Escherichia coli, and Identification of the Gene Product. JOURNAL OF BACTERIOLOGY 1987, 169 (12), 5429-5433）。2002年R．Jansen等詳細(xì)比較分析了原核生物基因組中的這種成簇規(guī)則間隔的短回文重復(fù)序列，發(fā)現(xiàn)了該重復(fù)序列的旁側(cè)經(jīng)常伴隨出現(xiàn)保守的基因序列_ENREF_1（Jansen, R.; Embden, J. D.; Gaastra, W.; Schouls, L. M., Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes. Mol Microbiol 2002, 43 (6), 1565-75），他們將這種獨特的重復(fù)序列命名為 CRISPR，保守基因序列編碼的蛋白質(zhì)稱為Cas附屬蛋白(CRISPR-associated proteins)。目前已發(fā)現(xiàn)CRISPR-Cas系統(tǒng)廣泛分布于原核生物中_ENREF_1（http://crispr.u-psud.fr/），已商業(yè)應(yīng)用于基因編輯的僅為CRISPR-Cas II型系統(tǒng)中的Cas9蛋白。

迄今為止，CRISPR-Cas I型系統(tǒng)雖有諸多發(fā)現(xiàn)，但未見可應(yīng)用于基因編輯的報道。先前，我們應(yīng)用維吉尼亞鏈霉菌IBL14中的type I-B-sv14型CRISPR-Cas 系統(tǒng)結(jié)合一個工程的基因編輯質(zhì)?？蓪S吉尼亞鏈霉菌IBL14自身染色體進(jìn)行基因編輯_ENREF_1（童望宇; 雍德祥; 李雪; 邱彩花一種維吉尼亞鏈霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系統(tǒng)及應(yīng)用其進(jìn)行基因編輯的方法. 2015110028173, 2015），但未能實現(xiàn)對其它生物基因組進(jìn)行基因編輯。本發(fā)明將維吉尼亞鏈霉菌IBL14 type I-B-sv14型CRISPR-Cas 系統(tǒng)中的基因cas7-5-3與質(zhì)粒（plasmid）連接得到一個Cas7-5-3蛋白表達(dá)質(zhì)粒plasmid-cas7-5-3，結(jié)合設(shè)計的基因編輯質(zhì)粒（plasmid-t/gDNA）或其它質(zhì)粒首次實現(xiàn)了在原核生物大腸桿菌與枯草桿菌中的基因編輯。且該Cas7-5-3蛋白（含1323個氨基酸）具有與Cas9蛋白（含1368個氨基酸）相近的分子大小。

雖已發(fā)現(xiàn)大腸桿菌中存在有CRISPR-Cas I型系統(tǒng)_ENREF_1（Semenova, E.; Savitskaya, E.; Musharova, O.; Strotskaya, A.; Vorontsova, D.; Datsenko, K. A.; Logacheva, M. D.; Severinov, K., Highly efficient primed spacer acquisition from targets destroyed by the Escherichia coli type I-E CRISPR-Cas interfering complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2016, 113 (27), 7626-7631），但迄今尚未見有通過大腸桿菌中的CRISPR-Cas I型系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯的報道；特別是枯草桿菌中尚未發(fā)現(xiàn)有CRISPR-Cas 系統(tǒng)_ENREF_1（http://crispr.u-psud.fr/）。本發(fā)明通過敲除大腸桿菌β-半乳糖苷酶基因lacZ和枯草桿菌乳酸脫氫酶基因ldh，從而實現(xiàn)驗證該質(zhì)粒體系的功效之目的。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種類似于CRISPR-Cas II型系統(tǒng)中Cas9蛋白的CRISPR-Cas type I-B-sv14系統(tǒng)Cas7-5-3蛋白表達(dá)質(zhì)粒體系，結(jié)合基因編輯質(zhì)?；蚱渌|(zhì)粒進(jìn)行原核生物的基因編輯。

為達(dá)此目的，本發(fā)明解決其問題所采用的技術(shù)方案是：一種基于維吉尼亞鏈霉菌IBL14基因cas7-5-3的基因編輯方法，其特征在于：維吉尼亞鏈霉菌IBL14中含有3個基因cas7-5-3，其核酸序列如附表1所描述，經(jīng)蛋白表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建（附圖1）、基因編輯質(zhì)粒構(gòu)建（附圖2）和重組子的獲取與檢驗步驟(附圖3)可有效的對原核生物基因組進(jìn)行編輯。

所述的一種基于維吉尼亞鏈霉菌IBL14基因cas7-5-3的基因編輯方法，其特征在于：包括的蛋白表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建、基因編輯質(zhì)粒構(gòu)建和重組子的獲取與檢驗步驟如下：

（1）根據(jù)維吉尼亞鏈霉菌IBL14基因cas7-5-3及相關(guān)信息序列設(shè)計引物（附表2），以維吉尼亞鏈霉菌IBL14基因組為模版，用DNA聚合酶通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增得到cas7-5-3基因，并連接到質(zhì)粒（plasmid）上，得Cas7-5-3蛋白表達(dá)質(zhì)粒plasmid-cas7-5-3；

（2）根據(jù)原核生物靶向基因DNA序列信息設(shè)計引物（附表2），以原核生物基因組為模版，通過PCR反應(yīng)分別擴(kuò)增得到末端帶有限制性內(nèi)切酶識別和切割位點以及overlap PCR互補序列的靶向基因上下同源臂PCR片段，并用overlap PCR將上下同源臂連接得基因編輯模版(template DNA/t-DNA)，同時根據(jù)原核生物靶向基因序列信息設(shè)計并直接合成首尾分別包含乳糖操縱子啟動子和RNA終止子的靶向基因片段(guide-DNA/g-DNA)（附表2），并根據(jù)限制性酶切位點上的粘性末端將基因編輯模版與靶向基因片段連接到質(zhì)粒上得到基因編輯質(zhì)粒(plasmid-t/gDNA)；

（3）制備原核生物細(xì)胞感受態(tài)，并將按步驟（1）得到的蛋白表達(dá)質(zhì)粒plasmid-cas7-5-3和按步驟（2）得到的各種靶向基因編輯質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到目標(biāo)菌感受態(tài)中得到不同的基因編輯后的重組子；對重組子染色體進(jìn)行PCR和基因測序和/或功能分析，以確證編輯后的目的重組子。

所述的一種基于維吉尼亞鏈霉菌IBL14基因cas7-5-3的基因編輯方法，其特征在于：所述原核生物指大腸桿菌、枯草桿菌及其它原核微生物。

所述的一種基于維吉尼亞鏈霉菌IBL14基因cas7-5-3的基因編輯方法，其特征在于：所述的基因編輯指應(yīng)用該蛋白表達(dá)質(zhì)粒結(jié)合基因編輯質(zhì)粒或其它質(zhì)?？蓪υ思?xì)胞的染色體基因進(jìn)行敲除、插入、無痕點突變及任意組合。

有益效果

本發(fā)明是一種基于維吉尼亞鏈霉菌IBL14 的CRISPR-Cas I型系統(tǒng)的cas基因建立的一種新的基因編輯系統(tǒng)，首次實現(xiàn)了CRISPR-Cas I系統(tǒng)對原核生物基因組的基因編輯；為CRISPR-Cas II 型CAS進(jìn)行基因編輯提供了新的補充和選擇。應(yīng)用該系統(tǒng)對大腸桿菌、枯草桿菌等原核生物基因組可方便、快速、有效地進(jìn)行基因編輯。優(yōu)化后的該基因編輯體系可望應(yīng)用于其它生物的基因編輯中去。

附圖說明

圖1為蛋白表達(dá)質(zhì)粒pHT304-cas7-5-3的構(gòu)建。Ori / origin：DNA復(fù)制起始位點；lac promoter / lactose promoter：乳糖操縱子的啟動子，與RNA聚合酶結(jié)合起動DNA轉(zhuǎn)錄；CAP binding site / catabolite activator protein binding site: cAMP受體蛋白結(jié)合位點，促進(jìn)RNA酶轉(zhuǎn)錄活性；AmpR / ampicillin resistance：氨芐青霉素抗性；Erm / erythromycin: 紅霉素

圖2為基因編輯質(zhì)粒的構(gòu)建，（A）基因編輯質(zhì)粒pKC1139-lacZ-t/g-DNA的構(gòu)建，（B）基因編輯質(zhì)粒pKC1139-ldh-t/g-DNA的構(gòu)建。Ori pSG5 / the origin from pSG5: pSG5質(zhì)粒載體上的復(fù)制起始點；oriTRK2 / the origin of conjugal transfer from RK2: RK2質(zhì)粒載體上的結(jié)合轉(zhuǎn)移復(fù)制起始點；lac promoter / lactose promoter: 乳糖操縱子的啟動子；T7 promoter: T7 啟動子，起始DNA轉(zhuǎn)錄；AmpR / ampicillin resistance: 氨芐青霉素抗性；AprR / apramycin resistance: 安普霉素抗性；Cm / Chloramphenicol: 氯霉素

圖3為轉(zhuǎn)化子篩選與驗證結(jié)果。（A）大腸桿菌JM109(DE3)藍(lán)白斑篩選結(jié)果，藍(lán)色表明為原始菌株，白色表明為重組菌株；（B）基因lacZ外部PCR電泳圖，泳道M：5000 bp DNA ladder，泳道1：空白對照，泳道2：質(zhì)粒pHT304-cas7-5-3、pKC1139-lacZ-t/g-DNA和pKD46轉(zhuǎn)化子的lacZ基因PCR，泳道3：野生型EC JM109(DE3)基因組的lacZ基因PCR（泳道2中DNA條帶較泳道3中DNA條帶小表明基因敲除成功）；（C）質(zhì)粒pHT304-cas7-5-3、pKC1139-lacZ-t/g-DNA、pKD46轉(zhuǎn)化子lacZ基因PCR測序結(jié)果圖（測序結(jié)果與表2中設(shè)計的基因序列相一致表明重組子正確）。

具體實施方式

為了更充分理解本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步介紹和說明，旨在更好的解釋本發(fā)明的內(nèi)容，以下實施例不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。此外，在所列實施例中如無特別說明均采用如下材料：

1）菌株與質(zhì)粒

維吉尼亞鏈霉菌Streptomyces virginiae IBL14 /SV IBL14；大腸桿菌Escherichia coli DH5α / EC DH5α；Escherichia coli JM109 / EC JM109；枯草桿菌Bacillus subtilis168 /BS 168，質(zhì)粒pHT304；pKC1139；pKD46。

2）培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基

酵母粉5 g，蛋白胨10 g，NaCl 10 g，加入適量自來水溶解后，定容至1 L，pH調(diào)至7.0~7.2，分裝包扎后, 121 ℃/20 min滅菌。

LB固體培養(yǎng)基

酵母粉5 g，蛋白胨10 g，NaCl 10 g，瓊脂20 g，加入適量自來水溶解后, 定容至1L， pH調(diào)至7.0~7.2，分裝包扎后，121 ℃/20 min滅菌。

Spizizen 基本培養(yǎng)基

10×Spizzen 基本鹽培養(yǎng)基100 mL/L，50%(w/v) 葡萄糖10 mL/L，色氨酸母液（5 mg/m L）10 m L/L，瓊脂1.5%w/v），121 ℃/20 min滅菌。

GM1培養(yǎng)基（5mL）

40%葡萄糖100 μl， 20 mg/mL 酸水解酪素100 μl，50 mg/m L酵母抽提物100 μl，20%(w/w)MgSO4.7H2O 5 μl，10×Spizzen 基本培養(yǎng)基500 μl，水3195 μl，上述物質(zhì)混合前需121 ℃/20 min滅菌。

GM2培養(yǎng)基（5mL）

40%葡萄糖100 μl， 20 mg/mL 酸水解酪素50 μl，20%(w/w)MgSO4.7H2O 40 μl，10×Spizzen 基本培養(yǎng)基500 μl，水3310 μl，上述物質(zhì)混合前需121 ℃/20 min滅菌。

所用試劑均為市售品。

實施例1（三質(zhì)粒一步共轉(zhuǎn)化法敲除EC JM109 lacZ基因）

（1）蛋白表達(dá)質(zhì)粒pHT304-cas7-5-3的構(gòu)建

根據(jù)SV IBL14全基因組測序信息及質(zhì)粒pHT-304序列信息，設(shè)計帶有質(zhì)粒pHT-304互補序列的cas7-5-3基因特異性引物cas-F和cas-R（表2）。提取SV IBL14基因組DNA，使用全式金生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的TransStart FastPfu DNA Polymerase進(jìn)行cas基因PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95℃ 5 min，94℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，2.5 U 生工生物工程（上海）股份有限公司生產(chǎn)的Pfu DNA Polymerase (50 μl 反應(yīng)體系)，30 個循環(huán)，72 ℃ 10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖電泳檢測，試劑盒回收，得到純化的cas全長基因。通過一步法將cas全長基因序列與質(zhì)粒pHT-304連接，得Cas7-5-3蛋白表達(dá)質(zhì)粒pHT304-cas7-5-3。

（2）基因編輯質(zhì)粒pKC1139-lacZ-t-DNA的構(gòu)建

(A) 基因lacZ引物設(shè)計與lacZ全長基因的擴(kuò)增

根據(jù)EC JM109基因組測序信息，設(shè)計基因lacZ特異性引物lacZ-F和lacZ-R（表2）。提取EC JM109基因組DNA，使用Pfu DNA Polymerase進(jìn)行lacZ基因PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，2.5 U Pfu DNA Polymerase (50 μl 反應(yīng)體系)，30 個循環(huán)，72 ℃ 10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖電泳檢測，試劑盒回收，得到純化的lacZ全長基因片段備用。

（B）上、下游同源臂的制備

根據(jù)lacZ基因全序列（表1）設(shè)計lacZ基因上游同源臂引物lacZ-UF和lacZ-UR、下游同源臂引物lacZ-DF和lacZ-DR(表2) （黑體加粗為overlap PCR互補序列），且上同源臂上游引物含HindIII限制性內(nèi)切酶酶切位點，下同源臂下游引物含XbaI限制性內(nèi)切酶酶切位點。以純化的lacZ基因DNA為模板，先分別擴(kuò)增上、下游同源臂，反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，2.5 U Pfu DNA Polymerase (50 μl 反應(yīng)體系)，30 個循環(huán)，72 ℃ 10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖電泳檢測，試劑盒回收，得到純化后的上、下游同源臂DNA 片段備用。

（C）基因編輯模版載體pKC1139-lacZ-t-DNA的構(gòu)建

取上同源臂純化產(chǎn)物與下同源臂純化產(chǎn)物0.5 μl混合作為模板，25 μl反應(yīng)體系進(jìn)行overlap PCR，反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性l min， 58℃退火1 min，72℃延伸30 s，一個循環(huán)后加人引物UF與DR各1μl，繼續(xù)PCR，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72℃延伸1 min 30 s，進(jìn)行30個循環(huán)，72 ℃ 10 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物并純化，得基因編輯模版；將獲得的基因編輯模版通過HindIII限制性內(nèi)切酶酶、XbaI限制性內(nèi)切酶切出粘性末端，然后通過全式金生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的T4連接酶將其連接到pKC1139質(zhì)粒上，得基因編輯模版載體pKC1139-lacZ-t-DNA。

（D）基因編輯質(zhì)粒pKC1139-lacZ-t/g-DNA的構(gòu)建

含乳糖操縱子啟動子及guide DNA-lacZ連接產(chǎn)物的靶向基因片段（表2）由滁州通用生物公司直接合成，首尾分別加上BamHI及EcoRI酶切位點，中間依次是啟動子，重復(fù)序列（repeat），間隔序列（spacer），重復(fù)序列（repeat）及終止子；將合成的靶向基因片段通過BamHI和EcoRI限制性內(nèi)切酶切出粘性末端，然后通過T4連接酶將其連接到得基因編輯模版載體pKC1139-lacZ-t-DNA上得基因編輯質(zhì)粒pKC1139-lacZ-t/g-DNA 。

（3）重組子的獲取與檢驗

（A）EC JM109感受態(tài)一步法制備

在超凈臺中，用已滅過菌的牙簽挑取EC JM109平板上的單克隆于30 ml LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 rpm過夜培養(yǎng)；取過夜培養(yǎng)的菌液100 μl轉(zhuǎn)接至新的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 rpm培養(yǎng)約2 h，至菌液OD600值為0.4~0.6；取1 ml上述菌液至1.5 ml EP管中，4 ℃下5000 rpm×g離心5 min，徹底除盡上清液后，取已經(jīng)在冰上預(yù)冷的SSCS溶液50 μl將菌體沉淀吹打均勻，即得EC JM109的感受態(tài)細(xì)胞，-80 ℃下保存?zhèn)溆茫ù诉^程全程在冰上進(jìn)行）。

（B）質(zhì)粒pKD46，pHT304-cas7-5-3和pKC1139-lacZ-t/g-DNA的共轉(zhuǎn)化

將質(zhì)粒pKD46，pHT304-cas7-5-3和pKC1139-lacZ-t/g-DNA充分混勻后轉(zhuǎn)化到EC JM109感受態(tài)中，在涂有5 μl異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG 200 mg/ml）、40 μl 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷（X-gal 20 mg/ml ）和 20 μl阿拉伯糖(10 mM/L)的安普霉素和氨芐青霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基中30 ℃過夜培養(yǎng)，得轉(zhuǎn)化子。

（C）重組子染色體PCR和基因測序分析

挑取白色單克隆作為模板，再以lacZ基因驗證引物lacZ-F/lacZ-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72℃ 2 min 40 s，2.5 U 生工生物工程（上海）股份有限公司生產(chǎn)的EasyTaq DNA Polymerase (25 μl反應(yīng)體系)，30 個循環(huán)，72 ℃ 10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖電泳檢測，觀察重組子染色體DNA擴(kuò)增條帶減小，并經(jīng)通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司測序證明lacZ基因敲除成功（附圖3）。

實施例2（三質(zhì)粒二步共轉(zhuǎn)化敲除EC JM109 lacZ基因）

（1）蛋白表達(dá)質(zhì)粒pHT304-cas7-5-3的構(gòu)建

同實施例1步驟（1）

（2）基因編輯質(zhì)粒pKC1139-lacZ-t-DNA的構(gòu)建

同實施例1步驟（2）

（3）重組子的獲取與檢驗

（A）質(zhì)粒pHT304-cas7-5-3轉(zhuǎn)化及EC JM109- pHT304-cas7-5-3感受態(tài)制備

將質(zhì)粒pHT304-cas7-5-3轉(zhuǎn)化到EC JM109感受態(tài)中，通過紅霉素抗性篩選轉(zhuǎn)化子，再以該轉(zhuǎn)化子制備感受態(tài)，獲得含有質(zhì)粒pHT304-cas7-5-3的EC JM109- pHT304-cas7-5-3菌株感受態(tài)。感受態(tài)制備方法同實施例1中步驟（3A）。

（B）質(zhì)粒pKD46和pKC1139-lacZ-t/g-DNA的共轉(zhuǎn)化

將質(zhì)粒pKD46和pKC1139-lacZ-t/g-DNA充分混勻后轉(zhuǎn)化到EC JM109- pHT304-cas7-5-3感受態(tài)中，在涂有5 μl IPTG、40 μl X-gal和 20 μl阿拉伯糖的紅霉素、安普霉素和氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基中30 ℃過夜培養(yǎng)，得轉(zhuǎn)化子。

（C）重組子染色體PCR和基因測序分析

挑取白色單克隆作為模板，再以lacZ基因驗證引物lacZ-F/lacZ-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72℃ 2 min 40 s，2.5 UEasyTaq DNA Polymerase (25 μl反應(yīng)體系)，30 個循環(huán)，72 ℃ 10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖電泳檢測，觀察重組子染色體DNA擴(kuò)增條帶大小變化，并經(jīng)基因測序證明lacZ基因敲除成功。

實施例3（二質(zhì)粒一步共轉(zhuǎn)化法敲除EC JM109 lacZ基因）

（1）蛋白表達(dá)質(zhì)粒pHT304-cas7-5-3的構(gòu)建

同實施例1步驟（1）

（2）基因編輯質(zhì)粒pKD46-lacZ-t/g-DNA的構(gòu)建

除將同源臂及guide DNA-lacZ靶基因片段依次連接到質(zhì)粒pKD46上，形成基因編輯質(zhì)粒pKD46-lacZ-t/g-DNA外，其余步驟與實施例1中步驟（2）相同。

（3）重組子的獲取與檢驗

同實施例1步驟（3）

實施例4（BS 168基因ldh的敲除及氯霉素抗性基因的插入）

（1）蛋白表達(dá)質(zhì)粒pHT304-cas7-5-3的構(gòu)建

同實施例1步驟（1）

（2）基因編輯質(zhì)粒pKC1139-ldh-t/g-DNA的構(gòu)建

（A）基因ldh引物設(shè)計與ldh全長基因的擴(kuò)增

設(shè)計基因引物為ldh-F和ldh-R（表2）。以BS168基因組DNA為模版，擴(kuò)增ldh基因片段。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，2.5 U Pfu DNA Polymerase(50 μl 反應(yīng)體系)，30 個循環(huán)，72 ℃ 10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖電泳檢測，試劑盒回收，得到純化的ldh全長基因片段備用。

（B）上、下游同源臂的制備

分別設(shè)計上、下同源臂引物ldh-UF、ldh-UCmR、ldh-UCmF、ldh-CmDR、ldh-CmDF、ldh-DR（表2）。以純化的ldh基因和Cm 基因DNA為模板，先分別擴(kuò)增上、Cm、下游同源臂，反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55℃ 30 s，72 ℃ 1min 20 s，2.5 U Pfu DNA Polymerase(50μl 反應(yīng)體系)，30 個循環(huán)，72 ℃ 10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖電泳檢測，試劑盒回收，得到純化后的上、Cm、下游同源臂DNA 片段備用。

（C）基因編輯模版載體pKC1139-ldh-t-DNA的構(gòu)建

取上同源臂純化產(chǎn)物、cm純化產(chǎn)物及下同源臂純化產(chǎn)物1.0 μl混合作為模板，25 μl反應(yīng)體系進(jìn)行overlap PCR，反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性l min， 55 ℃退火1 min， 72 ℃延伸30 s，一個循環(huán)后加人引物UF與DR各1 μl，繼續(xù)PCR，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55℃退火30 s，72 ℃延伸2min，進(jìn)行30個循環(huán)，72 ℃ 10 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物并純化，得基因編輯模版；將獲得的基因編輯模版通過HindIII和XbaI限制性內(nèi)切酶切出粘性末端，然后通過T4連接酶將其連接到pKC1139質(zhì)粒上，得基因編輯模版載體pKC1139-ldh-t-DNA。

（D）基因編輯質(zhì)粒pKC1139-ldh-t/g-DNA的構(gòu)建

含乳糖操縱子啟動子及guide DNA-ldh連接產(chǎn)物的靶向基因片段（表2）由滁州通用生物公司直接合成，首尾分別加上BamHI及EcoRI酶切位點，中間依次是啟動子，重復(fù)序列（repeat），間隔序列（spacer），重復(fù)序列（repeat）及終止子；將合成的靶向基因片段通過BamHI和EcoRI限制性內(nèi)切酶切出粘性末端，然后通過T4連接酶將其連接到得基因編輯模版載體pKC1139-ldh-t-DNA上得基因編輯質(zhì)粒pKC1139-ldh-t/g-DNA 。

（3）重組子的獲取與檢驗

（A）BS168感受態(tài)的制備

挑取野生型BS168單克隆于5 ml GM1培養(yǎng)基中，37 ℃，130 rpm 過夜培養(yǎng)。次日轉(zhuǎn)接 1 ml于9 mlGM1培養(yǎng)基中，37 ℃，200 rpm 培養(yǎng)3.5 h。轉(zhuǎn)接5 ml GM1培養(yǎng)液于45 ml GM2培養(yǎng)基中，37 ℃，130 rpm 培養(yǎng)1.5 h。4 ℃，4000 rpm，離心10 min。留適量上清重懸細(xì)胞，分裝到2 ml EP 管中得BS168感受態(tài)備用。

（B）質(zhì)粒pHT304-cas7-5-3和pKC1139-ldh-t/g-DNA的共轉(zhuǎn)化

將質(zhì)粒pHT304-cas7-5-3和pKC1139-ldh-t/g-DNA充分混勻后加入到制備好的感受態(tài)中，37 ℃靜置1 h，37 ℃，220 rpm 培養(yǎng)3-4 h。吸取適量菌液涂布到含有Cm抗性的LB培養(yǎng)基上，于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

（C）重組子染色體PCR和基因測序分析

于含有Cm 抗生素的LB平板上挑取單克隆，37 ℃，200 rpm，過夜培養(yǎng)。次日提取基因組進(jìn)行PCR，產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖電泳檢測，觀察重組子染色體DNA擴(kuò)增條帶大小的改變，并經(jīng)基因測序證明BS168-ldh基因敲除及氯霉素抗性基因插入成功。

實施例5（單質(zhì)粒敲除BS 168 ldh基因）

（1）蛋白表達(dá)質(zhì)粒pHT304-cas7-5-3的構(gòu)建

同實施例1步驟（1）

（2）基因編輯質(zhì)粒pHT304-cas7-5-3-ldh-t/g-DNA的構(gòu)建

除temple-DNA-ldh靶基因片段不含Cm 基因外，其余步驟與實施例4中步驟（2）相同。

（3）重組子的獲取與檢驗

同實施例4步驟（3）

以上所述僅以實施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，以便于讀者更容易理解，但不代表本發(fā)明的實施方式僅限于此，任何依本發(fā)明所做的技術(shù)延伸或再創(chuàng)造，均受本發(fā)明的保護(hù)。

表1 維吉尼亞鏈霉菌IBL14基因cas7-5-3、大腸桿菌JM109基因lacZ和枯草桿菌BS168基因ldh全長序列

基因 序列

A） cas7

(999bp) gtggtcgccggtgccccgaacaacggggagggcgaggacaacacggggcgtgtgaagaagctgagggtcgggcgggaggagttcccgtacgtgtccgcgcaggcgttccgtcggtggttgcgtgactcgctgccggcgcaggagccgcgttcggtggtcactcgctcgggcagcggtgccaagcagcaggcacacaccgcgggccggccggacctgcacctggacgatgatctgttcggctacatggtcgcggtgaaggggaaggggggaagctaccagcgggacaccgtgctggctaccgggactttagtttcagtggtgccgcagcgtccgacgttggacttcggcacgatgagccgggacttcccggctggtgagcacccggtgattcactcgcacgagctgtacagcgcgaccctggccggcgatgttctgctggatctgccgcgggctggggtcttcgagacggacggcaacgggttgcgcgtggcgatcagccctgccgtcgctgaggaagcggcgaagaacggggcggaggtcaccacgctgcggggcagtgcggccattcggttgccgcttactgagcggcaccggcggatcggcacgctgttgcggacgctggcgtcggtgcgtggtggggccaagcaggctctgcactacggggaccgggccccttcattggtcttgttggctcctctcaagggtggcgtcaatccgttcacccgtgttctgggcgcccgcgacggtaagcctgtgttcctgagcgatgtcctgcgcgaggagctcgaggcgtgggcggatgagctggacgggccggtgctgctgggctgggccccggggtttctcggcgatcagcgtgagcaggtccgccgcgagctcaaggatctgattgacgagggccgtgtcgtcctgagccatcctcgtgtgctgctgacccagctggccgaccggatcgagcagggtgatcatgacgcgtggttcgaggactccgcggcgtga

B）cas5

(663bp)

gtgacgggtacggaggtcacggccctgcagatcacggtgacggcgccggttgtctccttccgtaatccgctgtatgccggggtgcaggtgacgctgccgtgtccgccgccggccaccgtcggcggcctcctcgccgcagcggctggggggtgggagcaggtcaatccggagctgcgtttcgcgatggcgttccacgctggcggcaaggcggtcgatctcgagacgtaccacccgctggacgcgtctgggaagaaggcgtcgcctgccccgcgtaaccgggagttccttacggcggccgagctcaccgtgtggctggtcgacgaccctgaagggtggcagcgccgcctgcgtcggccggtgtggccgctgcggctgggccgcagccaggacctggtcggtatccgcaccggcctggttccgttgcgcgcggagcccggcgagcagcggtccgccgtggtgccggagacggcggggaggatgggaaccctactgcggctgccgactgcggtctctgggggccgggaccgtacccggtgggacagctaccggttcgacagctcgggccgcagtgaccatgtggtcgtaggcggctggtcgactgccgggggacaggcagtcattctgctgccctcggcccatcccgataccgtcgcgcgttcctga

C）cas3

(2316bp)

gtgggccgtctggacgcggtggaggacgtcttcggcggcaggttctggcccgtcgtggaactcgctggcctcacccacgacgccggcaagattcccgaaggcttccagcggatgctggcgggatacagccgtgcctggggtgagcgtcacgaagtcgcctcgttgggcttcctgcccgcgctcatcggcgacccggacgtgctgttgtgggtggcgaccgcggtcgccacccaccatcgtccgctgaccggccagaacggacgcgacctgcagactctctacagcggtgtcaccatcaccgagctcgcgcaccgtttcgggccttttgacccacgcgctgtccccgccttggaggcctggcttcgtgcgagcgccatccgggtcggcctccccgcggccgctgttccagacgacggcacgctcaccgacaccggagtggtcgctggcgcccaccagctgctggaggagattttggaccgttgggcagaccgtgtgaggcctgaggtgggcttggccgctgtactgctgcagggggcggtcaccctggccgaccacttgtcctccgcccatcaggctctgcccaccgtccagccgttgggggccgggttccggtcccggttggagaaggagttcgctgaacgcggcaggaccctgcgtgcccaccagctggaggccgccaccgttaccggacatcttctgctgcgcgggccgaccggcagtgggaagaccgaggctgccctgctgtgggctgccagccaggtcgaggccctgaaggcggaaggccggggcgtgccgcgtgtgtttttcactctcccctacctggcctccatcaacgccatggcaacacggctgggtgacactctcggcgatggtgaggctgtcggcgttgcccactcccgcgccgcctcctaccaccttgcccaggccatcgccccgcaggacggcgacgaggaggacgaacacggagccccctgccgtgttgacgcggccgccaaggccttgtcccgggccgctgccaccaagctgttccgcgagagtgtccgcgtcgccaccccctaccagcttctgcgggccgccctggccgggccggcccactccggcatcctcatcgacgccgcgaactcggtgttcatcctggacgaactccacgcctacgacgcccgcaggctcggctacatcctggccagtgcccggctgtgggaacgcctcggtggacggatcacagtcctgtccgcgaccctgcccagggccctggccgacctgttcgagagcaccctcaccgcccccatcaccttcctcgacacccccgacctcgggctgccggcgcgccacctcctgcacacccgaggccaccatctcaccgacccggccacactggaggagatccgtctgcggctgtcccgggacgagtcggtcctggtgatcgccaacaacgtgtcccaggccatcgccctgtacgaacagctcgcacccgacgtgtgtgaacgcttcggtcaggacgccgcgctactgctgcactcccggtttcgacggatggaccggtcccggattgagcagaagatcgccgaccggttcgccactgtggcacctgatgcccagaacagccgtaagccgggcctggtcgttgccacgcaggtggtcgaggtcagtctcgacgtcgacttcgatgtgctgttcactggagcggctccgctcgaggccctcctgcagcgcttcggccggaccaaccgcgtcggggcccgcccgccggccgacgtcatcgtccaccatcccgcctggaccacacgccgccgacagcccggcgagtacgccgacggcatctacccacgggagccggtcgagtccgcgtggcacatcctcacccgcaatcacgggcgagtcatcgacgaagcggacgccaccgcgtggctggacgaggtctacgccacggactggggcaggcaatggcaccgcgaggtgctggagcggcgagaaagattcgaccgtgcgttcctgcagttccgctaccccttcgaagaccgcactgacctggccgataccttcgacgaactcttcgacggctccgaagccatcctcgccgaagaccaggacgcctactcagccgcactggccgcaccagacggcgaccaccccggagctggccggctcctcgcagaggaatacctcatccccgttccccactgggccagccccctcagccgctacgagaagcagctcaaagtccgcgtcatcaacggcgactaccaccccgaccacggcctcatggcggtccgggggctgccccagcccgcctaccgcgccggggaggtcttgtga

D）lacZ (3075bp)

atgaccatgattacggattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatggcgctttgcctggtttccggcaccagaagcggtgccggaaagctggctggagtgcgatcttcctgaggccgatactgtcgtcgtcccctcaaactggcagatgcacggttacgatgcgcccatctacaccaacgtgacctatcccattacggtcaatccgccgtttgttcccacggagaatccgacgggttgttactcgctcacatttaatgttgatgaaagctggctacaggaaggccagacgcgaattatttttgatggcgttaactcggcgtttcatctgtggtgcaacgggcgctgggtcggttacggccaggacagtcgtttgccgtctgaatttgacctgagcgcatttttacgcgccggagaaaaccgcctcgcggtgatggtgctgcgctggagtgacggcagttatctggaagatcaggatatgtggcggatgagcggcattttccgtgacgtctcgttgctgcataaaccgactacacaaatcagcgatttccatgttgccactcgctttaatgatgatttcagccgcgctgtactggaggctgaagttcagatgtgcggcgagttgcgtgactacctacgggtaacagtttctttatggcagggtgaaacgcaggtcgccagcggcaccgcgcctttcggcggtgaaattatcgatgagcgtggtggttatgccgatcgcgtcacactacgtctgaacgtcgaaaacccgaaactgtggagcgccgaaatcccgaatctctatcgtgcggtggttgaactgcacaccgccgacggcacgctgattgaagcagaagcctgcgatgtcggtttccgcgaggtgcggattgaaaatggtctgctgctgctgaacggcaagccgttgctgattcgaggcgttaaccgtcacgagcatcatcctctgcatggtcaggtcatggatgagcagacgatggtgcaggatatcctgctgatgaagcagaacaactttaacgccgtgcgctgttcgcattatccgaaccatccgctgtggtacacgctgtgcgaccgctacggcctgtatgtggtggatgaagccaatattgaaacccacggcatggtgccaatgaatcgtctgaccgatgatccgcgctggctaccggcgatgagcgaacgcgtaacgcgaatggtgcagcgcgatcgtaatcacccgagtgtgatcatctggtcgctggggaatgaatcaggccacggcgctaatcacgacgcgctgtatcgctggatcaaatctgtcgatccttcccgcccggtgcagtatgaaggcggcggagccgacaccacggccaccgatattatttgcccgatgtacgcgcgcgtggatgaagaccagcccttcccggctgtgccgaaatggtccatcaaaaaatggctttcgctacctggagagacgcgcccgctgatcctttgcgaatacgcccacgcgatgggtaacagtcttggcggtttcgctaaatactggcaggcgtttcgtcagtatccccgtttacagggcggcttcgtctgggactgggtggatcagtcgctgattaaatatgatgaaaacggcaacccgtggtcggcttacggcggtgattttggcgatacgccgaacgatcgccagttctgtatgaacggtctggtctttgccgaccgcacgccgcatccagcgctgacggaagcaaaacaccagcagcagtttttccagttccgtttatccgggcaaaccatcgaagtgaccagcgaatacctgttccgtcatagcgataacgagctcctgcactggatggtggcgctggatggtaagccgctggcaagcggtgaagtgcctctggatgtcgctccacaaggtaaacagttgattgaactgcctgaactaccgcagccggagagcgccgggcaactctggctcacagtacgcgtagtgcaaccgaacgcgaccgcatggtcagaagccgggcacatcagcgcctggcagcagtggcgtctggcggaaaacctcagtgtgacgctccccgccgcgtcccacgccatcccgcatctgaccaccagcgaaatggatttttgcatcgagctgggtaataagcgttggcaatttaaccgccagtcaggctttctttcacagatgtggattggcgataaaaaacaactgctgacgccgctgcgcgatcagttcacccgtgcaccgctggataacgacattggcgtaagtgaagcgacccgcattgaccctaacgcctgggtcgaacgctggaaggcggcgggccattaccaggccgaagcagcgttgttgcagtgcacggcagatacacttgctgatgcggtgctgattacgaccgctcacgcgtggcagcatcaggggaaaaccttatttatcagccggaaaacctaccggattgatggtagtggtcaaatggcgattaccgttgatgttgaagtggcgagcgatacaccgcatccggcgcggattggcctgaactgccagctggcgcaggtagcagagcgggtaaactggctcggattagggccgcaagaaaactatcccgaccgccttactgccgcctgttttgaccgctgggatctgccattgtcagacatgtataccccgtacgtcttcccgagcgaaaacggtctgcgctgcgggacgcgcgaattgaattatggcccacaccagtggcgcggcgacttccagttcaacatcagccgctacagtcaacagcaactgatggaaaccagccatcgccatctgctgcacgcggaagaaggcacatggctgaatatcgacggtttccatatggggattggtggcgacgactcctggagcccgtcagtatcggcggaattccagctgagcgccggtcgctaccattaccagttggtctggtgtcaaaaataa

E）ldh

(966bp)

atgatgaacaaacatgtaaataaagtagctttaatcggagcgggttttgttggaagcagttatgcatttgcgttaattaaccaaggaatcacagatgagcttgtggtcattgatgtaaataaagaaaaagcaatgggcgatgtgatggatttaaaccacggaaaggcgtttgcgccacaaccggtcaaaacatcttacggaacatatgaagactgcaaggatgctgatattgtctgcatttgcgccggagcaaaccaaaaacctggtgagacacgccttgaattagtagaaaagaacttgaagattttcaaaggcatcgttagtgaagtcatggcgagcggatttgacggcattttcttagtcgcgacaaatccggttgatatcctgacttacgcaacatggaaattcagcggcctgccaaaagagcgggtgattggaagcggcacaacacttgattctgcgagattccgtttcatgctgagcgaatactttggcgcagcgcctcaaaacgtacacgcgcatattatcggagagcacggcgacacagagcttcctgtttggagccacgcgaatgtcggcggtgtgccggtcagtgaactcgttgagaaaaacgatgcgtacaaacaagaggagctggaccaaattgtagatgatgtgaaaaacgcagcttaccatatcattgagaaaaaaggcgcgacttattatggggttgcgatgagtcttgctcgcattacaaaagccattcttcataatgaaaacagcatattaactgtcagcacatatttggacgggcaatacggtgcagatgacgtgtacatcggtgtgccggctgtcgtgaatcgcggagggatcgcaggtatcactgagctgaacttaaatgagaaagaaaaagaacagttccttcacagcgccggcgtccttaaaaacattttaaaacctcattttgcagaacaaaaagtcaactaa

表2 引物及編輯原件序列表

引物名稱 序列(5’→3’)

304cas-F taacaatttcacacaggaaacagctgtggtcgccggtgccccgaac

304cas-R ttggcgggtgtcggggctggcttaatcacaagacctccccggcgc

lacZ-F tacccaacttaatcgccttgcagcaca

lacZ-R ccgtcgatattcagccatgtgccttctt

lacZ-UF

lacZ-UR

lacZ-DF

lacZ-DR

guide DNA-lacZ

ldh-F

ldh-R

ldh-UF

ldh-UCmR

ldh-UCmF

ldh-CmDR

ldh-CmDF

ldh-DR

ldh-UR

ldh-DF

guide DNA-ldh

cccAAGCTTatgagcgtggtggttatgcc

acgaagccgccctgtaaacccatgccgtgggtttcaata

tattgaaacccacggcatgggtttacagggcggcttcgt

gcgtTCTAGAatgcgggtcgcttcacttac

cgGGATCCtaatacgactcactatagggaatattgtcctcatcgccccttcgaggggtcgcaacccgcccggtgcagtatgaaggcggcggagccgacaccacggtcctcatcgccccttcgaggggtcgcaacctagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgGAATTCcg

atgatgaacaaacatgtaa

ttagttgactttttgttc

ccAAGCTTcgatgagatggatttaaacca

cacaggtaggcgcgccatgttgcgtaagtcaggata

tatcctgacttacgcaacatggcgcgcctacctgtg

tttttctcaacgagttcactccttacgccccgcc

ggcggggcgtaaggagtgaactcgttgagaaaaa

gcgtTCTAGAgcgattcacgacagcc

tttttctcaacgagttcactatgttgcgtaagtcaggata

tatcctgacttacgcaacatagtgaactcgttgagaaaaa

cgGGATCCtaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaagtcctcatcgccccttcgaggggtcgcaacagcggcctgccaaaagagcgggtgattggaagcggcacaagtcctcatcgccccttcgaggggtcgcaacctagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgGAATTCcg

大寫字母為酶切位點，波浪線為保護(hù)堿基，引物黑體加粗為互補區(qū)，單下劃線為啟動子promoter，斜體為spacer，黑體加粗為repeat，雙下劃線為終止子terminator