1.一種S-核糖基高半胱氨酸裂解酶基因重組表達(dá)載體,其特征在于,所述基因重組表達(dá)載體通過以下方法得到:限制性內(nèi)切酶HindⅢ和XhoⅠ分別對pET28-a載體和PCR擴(kuò)增出的LuxS基因純化產(chǎn)物進(jìn)行同步酶切,分別獲得帶有HindⅢ和XhoⅠ粘性末端的luxS基因片段和pET28-a載體大片段,采用瓊脂糖凝膠電泳后分別進(jìn)行回收后,luxS基因片段和pET28-a載體大片段進(jìn)行連接,得到連接產(chǎn)物,連接產(chǎn)物導(dǎo)入到大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中,大腸桿菌BL21中含有基因重組表達(dá)載體pET28a-luxS。
2.如權(quán)利要求1所述的S-核糖基高半胱氨酸裂解酶基因重組表達(dá)載體,其特征在于,所述LuxS基因來源于植物源乳酸菌。
3.如權(quán)利要求1所述的S-核糖基高半胱氨酸裂解酶基因重組表達(dá)載體,其特征在于,所述LuxS基因PCR擴(kuò)增時的引物如下:
前引物luxS-F:5’-CGAAGCTTTGGCTAAAGTAGAAAGTT-3’;
后引物luxS-R:5’-ATTCTCGAGCTATTCAACGACTTTGCG-3’。
4.一種S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的制備方法,其特征在于,所述制備方法包括構(gòu)建S-核糖基高半胱氨酸裂解酶基因重組表達(dá)載體的步驟,S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的表達(dá)步驟和S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的純化步驟;
所述S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的表達(dá)步驟如下:挑取含有基因重組表達(dá)載體pET28a-luxS的大腸桿菌單菌落接入含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)至培養(yǎng)物的OD600值達(dá)到0.6-0.8,向培養(yǎng)物中加入IPTG,繼續(xù)培養(yǎng)5~7h,離心收集菌體,用非變性鎳柱結(jié)合緩沖液重懸菌體,超聲波破碎后離心,得到S-核糖基高半胱氨酸裂解酶粗蛋白;
所述S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的純化步驟如下:S-核糖基高半胱氨酸裂解酶粗蛋白采用鎳親和層析柱進(jìn)行純化,先用非變性鎳柱洗脫緩沖液Ⅰ洗脫,然后采用非變性鎳柱洗脫緩沖液Ⅱ洗脫,再用非變性鎳柱洗脫緩沖液Ⅲ洗脫,去除非特異性結(jié)合的雜蛋白;最后用非變性鎳柱洗脫緩沖液Ⅳ,收集洗脫液,SDS-PAGE檢測洗脫液中樣品純度,得到純化后的S-核糖基高半胱氨酸裂解酶;
所述緩沖液Ⅰ為50mM NaH2PO4,500mM NaCl,90~110mM imidazole,pH 7.5~8.5;
所述緩沖液Ⅱ?yàn)?0mM NaH2PO4,500mM NaCl,140~160mM imidazole,pH 7.5~8.5;
所述緩沖液Ⅲ為50mM NaH2PO4,500mM NaCl,190~210mM imidazole,pH 7.5~8.5;
所述緩沖液Ⅳ為50mM NaH2PO4,500mM NaCl,250~290mM imidazole,pH 7.5~8.5。
5.如權(quán)利要求4所述的S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的制備方法,其特征在于,所述S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的表達(dá)步驟具體操作如下:挑取含有基因重組表達(dá)載體pET28a-luxS的大腸桿菌單菌落接入含有卡那霉素45~55μg/ml的LB液體培養(yǎng)基中,將培養(yǎng)物按照0.8~1.2%接種量接種于500mL含有卡拉霉素45~55μg/ml的LB培養(yǎng)基,36~38℃振蕩培養(yǎng),至培養(yǎng)物的OD600值達(dá)到0.6-0.8,向培養(yǎng)物中加入IPTG至0.8~1.2mM,36~38℃繼續(xù)培養(yǎng)6~8h;4000~6000rpm離心5~7min,收集菌體,用非變性鎳柱結(jié)合緩沖液重懸菌體,超聲波破碎后離心,得到S-核糖基高半胱氨酸裂解酶粗蛋白;
所述非變性鎳柱結(jié)合緩沖液成分如下:50mM NaH2PO4,500mM NaCl,20~50mM imidazole,pH7.5~8.5。
6.如權(quán)利要求4所述的S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的制備方法,其特征在于,所述S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的純化中緩沖液Ⅰ洗脫9~11個柱體積,緩沖液Ⅱ洗脫9~11個柱體積,緩沖液Ⅲ洗脫4~6個柱體積,緩沖液Ⅳ洗脫18~22個柱體積。
7.如權(quán)利要求4所述的S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的制備方法,其特征在于,所述S-核糖基高半胱氨酸裂解酶在Al3+、Ca2+和EDTA影響下活性上升,在Cu2+、Ni2+、Zn2+及甘油作用下活性下降。
8.如權(quán)利要求4~7任一所述的制備方法制得的S-核糖基高半胱氨酸裂解酶在合成AI-2及其AI-2類似物方面中的應(yīng)用。