一種紫芽茶樹R2R3-MYB（CsMYB6A）基因克隆及載體構建方法以及應用
【技術領域】
[0001 ]本發(fā)明設及一種紫芽茶樹R2R3-MYB(CsMYB6A)基因克隆及載體構建方法W及應 用，屬于植物基因工程技術領域。
【背景技術】
[0002] 紫芽茶樹是一種稀有的特色茶樹資源，芽葉呈現(xiàn)紫色、紅色或紅紫色，其色澤是因 其花青素含量較高所致。長期W來，紅紫色芽葉因其飲用品質欠佳而被忽略，科技人員在選 育茶樹品種和制定茶樹栽培技術措施時甚至把減少紫色芽葉作為目標之一。但隨著紅紫芽 茶樹資源創(chuàng)新利用研究的深入，其主要組分的醫(yī)學保健功能逐漸被闡明，特色紅紫芽茶樹 品種的選育和高花青素茶產(chǎn)品開發(fā)利用愈來愈受人們關注，相關研究在近年得到迅速發(fā) 展。
[0003] 花青素(Anthocyanidin)，又稱花色素，是自然界一類廣泛存在于植物中的水溶性 天然色素，屬類黃酬化合物。也是植物花瓣中的主要呈色物質，水果、蔬菜、花弁等五彩窠紛 的顏色大部分與之有關?；ㄇ嗨卮嬖谟谥参锛毎囊号葜?，可由葉綠素轉化而來?；ㄇ嗨厥?一種強有力的抗氧化劑，它能夠保護人體免受一種叫做自由基的有害物質的損傷;花青素 對癌癥、屯、血管和神經(jīng)性疾病預防具有重要的作用;還能夠增強血管彈性，改善循環(huán)系統(tǒng)和 增進皮膚的光滑度，抑制炎癥和過敏，改善關節(jié)的柔初性。目前食品工業(yè)上所用的色素多為 合成色素，幾乎都有不同程度的毒性，長期使用會危害人的健康，因此天然色素就越來越引 起了科研領域的關注，富含花青素的食品、飲料的開發(fā)研究也就越來越受到重視。
[0004] 花青素的生物合成受兩類基因調控:一類是結構基因，編碼花青素生物合成的催 化酶；另一類是轉錄因子，通過調控結構基因的表達，在轉錄水平上參與植物顏色的形成。 轉錄調節(jié)是花青素生物合成途徑中調節(jié)其結構基因表達的重要環(huán)節(jié)之一。轉錄因子與結構 基因啟動子的被識別順式作用元件結合，單獨或者協(xié)同調節(jié)花青素生物合成途徑中結構基 因，從而有效控制植物體內花青素的合成。MYB基因是最大的植物轉錄因子家族之一，也是 花青素生物合成途徑中必不可少的調節(jié)因子。MYB編碼的蛋白具有一個堿性N-端，含有1-3 個保守的DNA結合域(Μ1?結構域），根據(jù)結構域的個把MB分為3類:一個結構域蛋白（R3)、兩 個重復結構域蛋白（R2R3)、Ξ個重復結構域蛋白（R1R2R3)，其中R2R3結構域MYB家族主要參 與調控花青素和類黃酬生物合成途徑。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種紫芽茶樹R2R3-MYB(CsMYB6A)基因克隆及載 體構建方法。
[0006] 本發(fā)明是通過W下技術方案來實現(xiàn)的。
[0007] 一種紫芽茶樹R2R3-MYB(CsMYB6A)基因克隆及載體構建方法，步驟包括：
[000引（1)設計特異引物
[0009] CsMYB6A-F：ATGGACATTGTTTGTTGT；
[0010] CsMYB6A-R：TCATTCATCACCTAACAGATCCC；
[0011] CsMYB6A-attb-F：
[0012] GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCCACCATGGACATTGTTTGTTGT；
[0013] CsMYB6A-attb-R：
[0014] GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTCATTCATCACCTAACAGATCCC；
[001引 w茶樹cDNA為模板，將attBl接頭序列加至CsMYB6A基因上游引物的5/端，將attB2 接頭序列加至CSMYB6A基因下游引物的5/端；
[0016] (2)w測序正確的帶有CSMYB6A基因的質粒為模板進行高保真PCR，回收帶有attB 接頭序列的目的基因產(chǎn)物；
[0017] (3)進行BP反應，水浴后轉化至化ans-Tl感受態(tài)，涂布含有慶大霉素的LB固體培養(yǎng) 基上；
[0018] (4)測序正確后提取質粒進行LR反應；
[0019] (5)測序正確后抽提質粒pGWB5-CsMYB6A-GFP，然后利用電轉法將該載體轉入根癌 農桿菌EHA105,在含有壯觀霉素和卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上進行篩選，倒置培養(yǎng)，利用菌 落PCR鑒定陽性克隆。
[0020] 進一步地，（3)BP反應的體系為：pD0NR207Vector，75ng;回收產(chǎn)物，25~50ng;BP Clonase? enzyme mix,0.扣1^;加水補至扣L。
[0021] 進一步地，（4)LR反應的體系為：pGWB5Vector，75ng; pD0NR207-CsMYB6A，25~ 50ng;LR Clonase? enz;yme 1]1；[義，0.扣1^;加水補至扣L025°C水浴化后轉化至Trans-Tl感受 態(tài)，涂布含有卡那霉素(50mg/L)的LB固體培養(yǎng)基上。
[0022] 進一步地，茶樹cDNA，其提取的步驟包括：
[002引（1)茶葉組織加等量的PVPP，用液氮研磨至細粉末；
[0024] (2)將上述粉末用槍頭轉移至離屯、管中，加入Fruit-mate for RNA purif ication，用槍頭攬拌使粉末與溶液充分混合，裂解18-22min，待裂解液呈透明狀， 12000g，4°C 離屯、5min;
[0025] (3)吸取上清液，平均分至2個離屯、管中，分別加入等體積的RNAiso Plus,蓋緊離 屯、管蓋，用力震蕩，待溶液充分乳化后，室溫靜置5min;
[0026] (4)分別加入1/5總體積量的氯仿，用力震蕩混勻，室溫靜置5min，12000g 4°C離屯、 15min；
[0027] (5)吸取上清轉移至新的離屯、管中，加入等體積的異丙醇，上下顛倒混勻，室溫靜 置 10min，12000g 4°C離屯、lOmin;
[0028] (6)棄上清，緩慢沿離屯、管壁加入1ml 75%乙醇，輕彈后，12000g 4°C離屯、5min，棄 上清保留沉淀，重復(6)至少3次；
[0029] (7)棄上清保留沉淀后，吸取多余的乙醇，真空干燥，加適量RNase-Free水，用 RNase-Free槍頭輕輕吹打沉淀，放在-80°C保存；
[0030] (8)用核酸定量儀檢測提取的總RNA的含量和質量。
[0031] 一種紫芽茶樹R2R3-MYB(CsMYB6A)基因克隆的應用方法，步驟包括：
[0032] (1)取25ml含大觀霉素和卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，接入1ml活化后的含有目的基 因的農桿菌EHA105-pCB2004-CsMYB6A，28°C搖至菌液渾濁，OD值在ο. 6左右；
[0033] (2)4°C，5000r/s 離屯、20min;
[0034] (3)棄上清，加入30ml含19.6mg/L的AS的1/2MS，將沉淀攬起混勻，4Γ，5000r/s離 屯、20min;
[00巧](4)棄上清，再次加入含AS的1/2MS溶液，調0D值至0.6;
[0036] (5)將預培養(yǎng)好的葉片丟進菌液侵染15min，期間戳破葉片，W利于農桿菌通過傷 口進入葉片基因組。之后將葉片放于鋪有濾紙的平皿中，干燥；
[0037] (6)將干燥后的小葉片平鋪在共培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)3天；
[0038] (7)共培養(yǎng)完成后取出葉片，用400mg/L簇節(jié)青霉素沖洗葉片表面菌體，反復清洗 Ξ次，最后用無菌水沖洗，吸干表面水分，置于含有25mg/L草錠麟的生芽培養(yǎng)基中誘導芽的 分化，期間持續(xù)用200mg/L簇節(jié)青霉素和400mg/L頭抱嚷目虧交替使用脫菌；
[0039] (8)反復脫菌直至芽長出，取芽置于含有25mg/L草錠麟的生根培養(yǎng)基中誘導生根；
[0040] (9)待生根后，移栽壯苗；
[0041 ] (10)對轉基因的煙草小苗提DNA進行PCR驗證。
[0042] 本發(fā)明的有益效果：
[0043] 將紫芽茶樹R2R3-MYB(CsMYB6A)轉入煙草中，煙草葉片變紅，花青素含量顯著提 局。
【附圖說明】
[0044] 圖1為紅葉茶RNA提取驗證示意圖；
[0045] 圖2為CSMYB6A基因菌落陽性克隆驗證圖；
[0046] 圖3為煙草轉基因前后對照圖；
[0047] 圖4為花青素液相檢測圖。
【具體實施方式】
[0048] 下面根據(jù)附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。
[0049] 茶樹總RNA的提?。?br>[0化0] 茶樹To化1 RNA的提取按照TAKARA RNAiso Reagent試劑盒說明進行提取，方法如 下：（氯仿，異丙醇和75%乙醇用冰上預冷）
[0051 ] (l)100mg-200mg茶葉組織，加等量的PVPP(除多酪，可在后面通過離屯、除去），用液 氮研磨至細粉末(研磨的充分與否直接關系到總含量的高低）；
[0052] (2)將上述粉末用槍頭轉移至2ml離屯、管中（約1/2到1/3體積每管），加入1ml 化uit-mate for RNA purification(如有沉淀，提前在37°C預熱），用槍頭攬拌使粉末與溶 液充分混合，裂解20min左右，待裂解液呈透明狀，12000g，4°C離屯、5min;
[0053] (3)小屯、吸取上清液，平均分至2個新的1.5ml離屯、管中，各400ul(為例）；分別加入 等體積的RNAiso Plus 400ul，蓋緊離屯、管蓋，用力震蕩，待溶液充分乳化后，室溫靜置 5min；
[0054] (4)分別加入1/5總體積量的氯仿，各約160ul，用力震蕩混勻約15秒(震蕩過程中 應扣緊離屯、管蓋，混勻后打開離屯、管蓋再扣緊，防止液體瓣出），室溫靜置5min，12000g 4°C 離屯、15min;
[0055] (5)吸取上清轉移至新的離屯、管中（切忌吸到中間的白色層），加入等體積的異丙 醇，上下顛倒混勻，室溫靜置10min，12000g 4°C離屯、lOmin;
[0化6] (6 )(此步驟重復Ξ次）棄上清，緩慢沿離屯、管壁加入1ml 75 %乙醇，輕彈后， 12000g 4°C離屯、5min，棄上清保留沉淀(在棄乙醇過程中應注意白色沉淀切勿倒出，此過程 應緩慢）；
[0057] (7)棄上清保留沉淀后，小屯、吸取多余的乙醇，真空干燥，加適量RNase-Free水30- 50ul，用RNase-Free槍頭輕輕吹打沉淀，放在-80°C保存；
[005引 （8)用核酸定量儀檢測提取的總RNA的含量和質量，記錄260/280、260/230比值及 含量(ng/ul)，一般純的RNA260/280、260/230趨向1.8-2.0附近，根的總RNA含量要低于地上 部分;用瓊脂糖凝膠電泳檢測，應呈現(xiàn)28s、18s、5s^條帶巧S最好可見），28s的亮度是18s亮 度的