花生S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因AhSAMS及蛋白與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物基因技術(shù)領(lǐng)域，特別設(shè)及花生S-腺巧甲硫氨酸合成酶基因 AhSAMS，花生S-腺巧甲硫氨酸合成酶蛋白，還設(shè)及花生S-腺巧甲硫氨酸合成酶基因 AhSAMS 及花生S-腺巧甲硫氨酸合成酶蛋白的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 花生是世界范圍內(nèi)廣泛種植的油料和經(jīng)濟(jì)作物，是全球最重要的油料作物之一。 中國是世界上最大的花生生產(chǎn)和出口大國，花生種植面積在我國農(nóng)作物中排在第屯位，農(nóng) 業(yè)產(chǎn)值排在第五位，年總產(chǎn)已達(dá)1500多萬噸，占世界花生總產(chǎn)的43%，出口量占世界的40% W上。然而，我國的油料作物生產(chǎn)雖然發(fā)展較快，但仍跟不上人民生活水平的不斷提高。目 前，我國年需植物油的自給率不足35%，供需矛盾突出。高溫強(qiáng)光是花生生長過程中必須面 臨的非生物脅迫之一，特別是每年的屯、八月份，高溫強(qiáng)光嚴(yán)重的影響了花生的產(chǎn)量。
[0003] 1952年Cantoni發(fā)現(xiàn)S-腺巧甲硫氨酸（S-adenosylA-methionine ,SAM)。它參與多 種生化反應(yīng)，是生物體內(nèi)重要的代謝產(chǎn)物。SAM具有轉(zhuǎn)甲基、轉(zhuǎn)氨丙基和轉(zhuǎn)硫等多種生理作 用，運(yùn)些反應(yīng)對細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能影響都至關(guān)重要。研究表明：SAM是生物合成乙締 W及多胺 的前體。眾所周知乙締是植物生長調(diào)節(jié)劑參與調(diào)控植物的多種生理生化反應(yīng)，而多胺是生 物體代謝過程中產(chǎn)生的一類次生物質(zhì)，在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育、控制形態(tài)建成、提高植物抗逆 性、延緩衰老等方面具有重要作用。S-腺巧甲硫氨酸合成酶（S-adenosyl-kmethionine synthetase,SAMS)調(diào)節(jié)著SAM的合成速率，有些SAMS基因是組成型表達(dá)的，而有些卻是受發(fā) 育時(shí)期或者一些環(huán)境因子所調(diào)節(jié)的，比如鹽脅迫、干旱脅迫、滲透脅迫等。最近研究表明，花 生中SAMS可能和植物抗逆性有關(guān)，但該基因國內(nèi)外尚無報(bào)道，它在植物逆境生理和衰老生 理過程中的調(diào)節(jié)作用尚不清楚。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決W上現(xiàn)有技術(shù)中未有花生SAMS基因及其在植物逆境生理和衰老生理過 程中的調(diào)節(jié)作用的報(bào)道的問題，本申請?zhí)峁┝嘶ㄉ鶶-腺巧甲硫氨酸合成酶基因 AhSAMS。
[0005] 本發(fā)明還提供了花生S-腺巧甲硫氨酸合成酶蛋白。
[0006] 本發(fā)明還提供了花生S-腺巧甲硫氨酸合成酶基因 AhSAMS及蛋白的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明是通過W下步驟得到的：
[000引花生S-腺巧甲硫氨酸合成酶基因 AhSAMS,其堿基序列如序列表中序列1所示。
[0009] 含有花生S-腺巧甲硫氨酸合成酶基因 AhSAMS的質(zhì)粒或載體。
[0010] 所述的花生S-腺巧甲硫氨酸合成酶基因 AhSAMS編碼合成的花生S-腺巧甲硫氨酸 合成酶，其蛋白質(zhì)序列如序列表中序列2所示。
[0011] 所述的花生S-腺巧甲硫氨酸合成酶基因 AhSAMS或所述的花生S-腺巧甲硫氨酸合 成酶在與巧調(diào)素蛋白互作中的應(yīng)用。
[0012] 所述的花生S-腺巧甲硫氨酸合成酶基因 AhSAMS或所述的花生S-腺巧甲硫氨酸合 成酶在花生抗干旱、抗高鹽、抗ΑΒΑ和抗高溫強(qiáng)光脅迫中的應(yīng)用。
[0013] 所述的應(yīng)用，在干旱脅迫下，花生S-腺巧甲硫氨酸合成酶基因 AhSAMS的轉(zhuǎn)錄物在 處理5天后積累達(dá)到最大值。
[0014] 所述的應(yīng)用，在鹽脅迫后，花生S-腺巧甲硫氨酸合成酶基因 AhSAMS的表達(dá)在處理1 天后達(dá)到峰值。
[0015] 所述的應(yīng)用，在ΑΒΑ處理后，花生S-腺巧甲硫氨酸合成酶基因 AhSAMS的mRNA水平在 處理48小時(shí)后達(dá)到最高水平。
[0016] 所述的應(yīng)用，在高溫強(qiáng)光脅迫下，花生S-腺巧甲硫氨酸合成酶基因 AhSAMS的轉(zhuǎn)錄 物在處理2小時(shí)后積累達(dá)到最大值。
[0017] 所述的應(yīng)用，外源施巧促進(jìn)花生S-腺巧甲硫氨酸合成酶基因 AhSAMS的表達(dá)，提高 植物的抗逆性。
[0018] 巧素是植物生長發(fā)育必須的營養(yǎng)元素之一，它參與了植物從發(fā)芽到生長分化開花 結(jié)果的全過程，在植物體內(nèi)巧離子的主要作用是：（1)營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)微管的形成。（2)細(xì)胞 壁的結(jié)構(gòu)組織和膜的流動(dòng)性。（3)減輕鹽脅迫的毒害作用。（4)促進(jìn)花粉管的生長和伸長?；?生是需巧較多的作物，對巧元素的需求數(shù)量僅次于氮，高于憐，與鐘相當(dāng)?；ㄉ鼻蓵r(shí)，種子 發(fā)育受阻，果殼組織疏松，空果、釉果及爛果增加，產(chǎn)量明顯下降。研究化對花生逆境生理 的調(diào)控機(jī)制對明確花生生長發(fā)育的巧素利用規(guī)律、保證花生高產(chǎn)具有非常重要的意義。
[0019] 本發(fā)明的有益效果：
[0020] 1)首次披露花生S-腺巧甲硫氨酸合成酶基因 AhSAMS的堿基序列及表達(dá)蛋白，對研 究花生逆境生理調(diào)控機(jī)制、提高花生產(chǎn)量具有非常重要的戰(zhàn)略意義；
[0021] 2)首次掲示化27CaM信號途徑與花生多胺合成途徑之間的相互作用關(guān)系，闡明花 生多胺合成的巧離子信號調(diào)控機(jī)制。
[0022] 3)根據(jù)該理論基礎(chǔ)可指導(dǎo)明確花生的巧元素吸收與利用規(guī)律，挖掘調(diào)控±壤有效 巧供給能力。
【附圖說明】
[0023] 圖1是本發(fā)明花生CaM基因的分離及pGBKT7(BD)載體的構(gòu)建，其中A:AhCaM全長 cDNA的PCR擴(kuò)增鑒定結(jié)果;B: pG服T7-CaM酶切鑒定結(jié)果，
[0024] 圖2是本發(fā)明蛋白質(zhì)文庫的建立圖譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中A:RNA提取;B:mRNA的分離;C: 合成二鏈;D:二鏈的純化，
[0025] 圖3是本發(fā)明利用酵母雙雜交篩選與CaM互作蛋白的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中A:經(jīng)X-gluc檢 測克隆;B:與CaM互作蛋白的酵母質(zhì)粒PCR篩選，
[00%]圖4是CaM和SAMS在酵母中的互作驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果，
[0027]圖5是巧光素酶方法驗(yàn)證CaM和SAMS互作的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，
[002引圖6是不同逆境脅迫下AhSAMS的表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，
[00巧]圖7是不同巧濃度處理后AhSAMS基因的表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，
[0030]圖8是外源施巧提高轉(zhuǎn)基因株系中游離多聚胺含量實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
[0032] 實(shí)施例1
[0033] 本發(fā)明通過W下實(shí)驗(yàn)方法獲得本發(fā)明所述的花生AhSAMS基因。
[0034] -、酵母雙雜交
[0035] 1、實(shí)驗(yàn)所用試劑
[0036] 酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)所用試劑盒：BD Matchmake;rTM LibraiT Constructionfe Screening Κi ts購自C1 ontech公司。該實(shí)驗(yàn)中所用試劑參照產(chǎn)品說明書。
[0037] 2、構(gòu)建pG服T7 (BD)表達(dá)載體pG服T7-CaM
[003引提取花生葉片RNA后經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，分別用含有Ndel位點(diǎn)的5'引物1(5/- CATATGATGGCGGATCCGCTCACC-3')和帶有 PstI 酶切位點(diǎn)的3' 引 物2(5'- CTGCAGCTAGGCCATCATG ACCTTG-3')，從花生cDNA中擴(kuò)增出花生葉片中巧調(diào)素基因 AhCaM全 長(Accession number :AY517930)，并通過測序驗(yàn)證擴(kuò)增片段的正確性。通過酶切、連接，構(gòu) 建pG服T7-CaM載體。
[0039] (1) WOiM全長cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，體系如下：
[0044] 將PCR擴(kuò)增所得片段AhCaM連入克隆載體pMD 18-T Simple得到pMD Simple-CaM， 酶切鑒定進(jìn)行序列測定；
[0045] (2)用限制性內(nèi)切酶NdeI、PstI雙酶切質(zhì)粒pMD Simple-OiM和pG服T7(BD)載體；
[0046] (3)回收:進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切下含有化Μ片段和pGBKT7(BD)載體片段的凝膠；
[0047] (4)連接:將酶切得到的化Μ片段和pG服T7(BD)載體片段用連接酶進(jìn)行連接，得到 pG服T7-CaM，連接體系為：
[004引
[0049] 加出0至總體積化yL，混勻后4-16 °C連接過夜；
[00加](5)轉(zhuǎn)化:取化L連接產(chǎn)物(pGBKT7-CaM)轉(zhuǎn)化E. coli D冊α感受態(tài)細(xì)胞，菌液涂布于 含卡那霉素的固體培養(yǎng)基平板上；
[0051 ] (6)重組子的篩選:對長出的菌落進(jìn)行菌落PCR，并進(jìn)行質(zhì)粒(pG服T7-CaM)的Ndel、 PstI雙酶切鑒定。
[00對上述操作用Nde巧日PstI將pMD Simple-CaM質(zhì)粒和pG服T7(BD)載體分別進(jìn)行雙酶 切，回收后將含有AhCaM基因編碼區(qū)的全長cDNA插入表達(dá)載體pGBKT7(BD)，構(gòu)成表達(dá)載體 pGBKT7-CaM。將構(gòu)建好的表達(dá)載體，分別用Ndel和PstI雙酶切鑒定（如圖1所示）和測序，結(jié) 果證明pG服T7-CaM表達(dá)載體已構(gòu)建成功。
[0053] 3、乙酸裡法制備并轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞
[0054] ^4(3法制備酵母感受態(tài)細(xì)胞(￥2服〇1(1和￥187):首先從-80°(：冰箱取出冰存的酵母 菌株，取一小部分涂在YPDA固體培養(yǎng)基上，放入3(TC培養(yǎng)箱中直至菌落長出（大約3天）。
[0055] (1)挑單菌落(直徑約為2-3mm)于含3mL YP