專利名稱：用抗體吸附表面物質(zhì)及質(zhì)譜聯(lián)合檢測(cè)多種抗原標(biāo)記的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的生物樣品中蛋白質(zhì)分析方法，一種通過抗體吸附表面物質(zhì)捕獲的生物標(biāo)記，并用質(zhì)譜分析來檢測(cè)生物標(biāo)記。
在此提及的此項(xiàng)發(fā)明大大地改進(jìn)了免疫分析方法手段，比目前常規(guī)生化檢查(酶聯(lián)法或熒光法)更精確。更確切地講，此發(fā)明涉及到多種形式生物標(biāo)記(biomarkers)或抗原標(biāo)記，而這些抗原或生物標(biāo)記能被用來以更高的特異性和靈敏度將多種疾病標(biāo)記一次性區(qū)分出來。本發(fā)明可以應(yīng)用到臨床檢驗(yàn)。
背景技術(shù)：
不論是細(xì)胞的正常功能還是病理特性都在一定程度上取決于細(xì)胞所表達(dá)的蛋白質(zhì)功能。因此，鑒定疾病在人體內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)的區(qū)別，可用于疾病診斷及篩查，并最終用于藥物開發(fā)和疾病治療。而要進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)和功能的差異化分析，要求能夠達(dá)到分辨細(xì)胞內(nèi)分子的復(fù)雜混合物的程度。但細(xì)胞內(nèi)許多物質(zhì)往往以微量存在，目前用于分析蛋白質(zhì)的方法在上述各方面都有局限，用這些常規(guī)手段難以對(duì)多種疾病同時(shí)進(jìn)行定性鑒定和定量分析。
如，醫(yī)院要求特異性地檢測(cè)出多種常見疾病的已知標(biāo)記。但是，制備多種特異性結(jié)合標(biāo)記并且能在復(fù)雜的混合物中鑒別出標(biāo)記的試劑需要大量時(shí)間，這阻礙了此類診斷方法的發(fā)展。目前，還沒有一種方法能夠?qū)⑺姆N疾病標(biāo)志物同時(shí)檢出。
ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)試劑盒利用抗體及酶標(biāo)反應(yīng)可以用于檢測(cè)一種疾病標(biāo)志物。利用抗體及三色熒光，最多可以做到檢測(cè)三個(gè)疾病標(biāo)志物，但三個(gè)以上疾病標(biāo)志物就無法同時(shí)檢測(cè)。利用抗體吸附表面物質(zhì)及抗體與質(zhì)譜儀聯(lián)合應(yīng)用，即可以解決同時(shí)鑒別三種以上的疾病抗原標(biāo)志物。舉例講，將抗HBV(HBsAg)抗體，抗HCV抗體，抗HIV p24 antigen(Ribas SG et al.Performance of a quantitative humanimmunodeficiency virus type 1 p24 antigen assay on various HIV-1 subtypes for thefollow-up of human immunodeficiency type 1 seropositive individuals.J Virol Methods2003；11329-34)及抗梅毒抗體(anti-treponemal 17 kDa protein)(George R et al.Ananalysis of the value of some antigen-antibody interactions used as diagnosticindicators in a treponemal Western blot(TWB)test for syphilis.J Clin Lab Immunol1998；5027-44)等抗體聯(lián)合標(biāo)記至Protein A或G抗體吸附表面物質(zhì)上。由于每種特異體抗體捕獲病病毒抗原的分子量是不同的，故Protein A/G-抗體與質(zhì)譜儀聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，質(zhì)譜儀就非常容易地將多種抗原同時(shí)分開了。由此推理，如果同時(shí)選擇多種特異性抗體，而這些抗體所結(jié)合的抗原分子量是不同的，則本發(fā)明可同時(shí)區(qū)分無數(shù)種疾病抗原標(biāo)記。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是建立一種在生物樣品中檢測(cè)多種疾病生物標(biāo)記或抗原標(biāo)記的用途。此發(fā)明涉及到生物標(biāo)記(biomarkers)，而這些生物標(biāo)記能被更高的特異性和靈敏度的質(zhì)譜將多種疾病同時(shí)區(qū)分出來。
本發(fā)明涉及一種通過標(biāo)記特異性抗體至抗體吸附表面物質(zhì)(Protein A and G或Mercapto-Ethyl-Pyridine)，并用質(zhì)譜分析來同時(shí)檢測(cè)多種疾病生物標(biāo)記。
本發(fā)明中的生物標(biāo)記是利用一臺(tái)質(zhì)譜儀來做最后鑒定。該設(shè)備的質(zhì)量精確度約為+/-0.1％。
抗體吸附表面物質(zhì)用Protein A and G抗體吸附表面物質(zhì)為代表(Protein A and G有捕獲抗體Fc段功能)。具有吸收劑功能的Protein A and G底基與抗體結(jié)合，抗體結(jié)合血清中生物標(biāo)記物/抗原蛋白質(zhì)。經(jīng)過一段足夠的時(shí)間，使生物標(biāo)記物/抗原能與抗體-ProteinA/G結(jié)合。底基洗去未吸附的物質(zhì)。
生物標(biāo)記物首先能夠被具有能與生物標(biāo)記物結(jié)合的特異的抗體-Protein A and G吸附表面物質(zhì)捕獲，非吸附物能從吸附表面物質(zhì)上洗脫。然后加還原劑，使抗原與抗體分離，將含有抗原的上清液在飛行質(zhì)譜儀中被檢測(cè)。生物標(biāo)記物通過離子發(fā)生源，如激光，被離子化，產(chǎn)生的離子被一個(gè)離子感受集合器收集，然后質(zhì)量分析器分析那些通過的離子。之后，檢測(cè)器將檢測(cè)的離子信息轉(zhuǎn)換為質(zhì)荷比。生物標(biāo)記物的檢測(cè)明顯地將與信號(hào)強(qiáng)度的檢測(cè)有關(guān)。這樣，生物標(biāo)記物的數(shù)量與質(zhì)量都可以被檢測(cè)出來。
飛行質(zhì)譜對(duì)待分析物的分析生成飛行時(shí)間譜。該飛行時(shí)間譜的最終分析并不表示離子化能量攻擊一個(gè)樣本產(chǎn)生的單獨(dú)的脈沖信號(hào)，而是一系列脈沖的信號(hào)之和。這樣降低了干擾，并增加了動(dòng)態(tài)范圍。該飛行時(shí)間數(shù)據(jù)受數(shù)據(jù)處理軟件的影響。軟件中數(shù)據(jù)處理主要包括轉(zhuǎn)換飛行時(shí)間與質(zhì)荷比而產(chǎn)生質(zhì)譜，降低基線而減少儀器的偏移量，和過濾高頻噪音而減輕高頻噪音。
通過對(duì)生物標(biāo)記物的檢測(cè)而產(chǎn)生的數(shù)據(jù)可利用計(jì)算機(jī)的數(shù)據(jù)分析程序進(jìn)行分析。該計(jì)算機(jī)程序分析這些數(shù)據(jù)以顯示檢測(cè)出的標(biāo)記物的數(shù)量，并顯示信號(hào)的強(qiáng)度和確定被檢測(cè)的每個(gè)生物標(biāo)記物的分子量。數(shù)據(jù)分析還能包括一系列的確定生物標(biāo)記物的信號(hào)強(qiáng)度和矯正數(shù)據(jù)對(duì)預(yù)定統(tǒng)計(jì)分布狀態(tài)的偏離。例如，通過計(jì)算與某些參數(shù)相關(guān)的每個(gè)峰值的高度，可規(guī)范被測(cè)到的峰值。該參數(shù)可能是由儀器和類似能量吸收分子等化學(xué)成分產(chǎn)生的干擾，這可以設(shè)置調(diào)零。
計(jì)算機(jī)可以將計(jì)算數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成各種形式來表現(xiàn)。其標(biāo)準(zhǔn)譜可以表示為兩種一種形式中，只有峰高和質(zhì)量信息可以在譜帶中保留，產(chǎn)生一個(gè)較清晰的圖，并使具有幾乎相同分子量的生物標(biāo)記物更易顯現(xiàn)。在另一種形式中，兩個(gè)或更多的譜比較，便于突顯獨(dú)特的生物標(biāo)記物和那些高于或低于校準(zhǔn)樣本的生物標(biāo)記物。
分析一般包括展示從待分析物得到的信號(hào)的圖譜中峰的鑒定。峰可以通過視圖進(jìn)行選擇，軟件是可用的，它可自動(dòng)檢測(cè)峰。一般情況下，該軟件通過鑒定信號(hào)具有信噪比高于一個(gè)選擇閾值并標(biāo)記出在峰信號(hào)的質(zhì)心處的峰的質(zhì)量這樣的方式操作。在一個(gè)有效的程序中，比較許多譜線以認(rèn)定出現(xiàn)在質(zhì)譜中某一選定范圍內(nèi)同樣的一些峰。該軟件的一個(gè)版本聚集所有出現(xiàn)在確定的質(zhì)量范圍內(nèi)的各條光譜的峰，對(duì)所有在質(zhì)量(質(zhì)荷比)中值附近的峰指定一個(gè)質(zhì)量(質(zhì)荷比)簇。
發(fā)明中使用的多種疾病生物標(biāo)記是被多種特異的抗體所捕。這些生物標(biāo)記是通過由質(zhì)譜(mass spectrometry)測(cè)定其不同分子量。
對(duì)生物標(biāo)記的檢測(cè)需要將一個(gè)樣本放在的一個(gè)吸附點(diǎn)上，接著進(jìn)行清洗。向吸附點(diǎn)上加入SINAPINIC酸并讓其干燥。而后，用質(zhì)譜測(cè)定法對(duì)其進(jìn)行分析，而一個(gè)顯示了蛋白質(zhì)分子的遺留物圖將生成，這張圖是在蛋白質(zhì)分子的質(zhì)量-電荷比的基礎(chǔ)上，以彼此分開的峰圖的形式顯示出來的。
因?yàn)楸卷?xiàng)發(fā)明中的生物標(biāo)記是通過質(zhì)量和抗體來標(biāo)識(shí)的，因而它們可通過質(zhì)譜測(cè)定法進(jìn)行檢測(cè)而直接知道它們特定的身份。這種方法比抗體為基礎(chǔ)的ELISA及免疫熒光法更準(zhǔn)確。然而，如果有必要，這些生物標(biāo)記也可通過，比如，確定多肽的氨基酸序列來進(jìn)行鑒別。例如，一個(gè)生物標(biāo)記能用許多酶描繪出來，例如V8蛋白酶(V8 protease)或胰蛋白酶，而且消化片段(digestion fragments)，又稱多肽指紋，的分子量可被用來在數(shù)據(jù)庫中搜索序列，這些序列與由多種酶生成的消化片斷的分子量相吻合?；蛘?，如果此生物標(biāo)記不是已知數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)分子，在生物標(biāo)記的N極氨基酸序列(N-terminal AminoAcid Sequence)的基礎(chǔ)上，可使用降解探針，而后，這些探針會(huì)被用來描繪由探測(cè)到了生物標(biāo)記的樣本所生成的基因組或cDNA庫。最后，蛋白質(zhì)生物標(biāo)記可用蛋白質(zhì)梯狀排序法(protein ladder sequencing)進(jìn)行排序。通過將分子碎成碎片并將碎片用酶解作用或其他可按順序從碎片末端除去一個(gè)單個(gè)氨基酸分子的方法進(jìn)行處理后，可生成蛋白質(zhì)梯度(protein ladders)。然后，用質(zhì)譜對(duì)此梯度進(jìn)行分析。階梯狀碎片(ladder fragments)在質(zhì)量上的差異可鑒別出從分子末端被除去的氨基酸。因此，本發(fā)明可以用于多種疾病標(biāo)志物鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)。舉例講，如果用抗梅毒抗體(捕獲特異性梅毒17kDa蛋白)，質(zhì)譜圖顯示一個(gè)17kDa蛋白，我們可以診斷梅毒；如果出現(xiàn)一個(gè)10kDa蛋白，則可能是梅毒17kDa蛋白降解產(chǎn)物；如果出現(xiàn)一個(gè)30kDa蛋白，則可能是非特異性蛋白。這時(shí)就可以用質(zhì)譜來做氨基酸序列鑒定即最精確鑒別(金標(biāo)準(zhǔn))。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1正常人與多種疾病在血液中抗原標(biāo)記的區(qū)分(1)實(shí)驗(yàn)方法一、材料1.標(biāo)本來源收集臨床診斷病人的血清/血漿樣本。50例對(duì)照組(正常人，已知絨毛膜促性腺激素，甲胎球蛋白，促甲狀腺激素，乳酸脫氫酶，肌酸激酶同工酶，門冬氨酸轉(zhuǎn)移酶，轉(zhuǎn)鐵蛋白，纖維蛋白原均正常)；15例孕婦并發(fā)甲狀腺亢進(jìn)、心力衰竭或心肌梗塞病人(已知絨毛膜促性腺激素，甲胎球蛋白，促甲狀腺激素，乳酸脫氫酶，肌酸激酶同工酶，門冬氨酸轉(zhuǎn)移酶，轉(zhuǎn)鐵蛋白，纖維蛋白原均升高)；16例心肌梗塞病人(僅乳酸脫氫酶，肌酸激酶同工酶升高)；14例甲狀腺亢進(jìn)病人(僅促甲狀腺激素，轉(zhuǎn)鐵蛋白升高)；12例正常孕婦(僅絨毛膜促性腺激素升高)；15例肝癌病人(僅甲胎球蛋白，門冬氨酸轉(zhuǎn)移酶，纖維蛋白原升高)。
2.試劑Protein A and G、絨毛膜促性腺激素抗體、甲胎球蛋白抗體、促甲狀腺激素抗體、乳酸脫氫酶抗體、肌酸激酶同工酶抗體、門冬氨酸轉(zhuǎn)移酶抗體、轉(zhuǎn)鐵蛋白抗體、纖維蛋白原抗體、乙腈、三氟乙酸、SINAPINIC酸(Sinapinic acid)均購自Sigma公司或贈(zèng)送。
二、方法1.樣品的收集全血采集后吸取血清，置于-80℃保存；2.樣品的準(zhǔn)備正常人血清；孕婦并發(fā)甲狀腺亢進(jìn)、心力衰竭或心肌梗塞病人陽性血清；心肌梗塞病人陽性血清；甲狀腺亢進(jìn)病人陽性血清；正常孕婦陽性血清；肝癌病人陽性血清。
3.樣品的預(yù)處理先將8種抗體同時(shí)結(jié)合至一個(gè)Protein A柱子(Column)上(一個(gè)柱子多種抗體)，然后將100μl稀釋樣本加載到柱子中并在室溫條件下輕微震蕩0.5小時(shí)。從柱子中移去緩沖液(pH7.0-7.4)。200μl同樣的結(jié)合緩沖液加到每個(gè)柱子中并震蕩洗滌5分鐘。重復(fù)洗滌。移去緩沖液并加還原劑(pH3.0-5.0)使抗原從柱子上分離。取上清液(含抗原)加入0.5μl的SINAPINIC酸(5mg/mL 50％乙腈；0.5％三氟乙酸)，任其自然干燥。
4.樣品檢測(cè)樣品放入質(zhì)譜中，就會(huì)生成飛行時(shí)間質(zhì)譜。外部使用多肽分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)來校正質(zhì)量精確性。
(2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析72例病人與50例對(duì)照組(正常人)血清中蛋白質(zhì)的組成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)8個(gè)蛋白質(zhì)組成的抗原標(biāo)記可將對(duì)照組(正常人)與患者準(zhǔn)確的分組。
預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及雙盲分析中，結(jié)果顯示用這8個(gè)蛋白質(zhì)組成的抗原標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)，72例患者與50例對(duì)照組(正常人)被正確分組，準(zhǔn)確率為100％(122/122)。靈敏度為100％(15/15例孕婦并發(fā)甲狀腺亢進(jìn)、心力衰竭或心肌梗塞病人；16/16例心肌梗塞病人；14/14例甲狀腺亢進(jìn)病人；12/12例正常孕婦；15/15例肝癌病人；被正確分組)；特異性為100％(50/50例對(duì)照組正常人被正確分組)。
(3)結(jié)論將來自具有統(tǒng)計(jì)意義患者群的樣品與對(duì)照組(正常樣品)比較，用特異性抗體吸附表面物質(zhì)所捕獲的8種血清抗原標(biāo)記可以同時(shí)鑒別5種疾病，即用這些抗原標(biāo)記組合的質(zhì)譜檢測(cè)法可以同時(shí)鑒別多種疾病。
在理論上，當(dāng)加入至抗體吸附表面物質(zhì)上的特異性抗體量無限地增加，所測(cè)定抗原標(biāo)記分子或生物標(biāo)記也可以相應(yīng)增加，即同時(shí)檢測(cè)出三種以上的生物標(biāo)記。在一個(gè)多種抗體的吸附表面上捕獲多種抗原標(biāo)記，并對(duì)捕獲的抗原標(biāo)記進(jìn)行質(zhì)譜分析，可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)或多種抗原標(biāo)記群。
權(quán)利要求
1.一種用抗體吸附表面物質(zhì)捕獲生物樣品中抗原標(biāo)記的蛋白質(zhì)分析方法，其特征是采用質(zhì)譜分析對(duì)樣品中蛋白質(zhì)組進(jìn)行鑒別檢測(cè)。
2.權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)分析方法，其中所述的鑒別檢測(cè)蛋白質(zhì)組的方法是質(zhì)譜法。
3.權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)分析方法，所用抗體吸附表面物質(zhì)是任何能與抗體選擇性或特異性結(jié)合的物質(zhì)，如蛋白A和G(Protein A and Protein G)。
4.權(quán)利要求3所述的抗體吸附表面物質(zhì)是用于捕獲抗原標(biāo)記的單克隆或多克隆抗體。
5.權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)分析方法，所用抗體吸附表面物質(zhì)結(jié)合多個(gè)或多組單克隆抗體去捕獲多個(gè)或多種生物標(biāo)記物(抗原標(biāo)記)，可以無限量地增加單克隆抗體組來達(dá)到無限量地檢測(cè)多個(gè)或多種生物標(biāo)記物或抗原標(biāo)記。
6.權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)分析方法，所用抗體吸附表面物質(zhì)所捕獲的分析物是生物樣品-血液，體液，分泌物，細(xì)胞溶解液，組織溶解物和器官溶解物。
7.用權(quán)利要求6的方法分析生物樣品中特異的生物標(biāo)記以檢測(cè)多種疾病抗原標(biāo)記的用途。
8.用權(quán)利要求7，可以同時(shí)檢測(cè)出三種以上的抗原標(biāo)記的鑒定方法。
9.權(quán)利要求5所述生物標(biāo)記物來源于血液，體液，分泌物，細(xì)胞溶解物，組織溶解物和器官溶解物。
10.權(quán)利要求1中抗體吸附表面物質(zhì)的支持物可以是金屬片，玻璃片，陶瓷片，陶瓷珠，磁性微?；蚨嗑垠w。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種通過被抗體吸附表面物質(zhì)上捕獲的抗原標(biāo)記，并用質(zhì)譜分析來檢測(cè)。在一個(gè)多種抗體的吸附表面上捕獲多種抗原標(biāo)記，并對(duì)捕獲的抗原標(biāo)記進(jìn)行質(zhì)譜分析?？梢詸z測(cè)多個(gè)抗原標(biāo)記群。本發(fā)明的方法可用于檢測(cè)生物樣品中抗原標(biāo)記組合。用這些抗原標(biāo)記組合的檢測(cè)法可以同時(shí)鑒別多種疾病。本方法準(zhǔn)確、方便且快捷。
文檔編號(hào)G01N33/577GK1657941SQ20041000440
公開日2005年8月24日 申請(qǐng)日期2004年2月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月19日
發(fā)明者許洋 申請(qǐng)人:許洋