入酵母后經(jīng) 驗證片段無自主激活活性及毒性后，再進行下一步的雙雜交實驗。利用經(jīng)高溫強光處理地 后的總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄得到單鏈cDNA，然后擴增得到雙鏈cDNA。雙鏈cDNA經(jīng)純化后，建立 花生高溫強光的蛋白質(zhì)文庫。我們從運個蛋白質(zhì)庫中篩選與誘巧蛋白互作的因子。即將 pG服T7-CaM質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母菌種YsHGold，然后再與花生高溫強光蛋白質(zhì)文庫融合篩選26h。 隨后在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/A/X-Gal板上篩選陽性克隆，對于長出的菌斑首先利用X- a-Gal驗證（圖3A)，然后提取變藍的酵母菌的質(zhì)粒，W質(zhì)粒為模板擴增片段。挑選巧OObp的 片段轉(zhuǎn)化DH5a(圖3B)。經(jīng)菌液PCR篩選出只含有一種片段的菌斑，然后測序。下表中為用花 生葉片中巧調(diào)素做誘巧蛋白篩選酵母雙雜交文庫部分克隆測序結果。
[0124]
[01巧]實施例2: AhSAMS和AhOiM的相互作用驗證
[0126] 1、酵母雙雜交系統(tǒng)驗證
[0127] 根據(jù)篩選測序得到的序列，設計引物3 (5 ' -TCTAGAATGGCAGCAGAGACTTTCC-3 '）和引 物4(5'-6641'(：(：1'了466(：(：1'1'(：1'(：此4(：1'1'-3'）經(jīng)過？〔巧廣增得到4}15415基因全長。分別構建 pG服T7-AhSAMS和pGADT7-AhCaM W及空載體做對照，同時將AhSAMS和AhCaM共轉(zhuǎn)化入酵母菌 株Y2HG0 Id，轉(zhuǎn)化方法見實施例1中步驟3和4。吸取化L菌液分別點到SD-Leu/-Trp、SD-Ade/- His/-Leu/-Trp/X/A固體篩選培養(yǎng)基上，觀察生長情況并作圖。
[0128] 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母細胞YsHGold，在相應的篩選培養(yǎng)基中觀察細胞生長情況。如 圖4所示，與對照菌株相比，我們發(fā)現(xiàn)pGADT7-AhQiM和pG服T7(BD)空載體的菌株可W在SD/- 化p/-Leu培養(yǎng)基中存活；同時，發(fā)現(xiàn)pG服T7-AhSAMS和PGADT7 (AD)空載體的菌株也可W在 SD/-Trp/-Leu培養(yǎng)基中存活，但無法在四缺培養(yǎng)基上正常生長。只有同時轉(zhuǎn)入PGADT7- AhCaM和pG服T7-AhSAMS時，在四缺培養(yǎng)基上才可W生長并且可W誘導α半乳糖巧酶表達，使 菌體變藍(見圖4);相說明CaM和SAMS兩種蛋白是可W相互作用的。
[0129] 2、巧光素酶方法驗證巧調(diào)素與S-腺巧甲硫氨酸合成酶(SAMS)互作
[0130] (1)將SAMS和CaM基因分別與nLUC和cLUC載體連接，轉(zhuǎn)化GV3101農(nóng)桿菌。
[0131] (2)挑單克隆于5ml含有相應抗生素(卡納和利福平)的LB中；同時搖攜帶病毒PTGS 抑制子P19(用于消除煙草對外源基因的抑制）的農(nóng)桿菌，28度過夜。
[0132] (3)次日菌液Wl:100的比例轉(zhuǎn)接10ml的LB(含相應抗生素 ，lOmM MES P冊.7和40μ Μ乙酷下香酬），28度過夜培養(yǎng)。
[0133] (4)培養(yǎng)16小時W后，3200巧m離屯、lOmin，收集菌體。
[0134] (5)用lOmM MgCb重懸菌體(小于10ml)，使0D為1.5;另外，P19農(nóng)桿菌懸浮液的濃 度調(diào)整為0D600為1.0。在重懸液中加入乙酷下香酬至濃度為200μΜ。重懸液室溫靜置3小時。
[0135] (6)樣品中，目的載體的懸浮液和Ρ19的懸浮液按體積比1:1混合；多樣品同理（例 如兩個載體共同注射時，按照A: Β: ρ19 = 1:1:1體積混合）。
[0136] (7)選擇煙草植株上部生長狀態(tài)良好的葉片，在背面(避開主脈和邊緣的）中間位 置用1ml的注射器將懸浮液注射到葉片中（去掉針頭，壓進去就行）。
[0137] (8)3天后，在注射菌液的葉片上涂布LUC底物，于分子影像儀中觀察巧光。
[0138] 分子影像儀中觀察巧光結果見圖5,可W看出只有當同時轉(zhuǎn)入CaM和SAMS時才能觀 察到巧光。進一步驗證了運兩個蛋白的互作。
[0139] 3、S-腺巧甲硫氨酸合成酶(SAMS)蛋白的序列分析
[0140] S-腺巧甲硫氨酸合成酶(SAMS)的核巧酸序列見序列表中序列1，蛋白質(zhì)序列見序 列表中序列2。
[0141] 4、AhSAMS基因在花生植株中的表達分析
[0142] 1、不同脅迫處理下AhSAMS基因在花生葉片中的表達
[0143] 為了探討AhSAMS是否響應逆境脅迫，我們用干旱（不誘水）、高鹽（250mM化C1)、 ΑΒΑ(100μΜ)、高溫強光(40°C1200mmol nf2s^PFD)對野生型花生進行了不同時間的處理，進 行實時定量PCR實驗，分析AhSAMS在不同逆境脅迫下的表達情況。結果顯示，AhSAMS在運些 脅迫條件下都受到誘導表達。在干旱脅迫下，該基因的轉(zhuǎn)錄物在處理5天后積累最多；鹽脅 迫后，AhSAMS的表達在處理1天后達到峰值，之后表達減少但仍高于未處理時的表達量;ΑΒΑ 處理后，AhSAMS的mRNA水平逐漸增加，在處理48小時后達到最高水平;高溫強光脅迫下，該 基因的轉(zhuǎn)錄物在處理2小時后積累最多（圖6)。運些結果說明AhSAMS參與多種非生物脅迫響 應。
[0144] 2、施加不同濃度巧后AhSAMS基因在花生葉片中的表達
[0145] 不同濃度巧處理后，在正常生長條件下，AhSAMS表達量變化不明顯，經(jīng)過高溫強光 處理4h后，施巧植株（6mmol/L)中AhSAMS的轉(zhuǎn)錄物迅速積累，表達量明顯高于未加巧 (Ommol/L)的植株。表明外源施巧可W提高花生葉片中SAMS基因的表達(圖7)。
[0146] 五、游離多聚胺含量的測定
[0147] 用BamHI和Sail從PMD18-T Simple載體切下該片段，插入到表達載體PBI121的35S 啟動子的下游。將構建好的表達載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404。轉(zhuǎn)化煙草，從轉(zhuǎn)基因煙草中篩選 出表達量較高的株系S-2和S-6進行總游離多聚胺含量的測定。實驗結果如圖8所示，結果表 明，高溫強光脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株中多聚胺含量顯著高于野生型植株;同時選取轉(zhuǎn)基因植株 S-2進行外源施巧一周后，發(fā)現(xiàn)游離多聚胺的生物合成在一定程度上有增加。表明AhSAMS基 因過量表達后多聚胺的生物合成在一定程度上有增加，并且巧可W增加其生物合成含量， 結果表明外源施巧可W促進SAMS基因的表達，有利于提高植物的抗逆性。
[0148] 上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受實施例的限 審IJ，其它任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所做的改變、修飾、組合、替代、簡化均應為 等效替換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權項】
1. 花生s-腺苷甲硫氨酸合成酶基因 AhSAMS，其堿基序列如序列表中序列1所示。2. 含有權利要求1中花生S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因 AhSAMS的質(zhì)?；蜉d體。3. 權利要求1所述的花生S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因 AhSAMS編碼合成的花生S-腺苷甲 硫氨酸合成酶，其蛋白質(zhì)序列如序列表中序列2所示。4. 一種權利要求1所述的花生S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因 AhSAMS或權利要求3所述的 花生S-腺苷甲硫氨酸合成酶在與鈣調(diào)素蛋白互作中的應用。5. -種權利要求1所述的花生S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因 AhSAMS或權利要求3所述的 花生S-腺苷甲硫氨酸合成酶在花生抗干旱、抗高鹽、抗ΑΒΑ和抗高溫強光脅迫中的應用。6. 根據(jù)權利要求5所述的應用，其特征在于：在干旱脅迫下，花生S-腺苷甲硫氨酸合成 酶基因 AhSAMS的轉(zhuǎn)錄物在處理5天后積累達到最大值。7. 根據(jù)權利要求5所述的應用，其特征在于:在鹽脅迫后，花生S-腺苷甲硫氨酸合成酶 基因 AhSAMS的表達在處理1天后達到峰值。8. 根據(jù)權利要求5所述的應用，其特征在于:在ΑΒΑ處理后，花生S-腺苷甲硫氨酸合成酶 基因 AhSAMS的mRNA水平在處理48小時后達到最高水平。9. 根據(jù)權利要求5所述的應用，其特征在于:在高溫強光脅迫下，花生S-腺苷甲硫氨酸 合成酶基因 AhSAMS的轉(zhuǎn)錄物在處理2小時后積累達到最大值。10. 根據(jù)權利要求5所述的應用，其特征在于外源施鈣促進花生S-腺苷甲硫氨酸合成酶 基因 AhSAMS的表達，提高植物的抗逆性。
【專利摘要】本發(fā)明提供了花生S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因<i>AhSAMS</i>及其蛋白與應用，基因序列見序列表中序列1。本發(fā)明通過篩選蛋白質(zhì)文庫篩選到與鈣調(diào)素蛋白CaM互作的花生S-腺苷甲硫氨酸合成酶，并獲得其基因序列和蛋白質(zhì)序列，本發(fā)明還通過進一步的實驗來確定所述花生S-腺苷甲硫氨酸合成酶的功能，通過干旱、高鹽、ABA、高溫強光脅迫處理，獲得了S-腺苷甲硫氨酸合成酶在上述逆境脅迫中的不同表達情況，為后續(xù)對S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的進一步利用提供了事實根據(jù)，便于進一步利用Ca2+和所述基因<i>AhSAMS</i>來提高花生對逆境的調(diào)控能力。
【IPC分類】C12N9/10, A01H5/00, C12N15/54
【公開號】CN105671062
【申請?zhí)枴緾N201610236380
【發(fā)明人】楊莎, 李新國, 萬書波, 郭峰, 張佳蕾, 耿耘, 孟靜靜, 黃超
【申請人】山東省農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究中心
【公開日】2016年6月15日
【申請日】2016年4月15日