本發(fā)明屬于生物技術領域和遺傳工程領域技術領域，尤其涉及一種S-核糖基高半胱氨酸裂解酶基因重組表達載體及其表達方法和應用。

背景技術：

細菌能夠分泌自誘導因子感知周圍環(huán)境中細菌的密度并調控基因表達的現(xiàn)象稱為群體感應(quorum sensing，QS)，參與調控細菌的多種生長發(fā)育過程，如生物發(fā)光、孢子形成、抗生素生成、生物薄膜形成、細菌毒力因子分泌等、與人類衛(wèi)生保健、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及環(huán)境保護等都有密切的關系。根據(jù)細菌合成的信號分子和感應機制不同，QS系統(tǒng)主要分為3種：革蘭陰性菌的AHL-LuxI/LuxR系統(tǒng)、革蘭陽性菌中寡肽介導的雙組分感應系統(tǒng)與呋喃硼酸二脂類化合物(AI-2)介導的AI-2/LuxS種間群體感應系統(tǒng)。由于在自然狀態(tài)下微生物多以不同菌種混合存在的方式生存，并在種間存在廣泛的信息交流，所以AI-2/LuxS群體感應調控系統(tǒng)備受重視。研究其誘導的密度感應機制，有助于理解微生物生物學行為，并為探索治療微生物感染提供新思路。

細菌通過種間群體感應通用信號分子AI-2實現(xiàn)種間信息交流，而S-核糖基高半胱氨酸裂解酶(LuxS)是AI-2合成途徑中的關鍵酶。AI-2合成途徑中S-腺苷甲硫氨酸(SAM)被作為一種甲基供體,產(chǎn)生的毒性中間產(chǎn)物S-腺苷高半胱氨酸(SAH)由5-甲硫腺苷/S-腺苷高半胱氨酸核苷酶(Pfs)水解成S-核糖高半胱氨酸(SRH)和腺嘌呤。LuxS催化SRH裂解成DPD和高半胱氨酸，DPD自動進行分子重排生成信號分子AI-2。

乳酸菌是革蘭氏陽性細菌，其中不僅有寡肽介導的雙組分感應系統(tǒng)，而且存在AI-2/LuxS群體感應系統(tǒng)。乳酸菌產(chǎn)細菌素與對人體消化道粘附的特性有助于抑制或排擠機會致病菌，降低人體被致病菌感染的風險。研究表明乳酸菌的這些益生特性受QS系統(tǒng)調控。

目前市面缺少商品化的AI-2，但存在SAH。SRH可在酸性高溫條件下水解，生成SRH，再經(jīng)LuxS體外催化合成DPD。對于研究AI-2介導的群體感應系統(tǒng)的實驗來說，有在體外高效的表達LuxS蛋白，繼而體外合成AI-2用于考察不同實驗組別的差異，能使實驗結果更具有說服力。

技術實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明提供一種S-核糖基高半胱氨酸裂解酶基因重組表達載體及其表達方法和應用。本發(fā)明將S-核糖基高半胱氨酸裂解酶基因(luxS)的重組表達載體pET28a-luxS，將該表達載體導入大腸桿菌細胞內，通過誘導劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的誘導，完成S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的表達，并通過親和純化得到目的蛋白。

本發(fā)明第一方面，提供一種S-核糖基高半胱氨酸裂解酶基因重組表達載體，其特征在于，所述基因重組表達載體通過以下方法得到：限制性內切酶HindⅢ和XhoⅠ分別對pET28-a載體和PCR擴增出的LuxS基因純化產(chǎn)物進行同步酶切，分別獲得帶有HindⅢ和XhoⅠ粘性末端的luxS基因片段和pET28-a載體大片段，采用瓊脂糖凝膠電泳后分別進行回收后，luxS基因片段和pET28-a載體大片段進行連接，得到連接產(chǎn)物，連接產(chǎn)物導入到大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞中，大腸桿菌BL21中含有基因重組表達載體pET28a-luxS。

所述LuxS基因來源于植物乳桿菌。植物乳桿菌是公認的益生菌，在食品發(fā)酵行業(yè)中已經(jīng)被廣泛應用，所以來自于其中的基因也可認為是對人體安全無害的，這將為該發(fā)明將來在食品發(fā)酵領域的應用提供理論的安全保障。

所述LuxS基因PCR擴增時的引物如下：

前引物luxS-F：5’-CGAAGCTTTGGCTAAAGTAGAAAGTT-3’；

后引物luxS-R：5’-ATTCTCGAGCTATTCAACGACTTTGCG-3’；

本發(fā)明第二方面，提供一種S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的制備方法，所述制備方法包括構建S-核糖基高半胱氨酸裂解酶基因重組表達載體的步驟，S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的表達步驟和S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的純化步驟；

所述S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的表達步驟如下：挑取含有基因重組表達載體pET28a-luxS的大腸桿菌單菌落接入含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至培養(yǎng)物的OD₆₀₀值達到0.6-0.8，向培養(yǎng)物中加入IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)5～7h，離心收集菌體，用非變性鎳柱結合緩沖液重懸菌體，超聲波破碎后離心，得到S-核糖基高半胱氨酸裂解酶粗蛋白；

所述S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的純化步驟如下：

S-核糖基高半胱氨酸裂解酶粗蛋白采用鎳親和層析柱進行純化，先用非變性鎳柱洗脫緩沖液Ⅰ洗脫，然后采用非變性鎳柱洗脫緩沖液Ⅱ洗脫，再用非變性鎳柱洗脫緩沖液Ⅲ洗脫，去除非特異性結合的雜蛋白；最后用非變性鎳柱洗脫緩沖液Ⅳ，收集洗脫液，SDS-PAGE檢測洗脫液中樣品純度，得到純化后的S-核糖基高半胱氨酸裂解酶；

所述緩沖液Ⅰ為50mM NaH₂PO₄，500mM NaCl，90～110mM imidazole(咪唑)，pH 7.5～8.5；

所述緩沖液Ⅱ為50mM NaH₂PO₄，500mM NaCl，140～160mM imidazole，pH 7.5～8.5；

所述緩沖液Ⅲ為50mM NaH₂PO₄，500mM NaCl，190～210mM imidazole，pH 7.5～8.5；

所述緩沖液Ⅳ為50mM NaH₂PO₄，500mM NaCl，250～290mM imidazole，pH 7.5～8.5。250mM imidazole(咪唑)濃度的洗脫液可正好洗脫目的蛋白，而較低的濃度梯度可以有效清除雜蛋白，保留目的蛋白。

作為優(yōu)選，所述S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的表達步驟具體操作如下：挑取含有基因重組表達載體pET28a-luxS的大腸桿菌單菌落接入含有卡那霉素45～55μg/ml的LB液體培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)物按照0.8～1.2％接種量接種于500mL含有卡拉霉素45～55μg/ml的LB培養(yǎng)基，36～38℃振蕩培養(yǎng)，至培養(yǎng)物的OD₆₀₀值達到0.6-0.8，向培養(yǎng)物中加入IPTG至0.8～1.2mM，36～38℃繼續(xù)培養(yǎng)6～8h；4000～6000rpm離心5～7min，收集菌體，用非變性鎳柱結合緩沖液重懸菌體，超聲波破碎后離心，得到S-核糖基高半胱氨酸裂解酶粗蛋白；

所述非變性鎳柱結合緩沖液成分如下：50mM NaH₂PO₄，500mM NaCl，20～50mM imidazole，pH 7.5～8.5。

作為優(yōu)選，所述S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的純化中緩沖液Ⅰ洗脫9～11個柱體積，緩沖液Ⅱ洗脫9～11個柱體積，緩沖液Ⅲ洗脫4～6個柱體積，緩沖液Ⅳ洗脫18～22個柱體積。

所述S-核糖基高半胱氨酸裂解酶在Al³⁺、Ca²⁺和EDTA影響下活性上升，在Cu²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺及甘油作用下活性下降，即S-核糖基高半胱氨酸裂解酶參與催化反應時Al³⁺、Ca²⁺和EDTA能夠增強催化效率，Cu²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺及甘油降低催化效率。

本發(fā)明第三方面，還提供所述制備方法制得的S-核糖基高半胱氨酸裂解酶在合成AI-2及其AI-2類似物方面中的應用。

本發(fā)明特點之一在于，本發(fā)明使用的luxS基因來源于乳酸菌，植物乳桿菌是公認的益生菌，在食品發(fā)酵行業(yè)中已經(jīng)被廣泛應用，所以來自于其中的基因也可認為是對人體安全無害的，這將為該發(fā)明將來在食品發(fā)酵領域的應用提供理論的安全保障。

本發(fā)明特點之二在于，本發(fā)明將制備的S-核糖基高半胱氨酸裂解酶粗蛋白進行純化，純化的主要目的是使用純的酶體外合成自誘導物2，用于群體感應相關科學研究。本發(fā)明通過篩選純化條件，能夠很好地將S-核糖基高半胱氨酸裂解酶分離出來，首先使用S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的純化中緩沖液Ⅰ洗脫9～11個柱體積，再使用緩沖液Ⅱ洗脫9～11個柱體積，然后使用緩沖液Ⅲ洗脫4～6個柱體積，最后使用緩沖液Ⅳ洗脫18～22個柱體積，其中在梯度洗脫中，咪唑的濃度由低到高增加，咪唑梯度過大或過小都會造成雜蛋白較多，純化效率低，實驗證明以50mM的梯度差比較合適，緩沖液IV中咪唑濃度增加到250mM時，緩沖液IV可正好洗脫目的蛋白，而較低的濃度梯度可以有效清除雜蛋白，得到S-核糖基高半胱氨酸裂解酶，緩沖液IV中咪唑濃度超過300mM時，雜蛋白又會增加。

本發(fā)明特點之三在于，本發(fā)明研究了其他因素對S-核糖基高半胱氨酸裂解酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)S-核糖基高半胱氨酸裂解酶在Al³⁺、Ca²⁺和EDTA影響下活性上升，在Cu²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺及甘油作用下活性下降，該結果對S-核糖基高半胱氨酸裂解酶在催化反應過程中提高反應效率具有重要的意義。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益效果：(1)本發(fā)明的luxS基因來自益生菌，不必擔心安全問題；(2)優(yōu)化了純化條件，能夠快速分離純化S-核糖基高半胱氨酸裂解酶；(3)發(fā)現(xiàn)了S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的激活劑(金屬離子、EDTA)，能夠提高S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的催化活性。

附圖說明

圖1為本發(fā)明S-核糖基高半胱氨酸裂解酶基因PCR后的膠回收純化片段；

圖2為本發(fā)明S-核糖基高半胱氨酸裂解酶基因表達蛋白的SDS-PAGE分析檢測電泳圖,其分子量約為22KDa，圖中Lane 1為Protein Marker；Lane 2為純化的S-核糖基高半胱氨酸裂解酶；

圖3為哈氏弧菌BB170的生物發(fā)光實驗，使用酶標儀檢測的發(fā)光值，陰性對照為不加反應液的哈氏弧菌BB170，實驗組為加反應液的哈氏弧菌BB170；

圖4為純化的S-核糖基高半胱氨酸裂解酶在不同溫度下的相對酶活性示意圖，其中37℃時的酶活性設為100％。

具體實施方式

下面通過實施例對本發(fā)明的技術方案作進一步詳細說明，但本發(fā)明的內容并不局限于此，本實施例中方法如無特殊說明的均按常規(guī)方法操作，所用試劑如無特殊說明的采用常規(guī)試劑或按常規(guī)方法配置的試劑，基因luxS、載體pMD18-T、載體pET28a的序列均已知，宿主大腸桿菌DH5α和大腸桿菌BL21由試劑公司購買得到。

實施例1：S-核糖基高半胱氨酸裂解酶基因luxS的克隆、表達及純化

1、PCR擴增S-核糖基高半胱氨酸裂解酶基因luxS

使用細菌基因組DNA提取試劑盒(北京百泰克生物技術有限公司)提取植物乳桿菌YM4-3總DNA，具體操作按照試劑盒說明書進行，并以提取的DNA作為PCR的模版。根據(jù)植物乳桿菌YM4-3的全基因組測序結果設計引物luxS-F與luxS-R，引物序列、PCR擴增體系組分及擴增條件如下：

(1)引物序列：

引物1：luxS-F：5’-CGAAGCTTTGGCTAAAGTAGAAAGTT-3’

引物2：luxS-R：5’-ATTCTCGAGCTATTCAACGACTTTGCG-3’

(2)PCR擴增體系(50μL)組成如下：

(3)PCR擴增條件：

95℃預變性3min；95℃變性15s；56℃退火15s；72℃延伸50s；循環(huán)30次；最后72℃延伸5min。反應完成后取5μL，在1％瓊脂糖凝膠中進行電泳分析。

2、PCR產(chǎn)物的膠回收純化

(1)制備1.0％瓊脂糖凝膠；

(2)將待分離純化的PCR產(chǎn)物點樣電泳，于適當位置停止電泳；

(3)在紫外燈下切下含有目的片斷的凝膠，轉移到1.5mL的潔凈的離心管中；

(4)用多功能DNA純化試劑盒(北京百泰克生物技術有限公司)進行目的片段的回收，回收方法按說明書進行操作；

(5)1％瓊脂糖凝膠中進行電泳分析。

回收結果如圖1所示,得到了大小正確的條帶。

3、重組表達載體的構建

(1)TA克隆驗證序列的準確性及酶切

使用pMD18-T載體進行TA克隆，連接體系為0.5μL pMD18-T載體，3μL純化后的luxS基因片段與2.5μL的T4DNA連接酶，16℃連接過夜，獲得重組質粒pMD18-luxS。熱刺激法轉化分別將兩種重組質粒導入感受態(tài)細胞大腸桿菌DH5α中，涂布于Amp-LB平板37℃過夜培養(yǎng)，挑取單克隆PCR驗證轉化結果后，陽性轉化子直接送測序公司，使用pMD18-T的通用引物進行測序。

(2)載體與目的片段的連接

使用限制性內切酶HindⅢ和XhoⅠ分別對pET28-a載體和測序正確的PCR純化產(chǎn)物進行同步酶切，分別獲得5’和3’末端分別帶有HindⅢ和XhoⅠ粘性末端的luxS基因片段和pET28-a載體大片段，瓊脂糖凝膠電泳后分別進行回收。按照目的基因：載體＝5：1(摩爾比)加樣，然后加入T4DNA連接酶在16℃連接16h；向100μL大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中加入10μL連接產(chǎn)物；混合液冰浴30min，42℃熱刺激90s后冰浴2min，加入900μL的LB培養(yǎng)基；37℃搖床200rpm培養(yǎng)60min使菌體復蘇；培養(yǎng)結束后，5000rpm離心2min，棄去大部分上清，重懸沉淀涂布在含有卡那霉素(Kan)抗性的LB平板上；37℃過夜培養(yǎng)，挑取單菌落，接種到含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)；PCR后測序驗證轉化結果；測序正確后，即得含有重組表達載體pET28a-luxS大腸桿菌。

(3)提取正確的重組質粒并導入表達載體

使用高純質粒小量制備試劑盒(北京百泰克生物技術有限公司)從驗證成功的大腸桿菌DH5α轉化子中提取重組質粒，并使用化學轉化法將重組表達載體pET28a-luxS轉化至大腸桿菌BL21(DE3)中，具體方法為：向100μL大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞中加入2μL重組表達載體pET28a-luxS，混合均勻；將反應混合液置于冰上30min，42℃熱刺激90s后馬上置于冰上2min，加入900μL的LB液體培養(yǎng)基；37℃搖床200rpm培養(yǎng)60min使菌體復蘇；培養(yǎng)結束后，5000rpm離心2min，棄去大部分上清，重懸沉淀涂布在含有卡那霉素的LB平板上；37℃過夜培養(yǎng)，挑取單菌落，在含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，進行菌落PCR，測序驗證。

4、S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的表達

挑取BL21-pET-luxS單菌落接入含有卡那霉素(50μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃過夜培養(yǎng)。將過夜培養(yǎng)物按照1％接種量接種于500mL含有卡拉霉素(50μg/ml)的LB培養(yǎng)基，37℃振蕩(150rpm)培養(yǎng)，至培養(yǎng)物的OD₆₀₀值達到0.6-0.8左右，向培養(yǎng)物中加入IPTG(終濃度為1mM)，37℃，150rpm繼續(xù)培養(yǎng)6h；5000rpm離心5min，收集菌體，用10mL的非變性鎳柱結合緩沖液(50mM NaH₂PO₄，500mM NaCl，20mM imidazole，pH8.0)重懸菌體，超聲波破碎(超聲5s，停3s，15min)后8000rpm離心10min；SDS-PAGE檢測LuxS蛋白的可溶性。通過設置未添加誘導劑IPTG的表達產(chǎn)物作為陰性對照來驗證誘導劑的作用及目的蛋白的表達情況。

(5)S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的純化條件優(yōu)化

表1不同梯度洗滌/洗脫緩沖液中imidazole濃度(mM)對純化效果的影響

采用鎳親和層析柱進行純化。優(yōu)化純化條件：非變性鎳柱結合緩沖液用于平衡純化柱體和上樣；蛋白上樣量為10mL，流速為0.1mL/min，用非變性鎳柱洗脫緩沖液Ⅰ(50mM NaH₂PO₄，500mM NaCl，100mM imidazole，pH 8.0)洗脫10個柱體積，非變性鎳柱洗脫緩沖液Ⅱ(50mM NaH₂PO₄，500mM NaCl，150mM imidazole，pH 8.0)洗脫10個柱體積，非變性鎳柱洗脫緩沖液Ⅲ(50mM NaH₂PO₄，500mM NaCl，200mM imidazole，pH 8.0)洗脫5個柱體積，去除非特異性結合的雜蛋白。用非變性鎳柱洗脫緩沖液Ⅳ(50mM NaH₂PO₄，500mM NaCl，250mM imidazole，pH 8.0)洗脫20個柱體積，收集洗脫液，SDS-PAGE檢測洗脫液中樣品純度。純化結果如圖2所示。

實施例2：S-核糖基高半胱氨酸裂解酶活性檢測

1、使用核酸蛋白分析儀測得純化后S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的濃度為LuxS 3.8mg/mL。

2、通過Ellman’s實驗檢測S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的酶活

SRH經(jīng)S-核糖基高半胱氨酸裂解酶催化生成DPD與高半胱氨酸，其中高半胱氨酸與DTNB發(fā)生反應生成黃色產(chǎn)物，在412nm處有最高吸收峰。通過測定反應產(chǎn)物在412nm處的吸光值來檢測LuxS的酶活，具體操作步驟如下：

(1)制備SRH

將購買的SAH溶解于1M的鹽酸中，濃度為10mg/ml。取SAH溶液100μL，沸水浴20min，加入等體積的1M的NaOH混勻，加入1M的PBS使得PBS的終濃度為100mM，即制成12mM的SRH，繼續(xù)加入100mM PBS使得SRH終濃度為10mM。

(2)S-核糖基高半胱氨酸裂解酶催化SRH生成DPD與高半胱氨酸

反應體系1如下：

37℃水浴15min后，加入190μL 100mM PBS(pH 7.2，0.1mM乙二胺四乙酸(EDTA))與100μL 5mM的DTNB，412nm處測量吸光值。10μL ddH₂O，190μL 100mM PBS(pH 7.2，0.1mM EDTA)與100μL 5mM的DTNB混合液作為陰性對照。

結果實驗組反應液變成了黃色，且在412nm處的吸光值較陰性對照要高，證明純化的S-核糖基高半胱氨酸裂解酶能催化SRH生成高半胱氨酸。

3、檢測AI-2的活性

Ellman’s實驗僅能證明純化的S-核糖基高半胱氨酸裂解酶能催化SRH生成高半胱氨酸，要驗證能否生成我們需要的信號分子AI-2，需要進行生物檢測，具體方法如下：

(1)配制AB培養(yǎng)基：0.3M NaCl，0.05M MgSO₄，0.2％酪蛋白氨基酸溶于水中，使用KOH調節(jié)pH至7.5，高壓蒸汽滅菌；滅菌后，每100mL加入無菌的1M磷酸鉀緩沖液(pH 7.0)1mL，0.1M L-精氨酸1mL與50％的甘油2mL，混勻即可；

(2)將保藏的哈氏弧菌BB170在新鮮的AB培養(yǎng)基中活化2代，30℃，150rpm，培養(yǎng)14h；

(3)將活化好的哈氏弧菌BB170按比例1：5000稀釋在新鮮的AB培養(yǎng)基中，然后按每份90μL加入白色不透明平底96孔板中；

(4)按照如下體系配制AI-2體外合成反應液

反應體系2：

將反應混合液37℃水浴15min，反應完成后加入450μL的10mM PBS(pH 8.0)，超濾管過濾除去LuxS蛋白，收集濾液。

(5)取10μL濾液加入含有90μL哈氏弧菌BB170培養(yǎng)液的96孔板中，30℃，60rpm培養(yǎng)3h，使用酶標儀測定發(fā)光值。

結果如圖3顯示，加入反應濾液的哈氏弧菌BB170發(fā)光值比不加濾液的陰性對照要高至少50倍，證明LuxS能催化SRH生成具有生物活性的AI-2。

4、溫度對S-核糖基高半胱氨酸裂解酶活性的影響

按照反應體系1配制反應液，分別在20℃、30℃、37℃、45℃、55℃、65℃與75℃條件下水浴15min后進行Ellman’s實驗。設定S-核糖基高半胱氨酸裂解酶在37℃時的酶活力為100％計算相對酶活。

結果如圖4所示，純化的S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的最適反應溫度為45℃。

5、金屬離子對S-核糖基高半胱氨酸裂解酶活性的影響

首先將金屬離子或表面活性劑分別與LuxS混合，在45℃條件下水浴1h。反應液中，S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的終濃度為1mg/mL，金屬離子濃度為1mM，EDTA濃度為1mM，表面活性劑濃度為1％，甘油濃度為10％。金屬離子及表面活性劑種類及影響見表1。

反應完成后加入終濃度為1mM的SRH，繼續(xù)水浴15min，完成后進行Ellman’s實驗。設定沒有金屬離子處理的LuxS蛋白活性為100％計算相對酶活。結果如表2所示。

表2不同金屬離子及有機試劑對LuxS活性的影響

從表1可知，S-核糖基高半胱氨酸裂解酶在Al³⁺、Ca²⁺和EDTA影響下活性上升，Cu²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺及10％甘油對蛋白活性有較強的抑制作用。