DA液體培養(yǎng)基中；
[0化6] (2)3(TC振蕩培養(yǎng)化；
[0化7] (3)將化L菌液轉(zhuǎn)至含有50mL YPDA培養(yǎng)基的250mLS角瓶中；
[0化引 （4)30°C ,230-250巧m轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)16-2化(006日日值達(dá)0.15-0.3);
[0化9] (5)室溫700xg 離屯、5min;
[0060] (6)去上清aOOmL YPDA重懸菌體；
[0061] (7)30°C 培養(yǎng) 3-化(0〇6〇〇 = 0.4-〇.5);
[0062] (8)室溫700xg 離屯、5min;
[0063] (9)去上請(qǐng)，60mL dd出0重懸菌體；
[0064] (10)室溫700xg 離屯、5min;
[0065] (11)去上請(qǐng)，3mL l.lxTE/LiAc溶液重懸菌體；
[0066] (12)將菌液分裝至兩個(gè)1.5mL離屯、管中（每管1.5mL);
[0067] (13)高速旋轉(zhuǎn) 15s;
[006引 （14)去上請(qǐng)，600化l.lxTE/LiAc溶液重懸菌體。
[0069] 注:感受態(tài)細(xì)胞最好現(xiàn)用現(xiàn)配，但室溫放置數(shù)小時(shí)對(duì)感受態(tài)細(xì)胞的性能影響不大 4、酵母感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化
[0070] (1)取50化酵母感受態(tài)細(xì)胞化化old)于離屯、管中，然后加入50化herring test carrier DM,5化pG服T7-CaM融和基因質(zhì)粒，500化陽(yáng)G/LiAc Solution,吸打混勻；
[0071 ] (2) 30°C培養(yǎng)30min，每隔lOmin輕輕混勻一次；
[0072] (3)每管中加入20化DMS0，混合均勻，42 °C水浴45min，每隔15min混勻一次；
[0073] (4)高速離屯、15s，去上清，ImL YPD Plus Liquid Medium重懸菌體；
[0074] (5)30°C培養(yǎng) 90min;
[0075] (6)高速離屯、15s，去上清，lmL NaCl(0.9%)溶液重懸，輕輕擊打混勻；
[0076] (7)取1(Κ)化涂在相應(yīng)的SD平板上；
[0077] (8)30°C倒置培養(yǎng)2-4天，直至菌斑長(zhǎng)出。
[0078] 5、轉(zhuǎn)錄活性及毒性的驗(yàn)證 [00巧]5.1轉(zhuǎn)錄活性驗(yàn)證
[0080] (1)小量轉(zhuǎn)化法將pG服T7-CaM表達(dá)載體轉(zhuǎn)入酵母YsHGold中。將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂在下列 培養(yǎng)基中：
[0081 ] SD/-T 巧 A-a-Gal
[0082] SD/-His/-Trp/x-a-Gal
[0083] SD/-Ade/-Trp/x-a-Gal
[0084] 同時(shí)做陰性對(duì)照：即將空載體pG服T7(BD)轉(zhuǎn)入酵母YsHGold。
[0085] (2)分析結(jié)果：
[00化]如果轉(zhuǎn)化克隆呈白色并且在SD/-His/-T巧或SD/-Ade/-T巧培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)，說(shuō) 明誘巧蛋白單獨(dú)不能轉(zhuǎn)錄激活報(bào)告基因的表達(dá)，誘巧蛋白失活。如果轉(zhuǎn)化克隆呈藍(lán)色并且 在SDAHis/-!'巧或SQAAde/-!'巧上能夠呈現(xiàn)背景生長(zhǎng)，則可W通過(guò)在選擇培養(yǎng)基中加入3- AT來(lái)抑制其背景的生長(zhǎng)或者是在文庫(kù)篩選時(shí)選用-Ade/-His/-Leu/-T巧四缺培養(yǎng)基來(lái)進(jìn)行 選擇。如果誘巧蛋白在-HisW及-Ade培養(yǎng)基上能呈現(xiàn)背景生長(zhǎng)，則用此誘巧蛋白很難進(jìn)行 文庫(kù)篩選。
[0087] 結(jié)果顯示：小量轉(zhuǎn)化法將pG服T7-CaM表達(dá)載體轉(zhuǎn)入酵母YsHGold中。將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂 在上述不同培養(yǎng)基中，在SD/^-TYp/x-a-Gal培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)但不變藍(lán)，而在SD/-His/- TYp/x-a-Ga巧日SD/-Ade/-Trp/x-a-Gal培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)，說(shuō)明誘巧蛋白單獨(dú)不能轉(zhuǎn)錄激 活報(bào)告基因的表達(dá)。5.2基因毒性的驗(yàn)證
[0088] 小量法pGBKT7-CaM表達(dá)載體和空載體pG服T7 (BD)轉(zhuǎn)入酵母Y2HG01 d中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn) 物涂在SD/-化P培養(yǎng)基中，3(TC培養(yǎng)3天。比較轉(zhuǎn)化誘巧基因的細(xì)胞和轉(zhuǎn)化空載體的細(xì)胞在 液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況，如果誘巧菌株生長(zhǎng)明顯緩慢，則說(shuō)明該誘巧蛋白可能對(duì)酵母細(xì) 胞是有毒性的。具體方法如下：
[0089] (1)分別調(diào)取單克?。?-3mm)于50mL液體SD/-T巧培養(yǎng)基中；
[0090] (2)30°C ,250-270巧m振蕩培養(yǎng) 16-2地；
[0091] (3)測(cè)培養(yǎng)液的OD600，正常值OD600 > 0.8。如果OD600明顯小于0.8，則說(shuō)明誘巧蛋白 對(duì)酵母細(xì)胞有毒性。
[0092] 結(jié)果如下：分別調(diào)取單克隆（2-3mm)于50mL液體SD/-化P培養(yǎng)基中，250巧m振蕩培 養(yǎng)2化后測(cè)轉(zhuǎn)入pG服T7-CaM表達(dá)載體的培養(yǎng)液OD600為1.0。說(shuō)明該誘巧蛋白對(duì)酵母細(xì)胞是沒(méi) 有毒性的。
[0093] 6、花生葉片高溫強(qiáng)光蛋白質(zhì)文庫(kù)的建立
[0094] (1)材料處理
[00M]挑選大小一致，巧粒飽滿的花生種子花育22在28Γ濕潤(rùn)的條件下催芽2d，然后挑 選發(fā)芽較好的花生種子，播種于培室直徑為25cm的花盆中，培養(yǎng)室內(nèi)光照強(qiáng)度為300μπιο1 · m2 · S-1，濕度60%，光照/黑暗周期為14/1化。培養(yǎng)至25天左右選取生長(zhǎng)一致的花生，將倒Ξ 葉葉片懸浮于40°C不同處理的溶液上，上方罩有帶有隔熱水槽，對(duì)其進(jìn)行強(qiáng)光處理，光照強(qiáng) 度為1200皿〇1 · m2 · S-1，共處理地，取樣。
[0096] (2)RNA提取:利用RNeasy Plant Mini Kit提取花生葉片總RNA。
[0097] (3)mRNA 的分離
[009引 （4)用Oligo(dT)引物合成cDNA第一鏈
[0099] (5)用長(zhǎng)距離PCR(LD-PCR)方法合成雙鏈cDNA
[0100] (6)用抓CHROMA SPIN? TE-400柱子進(jìn)行雙鏈cDNA的純化
[0101] (7)文庫(kù)的建立
[0102] 曰、小量轉(zhuǎn)化法將步驟(6)中得到的20化雙鏈cDNA轉(zhuǎn)入酵母Y187中；
[0103] b、按照轉(zhuǎn)化第2步，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞用15mL 0.9%的NaCl懸浮；
[0104] C、分別稀釋10倍、100倍后吸取10化L涂在100mm SD/-Leu固體培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng) 3-4天后查數(shù)文庫(kù)的單克隆數(shù)量；
[0105] d、將剩下液體涂在100個(gè)150mm的SD/-Leu固體培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)3-4天；
[0106] e、將100個(gè)培養(yǎng)基上的單克隆用預(yù)冷的液體培養(yǎng)基收集在滅過(guò)菌的瓶中（大約 500mL)，然后將其分裝，-80°C條件下保存。
[0107] (8)酵母融合法篩選與誘巧蛋白互作的蛋白
[010引曰、挑取步驟4中得到的單克隆菌株(Y2HGold[pGBKT7-CaM])于50mL SD/-T巧液體 培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)至OD600為0.8(16-2化）；
[0109] b、1000g離屯、5min，倒掉上清，用4-5mL SD/-T巧液體培養(yǎng)基懸浮沉淀；
[0110] C、吸取4-5mL與ImL制備好的cDNA文庫(kù)混合于化滅過(guò)菌的Ξ角瓶中；
[0111] d、加入45mL 2x YPDA/Kan液體培養(yǎng)基；
[0112] 6、30°(：緩慢振蕩（30-50巧111)培養(yǎng)20-2地；
[0113] f、1000g離屯、lOmin，用50mL 0.5x YPDA/Kan沖洗化Ξ角瓶后輕輕吸打，懸浮沉淀；
[0114] g、1000g離屯、lOmin，倒掉上清，用lOmL 0.5x YPDA/Kan懸浮細(xì)胞；
[0115] h、分別稀釋10、100、1000、10000倍后涂在100mm固體培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)3-5天；
[0116] · SD/-T巧
[0117] · SD/-Leu
[011 引· SD/-Leu/-T巧（DD0)
[0119] i、將剩余培養(yǎng)物分別涂在150mm DD0/X/A培養(yǎng)基上(50-55個(gè)），20化17個(gè)，30°(：培 養(yǎng)3-4天；
[0120] j、將在4天內(nèi)長(zhǎng)出的變藍(lán)菌落挑出進(jìn)行下一步分析。
[0121] 用RNeasy Plant Mini Kit提取花生總RNA，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，28S和18S 帶型完整、清晰（圖2A)，表明提取的RNA純度較高，可W進(jìn)行下一步的mRNA分離。用Qiagen公 司生產(chǎn)的mRNA分離試劑盒進(jìn)行mRNA分離（圖2B)，之后用oligo(dT)作引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 和LD-PCR擴(kuò)增得到雙鏈cDNA，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（圖2C)，片斷大小范圍主要集中在 500bp-2000bp，構(gòu)建的文庫(kù)符合要求。將過(guò)柱純化的雙鏈cDNA(圖2D)轉(zhuǎn)入制備好的Y187酵 母菌株中，在SD/-Leu固體培養(yǎng)基（lOOx 150mm plates)上培養(yǎng)3-5天后，用液體YPDA培養(yǎng)基 將所得到的所有單克隆收集，計(jì)數(shù)分析，達(dá)到要求。
[0122] 7、用融合法(Mating)篩文庫(kù)
[0123] 為了更深入研究巧信號(hào)系統(tǒng)對(duì)花生光合能力及生長(zhǎng)發(fā)育的影響，本發(fā)明用酵母雙 雜交的方法去篩選與巧調(diào)素互作的蛋白。首先構(gòu)建好誘巧蛋白的pG服T7-CaM轉(zhuǎn)